无菌检验标准操作规程(SOP)

目的：制定无菌检验标准操作规程，确保检验操作正确。

范围：本标准适用于本公司大容量注射剂无菌检验操作。

责任者：质管部、化验室主任、QC佥验员

内容：

1、标准依据：《中国药典》2015年版二部附录XI H。

2、简述：无菌检查方法系用于检查药品是否无菌的一种方法。检查项目包括需气菌、厌气菌及真菌检查。若供试品符合该项检查方法的有关规定，仅表明了在该检验条件下未发现微生物污染。

3、环境要求：该项检查应在环境洁净度万级（C级）背景下的局部百级（A级）的单向流区域内或隔离系统中进行。其全过程必须严格遵守无菌操作。防止微生物污染，但所采取的措施不得影响供试品中微生物的检出。操作前环境洁净度应经验证。日常检验需对试验环境进行监控。

5、方法验证：进行该项检查前应按照《无菌检查方法验证规程》确认该方法的适用性。

4、人员要求：无菌检查人员必须具备微生物专业知识，并经过无菌技术培训。

6检验数量及检验量：

6.1、接种每种培养基所需的最少检验数量：2%或10个（取较少者），供试品无菌检查若

采用薄膜过滤法，应增加1/2的最小检验数量作阳性对照用；若采用直接过滤法，应增加供试品无菌检查时每个培养基容器接种的样品量作阳性对照用。

6.2、每支供试品接入每种培养基的最少量：半量（100ml w V< 200ml），采用薄膜过滤法时，检验量应不少于直接接种的供试品总接种量，只要供试品特性允许，应将所有容器内的全部内容物过滤。

7、细菌培养温度为30〜35C,真菌培养温度为23〜28C。

8、仪器用具：垂直层流超净工作台、生化培养箱、电热恒温水浴箱、显微镜、离心机、双碟、试管、三角瓶、刻度离心管、注射器（针头）、剪刀、镊子、注射器盒、75%酒精棉球、紫外光灯365nm真空泵、一次性使用集菌培养器。

9、消毒剂配制：

9.1、75%乙醇溶液（配制酒精棉球用）。

9.2、0.2 %新洁尔灭溶液（配制消毒棉球用）。

9.3、2%来苏尔溶液（配制消毒棉球用）。

10、试剂及培

10.1、0.1 %蛋白胨水溶液：取蛋白胨1.0g，加水1000ml,微温使溶解，滤清，调节PH 值至7.1 ±0.2 ，分装，灭菌。

10.2、pH7.0灭菌氯化钠—蛋白胨缓冲液：取磷酸二氢钾3.56g、磷酸氢二钠7.23g、氯化钠4.30g、蛋白胨1.0g，加水1000ml微温溶解，滤清，分装，灭菌。

10.3、根据供试品特性，可选用其他经验证的适宜溶液作为稀释液、冲洗液。如需要，可在上述稀释液或冲洗液的灭菌前或灭菌后加入表面活性剂或中和剂。

10.4 、硫乙醇酸盐流体培养基：按商品说明称取培养基，配制，摇匀，分装，按培养基说明高压灭菌，保存备用。分装的容器应适当，其装量与容器高度比例应符合培养结束后培养基氧化层（粉红色）不超过培养基深度的 1 /2 。供试品接种前，培养基氧化层的高度不得超过培养基深度的1/5,否则须经100C水浴加热至粉红色消失（不超过20分钟），迅速冷却只限加热一次，并应防止被污染。

10.5、改良马丁培养基：取商品干燥培养基28.5g，加水1000ml,加热溶解，分装，121C 高压灭菌15分钟（若干燥培养基结块应勿使用）。

10.6、选择性培养基：按上述硫乙醇酸盐流体培养基或改良马丁培养基的处方及制法，在培

养基灭菌或使用前

加入适量的中和剂、灭活剂或表面活性剂，其用量同方法验证试验

10.7、营养肉汤培养基：按商品说明称取培养基，配制，加热，溶解，分装，按培养基说明高压灭菌，保存备用。

10.8、营养琼脂培养基：取商品干燥培养基3.4g，加蒸馏水1000ml，加热溶解分装，121C 高压灭菌15 分钟。

10.9 、改良马丁琼脂培养基：取商品干燥培养基制备或按改良马丁培养基的处方及制法，加入14.0g琼脂，调节PH值使灭菌后PH值为6.4 ±0.2，分装，121 C高压灭菌15分钟。

10.10、制备好的培养基应保存在2〜25C,避光的环境中。培养基若保存于非密闭容器中，一般在三周内使用。若保存于密闭容器中，一般可在一年内使用。

11 、试验前的准备工作

11.1 、用具的洗刷

11.1.1 、玻璃器皿：如试管、量筒、移液管、刻度吸管、离心管、三角瓶、双碟等用清洁液浸泡，用流水洗涤，再用蒸馏水洗涤4〜5次，倒置，晾干。试管、移液管、三角瓶等使用过后，应先消毒倒出内容物后，再清洗晾干。

11.1.2 、注射器用水冲洗后，用洗涤剂冲洗，然后用水冲洗干净，再用蒸馏水冲洗3 次。

11.1.3 、剪刀、镊子用水及去污粉洗涤，用水冲洗干净，再用蒸馏水洗涤3 次。

11.1.4 、多用薄膜过滤器，玻璃管等用饮用水及蒸馏水洗净、晾干。

11.1.5 、洁净服、裤、帽子、口罩等用水洗涤洁净后，晾干。

11.2 、用具的包扎及灭菌

11.2.1 、移液管、刻度吸管在管口上端内，松松塞入少许脱脂药物，然后每支管用白纸严密卷好，再用两层牛皮纸一起包扎。

11.2.2 、洗涤洁净的注射器及适配针头各部件与剪刀、镊子一并入垫有纱布的铝盒内，一层层放好，盖上纱布，将铝盒盖好，用牛皮纸包扎。

11.2.3 、试管、三角瓶等在管（瓶）口塞上纱布棉纱用牛皮纸包装严密。

11.2.6 、将洁净服、等用布口袋配套装入，扎紧口袋，用牛皮纸包扎好。

11.2.7、将以上包扎好的用具在121 C蒸汽灭菌20分钟。或采取适宜的灭菌方法。（适

宜高温灭菌的器皿可采用160°C干热灭菌)

11.2.8 、物品灭菌完毕，勿立即置冷处，以免急速冷却导致染菌，应置恒温培养箱中干燥。

11.3 、洁净室的清洁与灭菌

11.3.1 、洁净室及超净台，每周用高锰酸钾加甲醛薰蒸灭菌。

11.3.2 、在每次操作前，应作好清洁工作，并用0.2%新洁尔灭溶液或2%来苏尔或75％

乙醇擦洗超净台工作台面及可能污染的死角，然后开启紫外线灯杀菌半小时，超净台空气过滤器自净半小时。操作完毕后，用上述消毒液，再次处理工作台面，开紫外光灯杀菌30分钟以上。

12 、操作

12.1 、开启传递窗外侧门，将物品表面消毒后置传递窗内，关闭窗门。

12.2 、操作人员按《进入洁净室更衣程序》洗手、更衣换工作鞋，换无菌衣、裤、口罩。

进入洁净室内，开启内侧门，取出物品，关闭内侧门，经缓冲间带入洁净室内，物品放置于实验台上，关闭洁净室门，人员离开洁净室，继续用紫外灯照射半小时，关灯，再将用具放入超净台内。

12.3 、培养基适用性检查：无菌检查用硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基等应符合的无菌性检查及灵敏度检查的要求。本检查可在供试品检查前或与供试品检查同时进行。

12.3.1 、无菌效果检查：每批培养基随机取不少于5 支(瓶)培养14 天，应无菌生长。

12.3.2 、灵敏度检查：

12.3.2.1 、菌种及菌液制备：

12.3.2.1.1 、检查用菌种包括：

金黄色葡萄球菌( Staphylococcus aureus ) [CMCC(B)26 003] 铜绿假单胞菌( Pstudomonas aeruginosa ) [CMCC(B)10 104] 枯草芽孢杆菌( Bacillus subtilis ) [CMCC(B)63 501] 生孢梭菌( Clostridium sporgenes ) [CMCC(B)64 941] 白色念珠菌( Candida albicaus ) [CMCC(F)98 001] 黑曲菌( Aspergillus niger ) [CMCC(F)98 003]

12.3.2.1.2 、菌液制备方法：铜绿假单胞菌菌悬液的制备方法同金黄色葡萄球菌菌悬液制备方法。

12.3.2.2 、培养基接种：取每管装量为12ml 的硫乙醇酸盐流体培养基9 支，分别接种小

于100CFU勺金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽抱杆菌、生抱梭菌各2支，另一支不接种，作为空白对照，培养3天；每管装量为9ml 的改良马丁培养基5支分别接种小于100CFU 的白色念珠菌、黑曲菌各 2 支，另一支不接种作为空白对照，培养 5 天。逐日观察结果。

12.3.2.3 、结果判断：空白对照管应无菌生长，若加菌的培养基管均生长良好，判断该培养基灵敏度符合规定。

12.4、配制的培养基应在凉暗处保存，一般不得超过2周。临用前细菌和霉菌培养基分别经30〜35C和20〜25C培养不少于48小时和72小时，证明无菌生长时方可使用。

12.5 、阳性对照试验：

12.5.1 、应根据供试品特性选择阳性对照菌，无抑菌作用及抗革兰阳性菌为主的供试品，以金黄色葡萄球菌为对照菌；抗革兰阴性菌为主的供试品以大肠埃希菌为对照菌；抗厌氧菌

的供试品以生孢梭菌为对照品；抗真菌的供试品以白色念珠菌为对照品。

12.5.2 、阳性对照试验的菌液制备同方法验证试验。

12.5.3、取各阳性对照菌悬液（含菌量小于100CFU及供试品（用量同供试品无菌检查每份