体外放射配体结合分析
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特异性强 放射性核素不引入体内 应用范围广 被测样品用量小
操作简便
易于自动化
放射免疫分析
RIA
基本原理*
竞争性结合的抑制反应
•非标记抗原（检测对象或标准品） •标记抗原 •抗体限量 •标记和非标记抗原具有相同的免疫活性
•同时与限量的抗体进行免疫结合反应
彼此竞争
相互抑制
反应式*
固相-Ab1+Ag （待测） 固相-Ab1-Ag +*Ab2
固相-Ab1-Ag -*Ab2+*Ab2
基本特点
标记物为抗体，不影响抗原的免疫活性 使用的是单克隆抗体，特异性明显提高 单克隆抗体为大分子物质，碘化标记抗体比
抗原容易，产物比较稳定
检测灵敏度较RIA高，且检测范围扩大 操作更为简便、快速 抗体用量大，成本较高 仅适用于蛋白质类大分子物质的检测
100μl AFP 50ng/ml
100μl AFP 100ng/ml
100μl AFP 200ng/ml
100μl AFP 400ng/ml
100μl 待测 血清
零标准管
1
2
3
4
5
6
待测管
AFP放射免疫（快速法）测定
温育
充分摇匀
56°C水浴10min
-20 °C冰箱10min
AFP放射免疫（快速法）测定
体外放射配体 结合分析
概念-体外放射配体结合分析
*
采用放射性核素标记物为示踪剂， 以特异性结合反应为基础，以放射性测 量为定量手段，在体外对微量活性物质 进行定量检测的一类分析技术
分类
放射性竞争结合分析
放射免疫分析 RIA 放射性非竞争结合分析 免疫放射分析IRMA
体外放射配体结合分析优点
灵敏度高
*Ag+ Ab + Ag *Ag-Ab+ *Ag
限量
Ag-Ab + Ag
Ag: 待测抗原 *Ag: 标记抗原 Ab: 抗体 Ag-Ab: 抗原抗体复合物 *Ag-Ab: 标记抗原抗体复合物
放射免疫分析技术原理示意
标准曲线
基本试剂
标准抗原
标记抗原
即标准品，与 待测物具有相同 的化学结构、免 疫学活性， 是RIA的示综剂， 125I，纯度高，合适的 比活性，标记后抗原 免疫活性不受破坏 特异性高，滴 度高，亲和力大
固相法
基本操作步骤
加样
温育
分离
放射性测量
绘制标准曲线
查待测物含量
免疫放射分析 IRMA
基本原理
抗原与特异性抗体间的特异性结合 检测对象为抗原 标记的是抗体，抗体过量 标准抗原或待测抗原与抗体的结合 不
存在竞争
非竞争性放射分析
双位点(夹心)固相免疫放射分析法
标准曲线
实验步骤
分离
加分离试剂500μl 充分摇匀室温放置15min 离心 3500转/min，离心15min 弃上清后测沉淀放射性计数
绘制标准曲线
查待测物含量
Байду номын сангаас
实验开始
特异性抗体 分离试剂
第二抗体 分离方法 优点：特异性强，分离效果 好，适合自动化。 中性盐和有机溶剂 缺点：二抗用量大，成本高， 硫酸钠，硫酸铵及聚乙二醇（ PEG)等 两次温育，操作时间长 双抗体法 优点：来源容易，价格便宜，分离快 速，不需二次温育。 缺点：结果易受T,PH,试剂浓度等因 素影响。 活性炭 硅酸盐 离子交换树脂 沉淀法 免疫吸附法 优点：简单，快速，经济，材料来源广。 ：专一性差，影响因素多 ：固相材料来源广，价格低，分离 缺点 优点 不用离心，简单，快速。 吸附法 缺点：制备固相试剂费时，费事；抗体 活性的回收率低；大分子抗体与固相连 接时会造成亲和力下降，灵敏度受影响
实
验
AFP放射免疫（快速法）测定
AFP放射免疫（快速法）测定
实验报告
姓名 学号 期、班级 实验名称 实验原理 实验方法（步骤） 实验结果 讨论*
AFP放射免疫（快速法）测定
加样
100 μl 100 125 μI-AFP l 抗体 AFP 缓 冲 液
100μl AFP 10ng/ml
100μl AFP 25ng/ml
单克隆抗体涂被固相载体，形成固相
抗体，通常为试管底部； 试管内加入标准品或待测样品，形成 固相抗原抗体复合物 加入放射性核素标记的单克隆抗体， 形成固相抗体-抗原-*抗体复合物 剩余的标记单克隆抗体则留于液相中， 通过洗管洗去 测量试管中的放射性计数，经标准曲 线就可查出待测物含量
反应式
操作简便
易于自动化
放射免疫分析
RIA
基本原理*
竞争性结合的抑制反应
•非标记抗原（检测对象或标准品） •标记抗原 •抗体限量 •标记和非标记抗原具有相同的免疫活性
•同时与限量的抗体进行免疫结合反应
彼此竞争
相互抑制
反应式*
固相-Ab1+Ag （待测） 固相-Ab1-Ag +*Ab2
固相-Ab1-Ag -*Ab2+*Ab2
基本特点
标记物为抗体，不影响抗原的免疫活性 使用的是单克隆抗体，特异性明显提高 单克隆抗体为大分子物质，碘化标记抗体比
抗原容易，产物比较稳定
检测灵敏度较RIA高，且检测范围扩大 操作更为简便、快速 抗体用量大，成本较高 仅适用于蛋白质类大分子物质的检测
100μl AFP 50ng/ml
100μl AFP 100ng/ml
100μl AFP 200ng/ml
100μl AFP 400ng/ml
100μl 待测 血清
零标准管
1
2
3
4
5
6
待测管
AFP放射免疫（快速法）测定
温育
充分摇匀
56°C水浴10min
-20 °C冰箱10min
AFP放射免疫（快速法）测定
体外放射配体 结合分析
概念-体外放射配体结合分析
*
采用放射性核素标记物为示踪剂， 以特异性结合反应为基础，以放射性测 量为定量手段，在体外对微量活性物质 进行定量检测的一类分析技术
分类
放射性竞争结合分析
放射免疫分析 RIA 放射性非竞争结合分析 免疫放射分析IRMA
体外放射配体结合分析优点
灵敏度高
*Ag+ Ab + Ag *Ag-Ab+ *Ag
限量
Ag-Ab + Ag
Ag: 待测抗原 *Ag: 标记抗原 Ab: 抗体 Ag-Ab: 抗原抗体复合物 *Ag-Ab: 标记抗原抗体复合物
放射免疫分析技术原理示意
标准曲线
基本试剂
标准抗原
标记抗原
即标准品，与 待测物具有相同 的化学结构、免 疫学活性， 是RIA的示综剂， 125I，纯度高，合适的 比活性，标记后抗原 免疫活性不受破坏 特异性高，滴 度高，亲和力大
固相法
基本操作步骤
加样
温育
分离
放射性测量
绘制标准曲线
查待测物含量
免疫放射分析 IRMA
基本原理
抗原与特异性抗体间的特异性结合 检测对象为抗原 标记的是抗体，抗体过量 标准抗原或待测抗原与抗体的结合 不
存在竞争
非竞争性放射分析
双位点(夹心)固相免疫放射分析法
标准曲线
实验步骤
分离
加分离试剂500μl 充分摇匀室温放置15min 离心 3500转/min，离心15min 弃上清后测沉淀放射性计数
绘制标准曲线
查待测物含量
Байду номын сангаас
实验开始
特异性抗体 分离试剂
第二抗体 分离方法 优点：特异性强，分离效果 好，适合自动化。 中性盐和有机溶剂 缺点：二抗用量大，成本高， 硫酸钠，硫酸铵及聚乙二醇（ PEG)等 两次温育，操作时间长 双抗体法 优点：来源容易，价格便宜，分离快 速，不需二次温育。 缺点：结果易受T,PH,试剂浓度等因 素影响。 活性炭 硅酸盐 离子交换树脂 沉淀法 免疫吸附法 优点：简单，快速，经济，材料来源广。 ：专一性差，影响因素多 ：固相材料来源广，价格低，分离 缺点 优点 不用离心，简单，快速。 吸附法 缺点：制备固相试剂费时，费事；抗体 活性的回收率低；大分子抗体与固相连 接时会造成亲和力下降，灵敏度受影响
实
验
AFP放射免疫（快速法）测定
AFP放射免疫（快速法）测定
实验报告
姓名 学号 期、班级 实验名称 实验原理 实验方法（步骤） 实验结果 讨论*
AFP放射免疫（快速法）测定
加样
100 μl 100 125 μI-AFP l 抗体 AFP 缓 冲 液
100μl AFP 10ng/ml
100μl AFP 25ng/ml
单克隆抗体涂被固相载体，形成固相
抗体，通常为试管底部； 试管内加入标准品或待测样品，形成 固相抗原抗体复合物 加入放射性核素标记的单克隆抗体， 形成固相抗体-抗原-*抗体复合物 剩余的标记单克隆抗体则留于液相中， 通过洗管洗去 测量试管中的放射性计数，经标准曲 线就可查出待测物含量
反应式