无菌检查标准操作规程

无菌检查标准操作规程无菌检查法是检查要求无菌的药品、医疗器具、原料、辅料及要求无菌的其他物品是否染有活菌的一种方法。

事实上，若供试品符合无菌检查法的规定，仅表明了供试品在该检验条件下未发现细菌和真菌污染。

无菌检查法有薄膜过滤法、直接接种法两种方式。

细菌培养温度32.5℃±2.5℃，真菌培养温度25.5℃±2.5℃。

1 无菌检查的环境无菌检查的所有操作均需在严格控制微生物污染的环境下进行，操作环境的无菌保证程度将直接影响无菌检查用洁净室（区）环境的稳定性，确保检查结果的可考性，对洁净室（区）的环境质量采取合理的控制措施和评价方法是必要的。

无菌检查应在环境洁净度10000级和局部洁净度100级的单向留空气区域内或隔离系统中进行，其全过程笔削严格遵守无菌操作，防止微生物污染。

单向流空气区、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。

隔离系统按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。

无菌室应采光良好、避免潮湿、远离厕所及污染区。

面积一般不超过10m2，不小于5m2；高度不超过2.4m。

由1～2个缓冲间、操作间组成（操作间和缓冲间的门不应直对），操作间与缓冲间之间应具备灭菌功能的样品传递箱。

在缓冲间内应有洗手盆、毛巾、无菌衣裤放置架及挂钩、拖鞋等，不应放置培养箱和其他杂物；无菌室内应六面光滑平整，能耐受清洗消毒。

墙壁与地面、天花板连接处应呈凹弧形，无缝隙，不留死角。

操作间内不应安装下水道。

无菌操作室应具有空气除菌过滤的单向流空气装置，操作区洁净度100级或放置同等级别的超净工作台，室内温度控制18～26℃，相对湿度45%～65%。

缓冲间及操作室内均应设置能达到空气消毒效果的紫外灯或其他适宜的消毒装置，空气洁净级别不同的相邻房间之间的静压差应大于5Pa，洁净室（区）与室外大气的静压差大于10Pa。

无菌室内的照明灯应嵌装在天花板内，室内光照应分布均匀，光照度不低于300lx。

缓冲间和操作间所设置的紫外线杀菌灯（2～2.5W/m3），应定期检查辐射强度，要求在操作面上达40μW?cm-2。

不符合要求的紫外杀菌灯应及时更换。

无菌室应每周和每次操作前用0.1%新洁尔灭或2%甲酚液或其他适宜消毒液擦拭操作台及可能污染的死角，开启无菌空气过滤器及紫外灯杀菌1小时。

在每次操作完毕，同样用上述消毒溶液擦拭工作台面，除去室内湿气，用紫外灯杀菌半小时。

无菌室的洁净度检查无菌室在消毒处理后，无菌试验前及操作过程中需检查空气中菌落数，以此来判断无菌室是否达到规定的洁净度，常有沉降菌和浮游菌测定方法。

沉降菌检测方法及标准：以无菌方式将3个营养琼脂平板带入无菌操作室，在操作区台面左、中、右各放1个；打开碟盖扣置，平板在空气中暴露30分钟后将碟盖盖好，置32.5℃±2.5℃培养48小时，取出检查，3个平板上生长的菌落数平均不超过1个。

浮游菌检测方法及标准：用专门的采样器，宜采用撞击法机理的采样器，一般采用狭缝式或离心式采样器，并配有流量计和定时器，严格按仪器说明书的要求操作并定期校验，采用器和培养皿进入被测定房间前先用消毒房间的消毒剂灭菌，使用的培养基为营养琼脂培养基或药典认可的其他培养基。

使用时，先开动真空泵抽气，时间不少于5分钟，调节流量、转盘、转速。

关闭真空泵，放入培养皿，盖上采样器盖子后调节缝隙高度。

置采样口于采样点后，依次开启采样器、真空泵，转动定时器，根据采样量设定采样时间。

全部采样结素后，将培养皿置32.5℃±2.5℃培养48小时，取出检查，浮游菌落数平均不得过5个/m3。

每批培养基应选定3只培养皿做对照培养。

无菌操作台面或超净工作台还应定期请有关部门检测其悬浮粒子，应达到100级（一般用尘埃粒子计数仪）检测尘埃粒径≥0.5的粒数不得超过3.5个/升，≥5μm的粒数为0，空气流速应≥0.35m/s，可根据无菌状况必要时置换过滤器。

2 仪器及用具2.1 无菌室内应准备好盛有消毒用5%甲酚或其他适宜消毒溶液的玻璃缸、乙醇灯、火柴、镊子、75%乙醇棉、碘状棉等。

2.2 恒温培养箱及生化培养箱。

2.3 离心机、生物显微镜、真空架、高压蒸汽灭菌器、标准pH比色器（0.02%酚磺酞指示液和溴麝香草酚蓝指示液）、恒温烤箱、开放或全封闭过滤系统。

2.4 玻璃器皿试管、量筒、三角瓶、移液管、刻度吸管（1、5、10ml）、注射器（2、5、10ml）、双碟等，用玻璃洗涤剂或清洁液浸泡，水洗3次。

如使用过程中与细菌接触（已污染），应先灭菌倒出内容物后再清洗，晾干。

凡无菌操作过程中所用的器皿，都应用牛皮纸包扎严密，灭菌。

移液管、刻度吸管在管内上端，塞少许原棉，以手感不松不紧为宜，然后放于吸管筒内或牛皮纸袋内，封严，灭菌待用；试管、离心管、三角瓶等在管（瓶）口塞上海棉胶（或硅胶）专用塞或纱布棉塞，塞子应塞进管口内2/3处，用牛皮纸将管口（包括塞子）包扎严，灭菌待用；将注射器、针头（9号、11号、12号）配对，检查针头是否畅通后，将注射芯、管和针头分别放在双层纱布（或布）内，包扎严密，置带盖容器（瓷盘或铝制饭盒）内，盖严，用牛皮纸包扎后，灭菌待用。

长柄取样匙，放于不锈钢长筒内，盖严，干热灭菌待用。

手术镊、手术剪洗净、擦干。

用双层纱布将1把剪刀与1把别字间隔包扎在一起，放于带盖的容器（瓷盒或铝制饭盒）内，盖严，用牛皮纸包扎，灭菌（参照附录XV 灭菌法）待用。

高压蒸汽灭菌的物品取出时切勿立即置冷却，使灭菌物品内蒸汽冷凝造成负压，易染菌，取出后应置恒温培养箱（或干燥箱）中烘干，待用。

2.5 无菌衣、裤、帽、口罩等洗净晾干，配套，用牛皮纸包严，灭菌待用或用一次性的无菌物品代替。

2.6 除菌滤器及滤膜有多种开放式及封闭式滤器用于过滤除菌。

微孔滤膜直径50mm、孔径约0.45μm。

新购入封闭式滤器或滤膜，需进行孔径大小的测试，一般有三种方法，选其中一种方法即可。

气泡法先将滤膜浸入说中，使完全湿润，然后用镊子夹住一片滤膜放于气泡点测定装置过滤膜孔径测定仪上，膜上放一块与滤膜大小相同的尼龙筛网，再加上多孔板，将螺旋补丁圈旋紧，在多孔板上加3～5mm深的水（注意排除气泡）关闭放气阀，启动空压机或氮气瓶阀，使压力缓缓上升，注意观察水面上产生第一个气泡时，记录压力表的压力，气泡点压力不应小于2.2kg/cm2（0.2MPa）。

水流量法将滤膜装于除菌滤器上，开动真空泵，压力在700mmHg（93kPa）下，抽滤已滤清的水约500ml，计算出每1min的滤速。

2005年版中国药典对滤膜的滤速未明确规定，而USP（XXⅢ）规定在700mmHg（93kPa）压力下，滤膜直径47mm；流速55～75ml/min。

细菌过滤法常用的细菌为粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens CMCC（B）41002），将该菌的新鲜营养琼脂斜面培养物，接种于营养肉汤培养基中，32.5±2.5℃，培养18～20小时，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至10-3（约相当于7×105cfu/ml），取此菌液1ml加至50ml 0.9%无菌氯化钠溶液中，按薄膜过滤法过滤，取该滤液5ml接种于营养肉汤培养基40ml中，32.5℃±2.5℃培养24小时，应无菌生长。

不符合规定的滤膜不得使用。

3 菌种及菌液制备菌种的传代次数不得超过5代（从菌种保藏中心获得的冷冻干燥的菌种为第0代；冷冻干燥的原始菌种开启后转种，为第一代）。

原始菌种购到后，应由专人负责，接收菌种时应检查安瓿的数量和菌种的名称及每一支安瓿的完整性。

并在相应的菌种接收登记表上记录所有关于菌种的信息。

将安瓿存于－20℃，使用时首先需要复活冻干菌种（按菌种保藏中心提供相关资料操作），一般包括以下步骤：冷冻菌种的复活清洁安瓿（可用75%的酒精或碘状）后，用砂轮在安瓿上部三分之一处划痕，用干燥的无菌纱布包裹安瓿，将安瓿掰开，用一无菌吸管吸取适量0.5～0.8ml的液体培养基（生孢梭菌用液体硫乙醇酸盐培养基；金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌和枯草芽孢杆菌用营养肉汤；白色念珠菌、黑曲霉菌用液体真菌培养基）滴加到安瓿中，轻轻旋转安瓿并吹打，使冻干菌种和液体培养基充分混和并完全溶解，再将安瓿内的菌悬液全部吸出，转移至相应的培养基试管中，根据菌种类型采用适宜的培养条件（细菌培养温度32.5℃±2.5℃，18～24小时；真菌培养温度25.5℃±2.5℃，3～5天）下培养，观察培养基是否浑浊，（如不浑浊，细菌应延长培养时间至7天以上，真菌应延长培养时间至14天以上，仍未浑浊，按相关规定灭菌处理。

）浑浊说明菌种复活生长，在应用前，还应确认菌种的纯度和特性。

菌种确认用无菌接种环取上述培养物，在相应的培养基平板上划线分离单个菌落，适宜条件下培养，培养后观察是否具有典型的菌落形态，然后挑取单一的纯菌落，进行革兰染色、镜检，观察其染色特性及菌形。

并作生化实验或使用菌种鉴定系统进一步鉴定该菌种，对已通过确认鉴定后的菌种可以使用或传代保藏。

菌种传代保藏方法很多，各单位了根据情况采用，但无论应用何种方法，都应对采用的方法进行验证，确保在相应保存条件下的菌种不会变异且性能稳定，同时也应兼顾到方法的经济和简便。

常用的有甘油冷冻管保藏法、斜面低温保藏法等，此类方法简单易行。

甘油冷冻管保藏法将待保藏菌接种平板或琼脂斜面，适宜温度下培养适宜时间后（细菌24～48小时的培养物，白色念珠菌72小时的培养物），用无菌接种环轻轻刮取菌苔，并通过接踵环与试管壁之间的轻轻摩擦使细菌充分扩散到预先装于试管中的无菌蒸馏水中，调整菌液浓度，向已制备好的菌悬液中加入等体积、浓度为20%的无菌甘油，轻轻振摇小管，使内容物充分混和，分装于无菌小管，制好的甘油冷冻管最好在－30℃贮存。

斜面低温保藏法将工作用菌种的典型菌落接种在适宜的固体斜面培养基，按规定的温度和时间培养，待菌生长充分以后，把培养好的新鲜菌种管用牛皮纸包好，转移至4℃左右冰箱保存，如菌种保藏管的塞子是橡胶塞，并采用半固体高层培养基穿刺培养，则可以保存时间较长。

铜绿假单胞菌不宜用本法保存。

3.1 菌种（1）金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC(B)26003]（2）枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)[CMCC(B)63501]（3）大肠埃希菌(Escherichia coli)[CMCC(B)44102]（4）铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)[CMCC(B)10104]（5）生孢梭菌(Clostridium sporogenes)[CMCC(B)64941]（6）白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F)98001]（7）黑曲霉(Aspergillus niger)[CMCC(F)98003]3.2 菌液制备制备的菌液，一般当日使用。