体外放射性分析
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体外分析技术
Ag
25
50
100
200
400
800
*Ag
Ab
分离B、F
B1%
B2%
B3%
B4%
B5%
B6%
1
2
3
4
5
6
B%
？
B%
F%
B/F
Calibration Curve
优缺点比较
1、放射免疫分析技术
放射免疫技术是利用放射性核素可探测的灵敏性、精确性与抗原抗体反应的特异性相结合的一类免疫测定技术。 放射免疫分析（radioimmunoassay，RIA）——以标记抗原与反应系统中未标记抗原竞争结合特异性抗体来测定待检样品中抗原量。 免疫放射分析（immunoradiometric assay，IRMA）——以过量标记抗体与抗原非竞争结合，采用固相免疫吸附载体分离游离和结合标记抗体。
不同的肿瘤标记物可能出现在相同的粘蛋白上 在肿瘤细胞株中CA199,CA50和CA242共同表达于 MUC-1和诞腺蛋白中。（Baeckstrom et al, 1992）
肿瘤的发展及诊断期
肿瘤标志物在全球的应用情况
肿瘤标志物的分类（化学特性）
癌胚抗原类标志物 糖类抗原标记物 酶类标志物 激素类标志物 癌基因 其他
肿瘤与肿瘤标记物
相同的肿瘤可能检测出多种不同的肿瘤标记物 相同的肿瘤标记物可能出现在不同的粘蛋白上 CA19-9和CA50已经在不同的粘蛋白核心上得到鉴定: MUC-1,MUC-3。（Baeckstrom et al, 1992和1995） 涎腺蛋白。（Baeckstrom et al,1995） 颌下腺粘蛋白 支气管肺泡粘蛋白
1、放射免疫分析技术
优点：超微量分析技术，具有很高的精密度、灵敏度和准确度 缺点：反应条件要求一般，但该技术所用试剂具有放射性，对人体有一定的危害，实验人员应加强防护。同时试剂存在半衰期，试剂必须在半衰期内用完，否则试剂会作废，这需要科学地做好试剂计划。另外反应过程中抗原的含量低到一定程度时会出现不确定因素，使灵敏度受到限制。
核医学体外放射分析技术课件
有效地排除非特异性物质对结合反应的干 扰。
二、结合反应动力学规律
• 遵守质量作用定律 • [L]+[B] 适当的实验条件 [LB]
衍生设计出两种方法学
• 1、竞争结合（competitive binding) • 过量的配体与有限量的结合剂发生竞争性
结合反应。 • 2、非竞争结合（non-competitive binding) • 过量的结合剂与有限量的配体，在非竞争
的条件下发生结合反应。
衍生设计出两种方法学
• 1、竞争结合（主要应用：放射免疫分析）
• [L]+ [L*]+[B] [LB] +[L*B]
• 2、非竞争结合
•结合在试管 或包被珠上
• Sp.Ab1+Ag Sp.Ab1.Ag
• Sp.Ab1.Ag +Ab2* Sp.Ab1.Ag.Ab2*+Ab2*
优点
• 慢性淋巴细胞性甲状腺炎： • 早期：T3,T4升高，然后降低，
TSH,TGAB,TPOAB升高。 • 甲状腺肿瘤：TG升高。 • 全身性疾病：心血管疾病、肿瘤等： • T3下降，rT3、TSH升高。
（二）肾上腺疾病
• 皮质醇增多症： • ACTH\COR正常情况下有节律分泌，检测
可以与单纯性肥胖区分。 • 原发性醛固酮增多症：尿游离皮质醇
• 反应误差关系 • 精密度图
• 2、准确度：测的值与其标称值之间的 相符程度。
• 3、灵敏度（sensitivity): • 4、特异性(specificity) • 5、稳定性(stability)
（三）质量评价
• 内部质量控制 • 外部质量控制
三、以配体与受体间结合反应 为基础的分析系统
二、结合反应动力学规律
• 遵守质量作用定律 • [L]+[B] 适当的实验条件 [LB]
衍生设计出两种方法学
• 1、竞争结合（competitive binding) • 过量的配体与有限量的结合剂发生竞争性
结合反应。 • 2、非竞争结合（non-competitive binding) • 过量的结合剂与有限量的配体，在非竞争
的条件下发生结合反应。
衍生设计出两种方法学
• 1、竞争结合（主要应用：放射免疫分析）
• [L]+ [L*]+[B] [LB] +[L*B]
• 2、非竞争结合
•结合在试管 或包被珠上
• Sp.Ab1+Ag Sp.Ab1.Ag
• Sp.Ab1.Ag +Ab2* Sp.Ab1.Ag.Ab2*+Ab2*
优点
• 慢性淋巴细胞性甲状腺炎： • 早期：T3,T4升高，然后降低，
TSH,TGAB,TPOAB升高。 • 甲状腺肿瘤：TG升高。 • 全身性疾病：心血管疾病、肿瘤等： • T3下降，rT3、TSH升高。
（二）肾上腺疾病
• 皮质醇增多症： • ACTH\COR正常情况下有节律分泌，检测
可以与单纯性肥胖区分。 • 原发性醛固酮增多症：尿游离皮质醇
• 反应误差关系 • 精密度图
• 2、准确度：测的值与其标称值之间的 相符程度。
• 3、灵敏度（sensitivity): • 4、特异性(specificity) • 5、稳定性(stability)
（三）质量评价
• 内部质量控制 • 外部质量控制
三、以配体与受体间结合反应 为基础的分析系统
第8章 体外放射分析技术新版
抗体包被分离法
特点：试管包被第二抗体 原理：SP－Ab2－Ab1－*Ag
Ab2
优点：固相包被具有简便、快速、稳定、不需离心等， 有逐渐取代液相法的趋势。
固相吸附分离法
吸附分离剂是固相颗粒，它可以从反应液中吸附游离抗原。活性 炭是常用的吸附剂，多用于小分子游离抗原和抗原－抗体复合物的分 离。具体应用时在活怀炭颗粒的表面涂上一层右旋糖酐或蛋白类化合 物，这样在活性炭的表面形成一定大小的孔洞，在反应液中加入这种 特殊颗粒时，小分子的游离抗原就会被活性炭吸附，从而达到分离B 与F的目的。
逐个代入上式，即可求得各样品的含量 X。 优点：操作简单，用计算器也可拟合。
缺点：①由于Log 0无解，拟合时丢掉0剂量点，降低了灵敏度②
如有突出值，整条拟合线会偏离；③在顺序加样法中不是 直线不可用。
2. 四参数Logistic模型 本法从Logit-Log法演化而来，其函数式如下： Y=（a-d）/「1+（X/C）b」+d 式中Y是标记抗原在各实验点的结合率（包括NSB），X 是各点的剂量。a、b、c、d是四个参数。a代表0剂量时
1、系统误差（systematic error）这种误差常表现为检测结果呈 倾向性的偏高或偏低，是一些可以确定的因素导致的。（1）方法 误差，如标准品稀释体积不正确；抗体过浓或过稀，分离效果不 好；不适当的曲线拟合模型等。（2）仪器和试剂误差，如仪器状
态不佳；量器不准；试剂不纯等。（3）操作误差，如不正确的操
作习惯、错加样品等。系统误差是可以通过努力消除的。 2、随机误差（random error）这种误差是由难以确定且无法控
制的原因（偶然因素）引起，误差的出现是随机的，与真值的偏
实验核医学-体外分析技术
实验核医学
Experimental nuclear medicine
体外分析技术
In Vitro Radioassay
主讲人/制作人：
体外分析技术
In Vitro Radioassay
一、体外放射分析技术 二、非放射免疫分析技术 三、临床应用
结束
体外放射分析
一、体外放射分析的概念和分类
二、放射免疫分析（RIA) 1、基本原理 2、必备条件 3、质量控制
放射免疫分析Radioimmunoassay（RIA)
一、基本原理：
放射免疫分析是竞争性体外放射分析原理的代表。 在体外，以放射性核素标记抗原和非标记抗原，同时 与适量的特异性抗体发生的竞争性免疫结合抑制反应。
*Ag + Ab + Ag
*Ag-Ab + *Ag
Ag-Ab十Ag
RIA操作步骤：
1、加样 2、温浴反应 3、分离B/F 4、放射性测量 5、绘制标准曲 线，查找待测物 浓度
b值稳定，r＞0.99。
4．ED25、ED50及ED75 指标准曲线的结合率在25％、50％及75％时对应的抗原浓度值，
它反映标准曲线的稳定性，有助于批间结果的比较。
5．反应误差关系(RER) 是评价RIA整批误差的综合指标，RER应＜0.04。
6．质控图
WHO要求在一次实验中，有下列情 况之一者，其结果应予舍弃：
质量控制包括监测各重要环节的质量、测定误差和结果的 可靠性。
（一）、质量控制
1．最高结合率(B0％) 指不加非标记抗原时标记抗原与抗体的结合率，一般要求在30～50％。
2．非特异性结合率(NSB％) 指不加抗体时标记抗原与非特异性物质的结合率，一般要求＜5～10％。
Experimental nuclear medicine
体外分析技术
In Vitro Radioassay
主讲人/制作人：
体外分析技术
In Vitro Radioassay
一、体外放射分析技术 二、非放射免疫分析技术 三、临床应用
结束
体外放射分析
一、体外放射分析的概念和分类
二、放射免疫分析（RIA) 1、基本原理 2、必备条件 3、质量控制
放射免疫分析Radioimmunoassay（RIA)
一、基本原理：
放射免疫分析是竞争性体外放射分析原理的代表。 在体外，以放射性核素标记抗原和非标记抗原，同时 与适量的特异性抗体发生的竞争性免疫结合抑制反应。
*Ag + Ab + Ag
*Ag-Ab + *Ag
Ag-Ab十Ag
RIA操作步骤：
1、加样 2、温浴反应 3、分离B/F 4、放射性测量 5、绘制标准曲 线，查找待测物 浓度
b值稳定，r＞0.99。
4．ED25、ED50及ED75 指标准曲线的结合率在25％、50％及75％时对应的抗原浓度值，
它反映标准曲线的稳定性，有助于批间结果的比较。
5．反应误差关系(RER) 是评价RIA整批误差的综合指标，RER应＜0.04。
6．质控图
WHO要求在一次实验中，有下列情 况之一者，其结果应予舍弃：
质量控制包括监测各重要环节的质量、测定误差和结果的 可靠性。
（一）、质量控制
1．最高结合率(B0％) 指不加非标记抗原时标记抗原与抗体的结合率，一般要求在30～50％。
2．非特异性结合率(NSB％) 指不加抗体时标记抗原与非特异性物质的结合率，一般要求＜5～10％。
体外放射配体结合分析
实
验
AFP放射免疫（快速法）测定
AFP放射免疫（快速法）测定
实验报告
姓名 学号 期、班级 实验名称 实验原理 实验方法（步骤） 实验结果 讨论*
AFP放射免疫（快速法）测定
加样
100 μl 100 125 μI-AFP l 抗体 AFP 缓 冲 液
100μl AFP 10ng/ml
100μl AFP 25ng/ml
单克隆抗体涂被固相载体，形成固相
抗体，通常为试管底部； 试管内加入标准品或待测样品，形成 固相抗原抗体复合物 加入放射性核素标记的单克隆抗体， 形成固相抗体-抗原-*抗体复合物 剩余的标记单克隆抗体则留于液相中， 通过洗管洗去 测量试管中的放射性计数，经标准曲 线就可查出待测物含量
反应式
*Ag+ Ab + Ag *Ag-Ab+ *Ag
限量
Ag-Ab + Ag
Ag: 待测抗原 *Ag: 标记抗原 Ab: 抗体 Ag-Ab: 抗原抗体复合物 *Ag-Ab: 标记抗原抗体复合物
放射免疫分析技术原理示意
标准曲线
基本试剂
标准抗原
标记抗原
即标准品，与 待测物具有相同 的化学结构、免 疫学活性， 是RIA的示综剂， 125I，纯度高，合适的 比活性，标记后抗原 免疫活性不受破坏 特异性高，滴 度高，亲和力大
固相-Ab1+Ag （待测） 固相-Ab1-Ag +*Ab2
固相-Ab1-Ag -*Ab2+*Ab2
基本特点
标记物为抗体，不影响抗原的免疫活性 使用的是单克隆抗体，特异性明显提高 单克隆抗体为大分子物质，碘化标记抗体比
抗原容易，产物比较稳定
检测灵敏度较RIA高，且检测范围扩大 操作更为简便、快速 抗体用量大，成本较高 仅适用于蛋白质类大分子物质的检测
核医学课件：体外分析技术
标准曲线
目前已普遍采用计算机进行数据处 理，自动绘制标准曲线，自动换算 样品中被测物质的浓度
实验操作基本步骤
1.加样：加样总体积要保持一致，所处的介质环境 也要一致。
2.孵育：根据不同的分析对象孵育的温度和时间 不同，一般是37℃。
3.分离：选择好的分离方法分离游离抗原和 抗原－抗体复合物。 4.测量：测量游离或结合物部分的放射性。 5.数据处理：绘制标准曲线和待测物浓度的计算
* Ag
基本反应式
Ag-Ab
*Ag:标记抗原，Ag 非标记抗原 Ab：抗体 *Ag- Ab 标记抗原抗体复合物 Ag- Ab 非标记抗原抗体复合物
Ag-Ab+Ag
条件：1.*Ag与Ag 免疫活性相同
2. *Ag与Ab 恒量
*Ag-Ab+*Ag
理
*Ag与Ag由于免疫化学性质一致，共同竞争 性与Ab结合，当*Ag和Ab的量保持恒定， *Ag与Ag之和大于Ab时，则*Ag-Ab复合物的 形成受Ag含量的制约，二者之间存在函数关 系 ， 即 Ag 量 越 大 ， *Ag-Ab 量 越 小 ； Ag 量 越 小，*Ag-Ab量越大；测定*Ag-Ab或*Ag量即 可推算出被测Ag量
量B、F的cpm
*Ag
B%=B/(B+F)
Ag 1
2
3
4
5 6？
25 50 100 200 400 800
B%
B% 标准曲线
常 用 的 反 应 参 数 有 B%，B/F，F/B、 F%等这些反应变量都可以用作纵坐标来对 应标准抗原的浓度作标准曲线，选用的反应 变量不同，标准曲线的形状也不同。但是这 些标准曲线都是反映的反应变量对应标准抗 原浓度变化而变化的函数关系。
检验核医学放射免疫分析和免疫放射分析
3 标记Ag 常用125I和3H标记化合物 要求： (1)适当高的放射性比活度 影响方法的灵敏度和 精密度，标记Ag化学量≤被测Ag的最小量 (2)放射化学纯度>95% 影响方法的灵敏度 (3)免疫活性与未标记Ag基本保持一致 (4)稳定性好，在一定条件下，稳定期1-3月
标记Ag与Ab的用量对 测定的影响
实验室内部质量控制方法
1对实验数据进行审核剔除“坏点” 2剂量反应曲线拟合及质量审核 3精密度评价 (1)反应误差关系RER
从多批实验资料求出直线方程式 SDR = a + bR
a反映分离误差 b反映加样误差
(2)精密度图(P-P图) (用剂量反应曲线)
通过RER将SDR转换SDD(CVD%) 作SDD (CVD%) - lgD曲线 CVD%≤10%
[Q0]
1
[Q0]
B2 – B (1 + ——— + ——— ) + ——— = 0 (4)
[P0] K [P0]
[P0]
将B = 1 - F代入(3)
[Q0]
1
1
F2 – F (1 - ——— - ——— ) + ——— = 0 (5)
[P0]
K [P0] K [P0]
定义R = B / F，由B + F = 1得B = R / (1+R)代入(3)
偏差分析 2实验室外部质量控制(1)对某种分析方法的试剂
或试剂盒进行综合评价 (2)对不同实验室的分析工作
质量进行比较
质量控制样品 质控的“标准系统”－质控血清(QC) 要求：1 QC样品与待测样品性质相同
2 QC样品与待测样品中待测物相同，免疫活性一致 3 QC样品中待测物量已知，分高、中、低三档浓度 4足量制备，分装，低温存放，分批使用 制备方法：1按三档浓度收集多余病人血清，测定标示值
《内分泌与代谢系统疾病核医学诊断和治疗》- 体外分析技术
四碘甲腺原氨酸
两个3，5-二碘酪氨酸分子偶联而成的一种碘化的酪氨酸衍生物
5
体外分析技术的特点（2）
3、精密度高 反映出来的是随机误差小（统计及实 验误差）。(批内误差、批间误差)
4、应用广泛 以放射免疫分析法为例目前至少有300 多种生物活性物质的检测建立了该方法。如：激素、 蛋白质、抗体、免疫球蛋白、维生素及一些药物的分 析。体外分析技术已成为现代医学临床诊断、治疗监 测及评估、科学研究的重要手段。
• 逻辑分布(Logistic distribution)公式 P(Y=1│X=x)=exp(x'β)/1+exp(x'β)
12
Log-Logist作图法
13
分析曲线
a 以B/B0%为纵坐标的标准曲线
b 以B0% Logit为纵坐标的标准曲线
14
15
RIA实际应用中的参数（一）
1．最大结合管（B0）：标准抗原的量为0，只有标记抗原 和特异性抗体时，标记抗原与抗体充分反应后分离B和F，所测 得的B的放射性为B0。这是没有标准抗原与之竞争时，标记抗原 和抗体的结合达最大值。
• 化学发光免疫分析法 (chemical luminescent immunoassay，CLIA)
• 酶标记的免疫分析法 (enzyme immunoassay, EIA)
4
体外分析技术的特点（1）
1、灵敏度高 可测水平10-9～10-20 g/l。 一般化学分析法检出极限为10-3～10-6g 。
1.RIA的必备条件包括由国家批准的生产单位提 供的试剂、分离技术、测量仪器。
2.主要试剂的组成是：特异性抗体(specific antibody)、标记抗原（radionuclide labeled antigen）、标准品（standard）（非标记抗原）。
第五章体外分析技术
的疗效判断,评价胰岛素产品质量.
骨钙素解甲状
腺\甲状旁腺功能
肝脏
急性黄疸型肝炎\慢性活动性肝炎\肝硬化
胆酸 放免<300μg/dl 肝癌\胆汁淤积时明显升高,慢性迁延性肝
炎及胆囊炎轻度升高。妊娠胆淤明显升高。
透明质酸 放免 <120μg/l 肝硬化\肝纤维化\慢性肝炎时升高,肝硬
同上
甲状腺球 放免〈30%
甲状腺自身免疫疾病特异指
蛋白抗体
标，桥本氏甲状腺炎
甲状腺微 放免〈20%
甲状腺自身免疫疾病特异指
粒体抗体
标，桥本氏甲状腺炎
TSH 免放 0.4-3.1μIU/ml 鉴别原发与继发甲低,评价下
丘脑-垂体-甲状腺轴功能,垂体瘤,库欣综合征
甲状腺 放免4-14.5μg/ml 诊断甲癌\慢性淋巴细胞性
三、质量控制
Quality Control , QC
（一）定义：质量控制 就是控制误差， 即对分析工作中的误差进行经常性的 检查，遇有质量异常则及时采取对策， 以保证分析误差控制在可接受的范围 内。
放射免疫分析是一类高灵敏度的超微 量分析技术，极易受各种因素的影响 而使检测结果失真，因此必须有严格 的质量控制体系。
CA-153 放免<30U/ml 乳癌诊断特异,乳癌肝及骨转移\卵巢癌\
子宫内膜癌一定程度增高
肾上腺及肾脏
尿免疫球蛋白 放免<8mg/l 早期诊断肾脏受损\受损部位及程度判断
尿白蛋白 放免<10mg/l
同上
尿β2微球蛋白 放免<230mg/l
同上
上午8时: 50~280μg/l 综合征,肾上腺肿瘤、肿瘤、应激
糖类抗原 放免<20mg/l 肿瘤诊断\预后, 放化疗及手术后的疗
核医学体外分析技术
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
抗CGMP抗体的交叉反应图
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
（3）高滴度的抗体：
抗体滴度(Titer)指抗体实际应用时的稀释倍数。
稀释倍数越大，抗体的滴度越高，滴度一般要求在1/1000以 上为好。
滴度曲线的目的：确定抗体稀释度；找出抗原和抗体 的最适比例（B/T为50%时的抗体稀释度）。
1Bq=1/S
1Ci=3.7
10¹ºBq
2)保持标记抗原的免疫活性：
每个蛋白质分子上标记1-2个碘原子。
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
3)便于放射性测量：
125I标记的抗原有r射线能直接测量
4)放射化学纯度高： 放射化学纯度: 是指具有免疫活性的标记抗原占总 放射性的百分数。 放化纯度要求大于90%以上
❖ 诺贝尔医学奖获得者－ Yalow博士。
❖ 1959年 Yalow和 Berson两位博士在研究胰岛素的抗 体时发展起来的。最早建立的是INS的RIA法。
❖ RIA法是一种高特异性、
❖ 高灵敏度的微量检测技术。
American physicist and medical researcher Rosalyn Yalow, corecipient of the 1977 Nobel Prize in physiology or medicine, "for the development of radioimmunoassays of peptide hormones."
❖ 目的：利用标准曲线来推算出病人样品（Ag）的含量。
❖ 配制一系列的标准品浓度：（0、20、40、80、160和320ng/L）
1B。 2
标记免疫分析技术1
体外分析技术
郑州大学第一附属医院核医学 阮 翘
临床核医学
临床核医学 诊断
治疗 体内检查法
功能（非显像）测定
体外分析技术
放射性核素显像
体外分析技术
体外放射分析 体外非放射分析
一.体外放射分析（in vitro radioassay）
(一）.概要： 1. 定义： 指在体外实验条件下，以结合反
（3）沉淀加双抗法
双抗体法非特异结合低，但所需时间长， 抗体用量大，PEG法操作简便快速，但非特异 结合高。 采用双抗体与 PEG 联合使用，它既兼顾了 双抗体法和沉淀法的优点，又克服了两者的缺 点，使分离更快速，非特异结合低，二抗用量 少，此方法目前已被广泛应用。
（4）固相法(solid phase method)
2. 标记抗原(labelled antigen)：
a.放射性核素的选择--125I ，3H，14C ；
b.标记抗原与未标记抗原免疫活性一致；
c.标记抗原有一定比度（比度指单位质量物质 所具有的放射性强度 KBq/ug）； d.放射化学纯度（标记抗原放射性占总放射性 的百分比）：要求大于95%。
3.特异性抗体(specific antibody)
2. 特点
（1）灵敏度高（10-9~~10-15 g) 灵敏度是指可以检测到的最小化学量。 （2）特异性强 特异性是指测量方法中所用的抗体或结合 剂对被测物质特异结合的性质，也是指它的专 一性。 （3）放射性核素不引入人体。 （4 )操作简单，样品用量少，应用范围广。
（二）.基本原理
（以放射免疫分析为例）
标记抗原(labelled antigen)；
特异性抗体(specific antibody ); 合适的分离技术(separation method).
郑州大学第一附属医院核医学 阮 翘
临床核医学
临床核医学 诊断
治疗 体内检查法
功能（非显像）测定
体外分析技术
放射性核素显像
体外分析技术
体外放射分析 体外非放射分析
一.体外放射分析（in vitro radioassay）
(一）.概要： 1. 定义： 指在体外实验条件下，以结合反
（3）沉淀加双抗法
双抗体法非特异结合低，但所需时间长， 抗体用量大，PEG法操作简便快速，但非特异 结合高。 采用双抗体与 PEG 联合使用，它既兼顾了 双抗体法和沉淀法的优点，又克服了两者的缺 点，使分离更快速，非特异结合低，二抗用量 少，此方法目前已被广泛应用。
（4）固相法(solid phase method)
2. 标记抗原(labelled antigen)：
a.放射性核素的选择--125I ，3H，14C ；
b.标记抗原与未标记抗原免疫活性一致；
c.标记抗原有一定比度（比度指单位质量物质 所具有的放射性强度 KBq/ug）； d.放射化学纯度（标记抗原放射性占总放射性 的百分比）：要求大于95%。
3.特异性抗体(specific antibody)
2. 特点
（1）灵敏度高（10-9~~10-15 g) 灵敏度是指可以检测到的最小化学量。 （2）特异性强 特异性是指测量方法中所用的抗体或结合 剂对被测物质特异结合的性质，也是指它的专 一性。 （3）放射性核素不引入人体。 （4 )操作简单，样品用量少，应用范围广。
（二）.基本原理
（以放射免疫分析为例）
标记抗原(labelled antigen)；
特异性抗体(specific antibody ); 合适的分离技术(separation method).
体外放射分析(检验)-检验核医学
一 体外放射分析的概述
（一）特异性结合
1、抗原与抗体 2、配体与受体 3、底物与酶 4、激素与血浆结合球蛋白
（二）结合反应动力学规律
[L]+[B]=[LB]
1、竞争性结合分析 [L]+[*L]+[B]=[LB]+[*LB]
2、非竞争性结合分析
Sp.Ab1+Ag=SpAb1.Ag+*Ab2=Sp.Ab1. Ag.*Ab2+*Ab2
滴度：
结合50%标记抗原时血清的稀释度
单克隆抗体
特点：
特异性高 抗体成分专一 可反复制备
制备：
1、免疫小鼠，制备脾细 胞悬液
2、选择培养，用HAT培 养基筛选杂交瘤细胞
3、检测抗体 4、克隆化
（三）分离方法
1、分离方法的要求
1、使结合部分与游离部分尽可能完全分开 2、分得的成分便于作放射性操作 3、分离效果不受外界干扰因素影响 4、操作简便、分离迅速、重复性好 5、试剂来源广泛、价廉易得
（Radio Receptor Assay, RRA）
[L]+[*L]+[B]=[LB]+[*LB]
（一）放射免疫分析原理
*Ag+Ag+Ab =(*Ag—Ab)+(Ag—Ab)+*Ag + Ag
0
条件：
Max
Min
放射
性计
数
1、 *Ag定量、足量
2、 Ab限量 *Ag>Ab
Ag与*Ag-Ab成反比！
体外放射分析指在体外实验条件下，以特
异结合反应为基础，以放射性测量为手段， 对生物活性物质进行超微量分析的总称。
特点：灵敏度高、特异性强、精密度好、
第五章 体外分析技术
1968年Miles和Hales建立了免疫放射分析方法，利用标 记抗体作示踪剂，在反应系统中加入过量的抗体，故其 灵敏度比放射免疫分析法明显提高，而且标准曲线的测 量范围也明显扩大。
放射免疫分析
RADIOIMMUNOASSAY,RIA
Definition
是以抗原抗体的免疫反应 为基础，利用待测抗原与 定量的标记抗原同有限量 的特异性抗体竞争性结合， 以放射性测量为微量定量 手段，获得待测生物样品 中抗原浓度的技术。
Main methods
Ag + Ab + * Ag AgAb + Ag
*Ag + *AgAb
Main methods
放射性标记抗原与非标记抗原（包括标准抗原或待测抗原） 与有限量的特异性抗体发生可逆性竞争结合，形成抗原抗 体复合物。 反应体系中同时存在*Ag、Ag和Ab，而*Ag的量一定、Ab的 量固定，而且Ag+*Ag＞＞Ab时，随着Ag的增加，*AgAb的 量相应减少，即与Ag（包括标准抗原或待测抗原）的量呈 负相关。当反应达到平衡后，将反应体系中的标记抗原抗体复合物与游离的标记抗原分离，测定其放射性。以标 准抗原的浓度为横坐标，以标记抗原-抗体复合物的结合 率（B/T、B/F、或F/T）为纵坐标，绘制剂量反应曲线， 也称剂量效应曲线（calibration curve）。
Radiolabeled compounds
标记物
合适的核素标记（半衰期、射线类型、能量 等）,常用核素有125I和3H 标记物的用量要小，应等于或低于待测物的 最小量 足够的比活度 放化纯度高 免疫活性 稳定性好，贮存不易脱标
Specific binding reagent
体外分析
特异性(specificity)：不受交叉反应的程 度 亲和力 (affinity)：配体与抗体相互结合 的程度，用亲和力常数表示 滴度 (titer)：在 RIA 时，结合 50% 的标记 配体的抗体稀释度；IRMA分析要求较高滴 度（过量）
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分离技术
固相法：将抗体吸附在某种固体支持物 （球、管）上，如塑料、纤维素等材料 双抗法 Ag+Ab AgAb+Ab2 AgAbAb2 Ab2（第二抗体）：羊抗兔抗体，也称通用 抗体
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log-logit法
log-logit坐标系及线性回归法： 是目前公认比较好的拟合方法，它是以 结合率的logit值为纵坐标，以标准品浓 度的对数值为横坐标，制成散点图，然 后用最小二乘法对各散点进行直线回归， 得出回归方程，获得标准曲线，可用计 算机或计算器完成
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RIA原理
为了定量地测定待测样品中抗原的含量， 如在这个体系中加入放射性核素标记的 同类抗原，体系中同时存在两个平衡
Ag＋Ab ＋ Ag* Ag.Ab Ag*.Ab
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Ag＋Ab
------- Ag.Ab
＋ Ag* -------- Ag*.Ab
Ag*Ag* 和 Ab 的量保持恒定， Ag* 与 Ag 之和大 于 Ab 时，则 Ag*.Ab 复合物的形成受 Ag 含量 的制约，二者之间存在函数关系，即随着 Ag 浓度的增加， Ag*.Ab 复合物也减少，因
RIA分析误差
系统误差：向一个方向偏离，但可纠正 如标准品不标准、加样器不准等 随机误差：不可避免，但可控制在一定范 围 如加样、分离、放射性测量等
体外分析技术放射免疫分析
体外分析技术放射免疫分析体外分析技术是指在试管内进行反应从而测定某生物活性物质的超微量分析技术。
该类技术的特点是高灵敏度和高特异性，广泛用于临床和科学研究的很多领域。
应用最多的是：放射免疫分析、免疫放射分析、受体的放射配基结合分析及非放射性免疫分析。
一、原理放射免疫分析法(radioimmunoassay,RIA)的基本原理是，限量标记抗原［*Ag］和可变量的非标记待测抗原［Ag］与定量的特异抗体［Ab］发生竞争结合反应，通过测定复合物的放射性来计算出待测非标记抗原的量。
这一过程可用下式表示：*Λg+Λg+Ab< »［ΛgΛb］*+［ΛgΛb］上述式中，Ab的分子数少于*Ag,因此即使系统中没有Ag,仅有*Ag,当反应达到平衡时，绝大部分(因为是可逆反应，不会是100%)Ab将形成*AgAb复合物。
如果系统中加入Ag,则Ag与*Ag竞争结合Ab,形成AgAb,*AgAb将减少。
Ag越多则*AgAb越少。
实践和理论推导都证明，*AgAb和Ag呈二次方程的函数关系，如以Ag为横坐标，*AgAb(B)或*AgAb占加入总*Ag的％(B%)为纵坐标，是一条斜率逐步由大变小的下降曲线。
如以游离的*Ag(F)或游离*Ag占加入总*Ag的％(F%)为纵坐标，则是一条斜率逐步由大变小的上升曲线。
也可以*AgAb∕*Ag的比值(R)为纵坐标，也是一条斜率逐步由大变小的上升曲线。
分析中，首先以不同量的已知标准品Ag和定量*Ag及限量Ab进行竞争结合反应，得到以B或B%、F或F%、或R为纵坐标的剂量效应曲线(也称标准曲线)，然后以未知样品测得的B或B%、F或F%、或R从曲线上查出相应的剂量。
二、试剂盒基本试剂试剂盒由国家批准的生产单位提供，提供R1A的主要试剂、操作方法、保存条件及保存期限。
使用者应按说明书的要求合理使用。
如果临床工作需要，使用者可以对试剂稀释度、操作步.骤等进行适当修改，但应当对改变了的方案进行精密度、准确度、灵敏度等考核，并作详细记录。
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定义：在体外条件下、以放射性核素标记的配体为示踪剂、以结合反应为基础、以放射性测量为定量手段、对微量物质进行定量分析的一类分析方法。
按照方法学设计原理分类
竞争性结合分析——竞争性结合反应为基础，结合剂和标记物是限量的。
（放射免疫酶促受体）
放射免疫分析（最有代表性）、放射受体分析、蛋白质结合竞争分析、放射酶促分析
非竞争性结合分析——结合剂的结合位点是过量的，待测配体全量参加反应，灵敏度高。
免疫放射分析、受体放射分析、酶的放射化学测定、酶的激活剂或者抑制剂测定。
※共同基础为分子识别。
放射免疫分析(RIA)——待测抗原和定量标记抗原与有限量的特异性抗体竞争性结合，以放射性测量为定量手段，获得待测抗原浓度的分析。
条件1、待测Ag和标记具有相同免疫活性。
2、待测Ag和标记Ag*总量必须＞Ab量（只有多了才能竞争）
3、Ag*量和Ab量保持恒定。
4、Ab必须有合适的滴度（常以能与50%标记抗原结合的稀释倍数表示）
5、降低Ab浓度→提高检测灵敏度，但是缩窄检测范围
6、增加Ab浓度→降低检测灵敏度，但是适合较高浓度的抗原检测。
公式：（Ag+Ag*）＋Ab——→Ag·Ab + Ag*·Ab + Ag + Ag*
免疫放射分析（IRMA）——过量的标记抗体与待测抗原结合，分离标记抗原抗体复合物和未结合标记抗体，通过反射性测量可求得抗原的含量。
Ag+＋*Ab——→Ag·*Ab + *Ab
具体方法：单位点法、双位点法（应用最最多的方法）和标记第三抗体法
两种方法异同点
相同点：1、均已抗原抗体的免疫反应为基础；2、测定的对象都是物质的抗原
不同点：见下表
受体放射分析——研究受体数目和性质的分析技术，非竞争性结合分析
受体放射分析时标记配体的要求：1、与相应的受体有高亲和力，在一定浓度达到最大结合率，转移性好；2、标记配体比活度高（＞10ci/mmol），纯度高、常用的多为3H标记拮抗剂，某些具有酪氨酸残基的多肽也可以125I标记。
体外分析的标记抗原或者抗体的质量要求
1、比活度；
2、免疫性；
3、放化纯度；
4、稳定性。