经典蛋白含量测定方法比较及双缩脲法实验步骤简介

Folin－酚 试 剂 法 (Lowry法)
灵敏度高～ 慢速 5g 40～ 60分 钟
考马斯亮蓝 灵敏度最高 快速 考马斯亮蓝染料 强碱性缓冲 1～5g 5～15 与蛋白质结合时, 液；Triton 法 X-100;SDS 分钟 其max由465 (Bradford法) nm 变为595nm
一、实验目的
掌握双缩脲法定量测定蛋白质含量的原理 和方法。 进一步掌握紫外和可见光分光光度计的原 理和使用方法。
二、实验原理
2
2
180℃
2 2
2
加热
H－
＋ NH3
2
双缩脲
双缩脲反应:碱性环境
H2 O
O=C HN R-CH O=C HN R-CH C=O NH CH-R C=O NH CH-R
紫色络合物
Cu
充分混匀后, 室温下(20~25℃)放置30min A540
（二） 绘制标准曲线
以每管蛋白的含量为横坐标,其相对应的A520 为 纵坐标绘制标准曲线。
（三）未知样品蛋白质浓度的测定
取2只试管，每只分别加入1ml稀释的未知样品， 再分别加入4ml双缩脲试剂，操作方法同前。 然后，测540nm处光密度值，取其平均值。从绘 制的标准曲线查得未知样品的蛋白浓度。
凯氏定氮法 (Kjedahl法) 双缩脲法 (Biuret法) 紫外吸收法
灵敏度
时间
原 理
将蛋白氮转化为 氨，用酸吸收后 滴定 多肽键＋碱性 Cu2＋紫色络 合物
干扰物质
非蛋白氮(可 用TCA沉淀 蛋白质而分 离) 硫酸铵;Tris 缓冲液；某 些氨基酸
说 明
用于标准蛋白质 含量的准确测定; 干扰少;费时太长 用于快速测定, 但 不太灵敏; 不同蛋 白质显色相似
除 － CONH－ 有 此 反 应 外 ， － CONH2， －CH2－NH2，－CS－NH2等亦有此反应。
三、实验仪器、材料和试剂
（一）仪器
吸量管(1ml/2ml/5ml)、试管及试管架、分光光度计。
（二）材料
标准蛋白溶液(10mg/ml BSA)、 未知液(人血清×10)
（三）试剂
双缩脲试剂 溶解0.175 g硫酸铜（CuSO4· 2O）溶于 5H 15ml蒸馏水，置于100ml容量瓶中，加入30ml冰冷的蒸 馏水和20ml饱和氢氧化钠溶液，摇匀，室温放置1~2h， 再加蒸馏水对刻度，摇匀备用。
实验四、双缩脲法测定蛋白质的浓度
N端
C端
相关知识

目前常用的有五种经典方法：
定氮法：灵敏度0.2~1.0mg 双缩脲法（Biuret法）：1~20mg Folin－酚试剂法(Lowry法)：50~100μg 紫外吸收法：5μg 考马斯亮蓝法（Bradford法）：1~5μg

方 法
含有两个或 两个以上肽 键的化合物 均有双缩脲 反应
H2O
蛋白质含有两个以上的肽键，因此有双缩脲 反应。在碱性溶液中蛋白质与Cu2+形成紫红 色络合物，其颜色的深浅与蛋白质的浓度成 正比，而与蛋白质的分子量及氨基酸成分无 关，因此被广泛地应用。 在一定的实验条件下, 未知样品的溶液与标 准蛋白质溶液同时反应, 并于540－560nm下 比色, 可通过标准蛋白质的标准曲线求出未 知样品的蛋白质浓度。
五、实验结果
Y×N 血清样品蛋白质含量 = V 其中： Y为标准曲线查得蛋白质浓度(mg/ml) ×100
N为稀释倍数
V为血清样品所取的体积(ml)
灵敏度低, 费时 适用于0.2 ~ 8～10 1.0mg氮,误 小时 差为 2％ 灵敏度低 1～20mg 较为灵敏 50～100g 中速 20~30 分钟 快速 5～10 分钟
各种蛋白质中的 嘌吟和嘧啶； 用于层析柱流出 Tyr和Trp残基在 各种核苷酸 液的检测；核酸 280 nm处的光吸 的吸收可校正 收 双缩脲反应; 磷 硫酸铵; Tris 钼酸－磷钨酸试 缓冲液;甘氨 剂被Tyr和Phe还 酸;各种硫醇 原 耗费时间长；操 作要严格计时； 颜色深浅随不同 蛋白质变化 最好的方法; 干扰 物质少; 颜色稳定; 颜色深浅随不同 蛋白质变化
四、实验操作步骤
（一） 标准曲线的制作
试 管 剂
0
号
1 0.2 0.8
2 0.4 0.6
3 0.6 0.4
4 0.8 0.2
5 1.0 0
标准蛋白溶液(ml)
0 Leabharlann Baidu.0
蒸馏水(ml)
蛋白质浓度 (mg/ml)
0
2.0
4.0
4.0
4.0
6.0
4.0
8.0
4.0
10.0
4.0
双缩脲试剂(ml) 4.0