纸片扩散法资料
杀菌动力学
9．测量抑菌环孵育后，手持平皿，从背面目测检查每块平板，用卡尺测量每个抑制环直径(包含纸片的直径)，并以mm为单位记录大小。
10．结果判断参照表6-3—1标准，根据抑菌环大小作出判断，分敏感、中介和耐药三级报告结果。
3. 接种方法将试验菌稀释成107CFU／ml细菌浓度，取一环(约2μg)接种到含有一系列抗生素的琼脂平板上。接种前平板必须相当干燥，从低浓度琼脂平板开始，在30分钟内完成接种，每次试验需点种一个不含抗生素M—H平板以及质控菌株(ATCC．25922)作质控对照。
4. 培养接种好的平板，放置室温让接种液被充分吸干后，置(35±2)℃孵箱内16～20小时，读取结果。
2. 培养基制备M．H琼脂 配制时加水量要减少1／10，以备添加稀释好的抗生素溶液。琼脂培养基经121℃灭菌15分钟，于水浴中冷却至45～50℃；在每个直径9cm平皿中，加 M—H培养基25ml，稀释好抗生素溶液2.5ml，充分混合，制备含有抗生素的琼脂平板，密封在塑料袋，4～8℃冰箱保存，可使用一周。
5．接种菌液制备? ①增菌法：选择琼脂平板上形态相同的菌落至少4～5个，用接种环挑其顶部，移种到4～5ml肉汤或大豆酪蛋白消化液中，35℃培养2～6小时，菌液浓度达 到或超过0.5单位麦氏比浊管浓度，用生理盐水或肉汤校正菌液浓度至与麦氏单位标准比浊管相同[约(1～2)×108CFU／m1]。②细菌直接悬液法： 可直接用过夜培养的菌落在盐水或肉汤中制备接种菌液，浓度调至0.5麦氏单位标准比浊管。
1．纸片扩散法(K—B 法)药敏试验把含有抗菌药物的圆纸片放在均匀地接种了实验细菌的琼脂平板上，抗生素的浓度梯度通过从圆纸片上扩散而形成。试验细菌的生长在圆纸周围一定距 离处被抑制，抑菌圈的大小与细菌的敏感性有直接关系。回归曲线表明MIC的对数与抑菌圈的直径呈直线关系。
药敏试验方法
一、纸片扩散法该法是将含有定量抗菌药物的滤纸片贴在已接种了测试菌的琼脂表面上，纸片中的药物在琼脂中扩散，随着扩散距离的增加，抗菌药物的浓度呈对数减少，从而在纸片的周围形成浓度梯度。
同时，纸片周围抑菌浓度范围内的菌株不能生长，二抑菌范围外的菌株则可以生长，从而在纸片的周围形成透明的抑菌圈，不同的抑菌药物的抑菌圈直径因受药物在琼脂中扩散速度的影响而可能不同，抑菌圈的大小可以反映测试菌对药物的敏感程度，并与该药物对测试菌的MIC呈负相关。
二、稀释法稀释法药敏试验可用于定量测试抗菌药物对某一细菌的体外活性，分为琼脂稀释法和肉汤稀释法。
实验时，抗菌药物的浓度通常经过倍比（lg2）稀释，能抑制待测菌肉眼可见生长的最低药物浓度成为最小抑菌浓度（MIC），一个特定抗菌药物的测试浓度范围应该包含能够检测细菌的解释性折点（敏感、中介和耐药）的浓度，同时也应该包含质控参考菌株的MIC.2.1 琼脂稀释法首先制备含抗菌药物的琼脂稀释平板。
再接种待测菌株，然后是结果判读。
2.2 肉汤稀释法三、抗生素浓度梯度法四、自动化仪器法一、实验材料普通营养琼脂培养基：可去生化试剂店购买，做不同细菌的药敏试验可选择不同的培养基，如做大肠杆菌的药敏试验可选择普通营养琼脂或麦糠凯培养基。
做沙门氏菌可选择血清培养基。
药敏试纸：购买或自制（详见实验准备）细菌：待做药敏试验的细菌仪器：接种环、酒精灯、打孔器、牛津杯、移液器、滴头二、实验准备2.1 药敏片的准备：购买或自制2.1.1 制备方法：取新华1号定性滤纸，用打孔机打成6毫米直径的圆形小纸片。
取圆纸片50片放入清洁干燥的青霉素空瓶中，瓶口以单层牛皮纸包扎。
经15磅15-20分钟高压消毒后，放在37℃温箱或烘箱中数天，使完全干燥。
2.1.2 抗菌药纸片制作：在上述含有50片纸片的青霉素瓶内加入药液0.25毫升，并翻动纸片，使各纸片充分浸透药液，翻动纸片时不能将纸片捣烂。
同时在瓶口上记录药物名称，放37℃温箱内过夜，干燥后即密盖，如有条件可真空干燥。
纸片扩散法药敏试验(KB法)
纸片扩散法药敏试验(KB法)纸片扩散法药敏试验，又称为KB法，是一种广泛应用于临床微生物实验室的抗生素敏感性检测方法。
通过该方法，可以快速、准确地评估病原菌对抗生素的敏感性，为临床医生提供治疗选择的依据。
纸片扩散法药敏试验的基本原理是将含有定量抗生素的纸片贴在接种有病原菌的培养基上，抗生素在培养基中扩散形成浓度梯度，抑制病原菌的生长。
通过测量纸片周围形成的抑菌圈直径，可以判断病原菌对抗生素的敏感性。
抑菌圈直径越大，表示病原菌对该抗生素越敏感。
纸片扩散法药敏试验具有操作简便、成本低廉、结果易于判读等优点，是目前临床上使用最广泛的药敏试验方法之一。
然而，该方法也存在一定的局限性，如受环境因素影响较大，结果受操作人员技术熟练程度影响等。
1. 选择合适的培养基：纸片扩散法药敏试验需要使用含有适量营养物质的培养基，以保证病原菌的生长。
2. 控制接种量：接种量过多或过少都会影响试验结果，因此需要严格控制接种量。
3. 选择合适的抗生素纸片：根据病原菌的种类和临床需求，选择合适的抗生素纸片进行试验。
4. 观察抑菌圈：在规定时间内观察抑菌圈的形成情况，测量抑菌圈直径，判断病原菌对抗生素的敏感性。
5. 结果报告：根据抑菌圈直径，按照相应的标准判断病原菌对抗生素的敏感性，并将结果报告给临床医生。
纸片扩散法药敏试验(KB法)是一种简单、实用的抗生素敏感性检测方法，在临床微生物实验室中具有广泛的应用。
通过规范操作，可以提高试验结果的准确性，为临床治疗提供有力支持。
纸片扩散法药敏试验(KB法)的进一步探讨我们需要了解KB法的基本操作步骤。
将含有特定抗生素的纸片贴在已经接种了细菌的琼脂平板上。
随着时间的推移，抗生素会从纸片中扩散到琼脂中，形成抗生素浓度梯度。
如果细菌对该抗生素敏感，那么在纸片周围就会形成一个无细菌生长的区域，即抑菌圈。
抑菌圈的大小与抗生素的浓度和细菌的敏感性有关。
KB法的准确性受到多种因素的影响。
纸片的抗生素含量必须准确，以保证试验的重复性。
实验6：纸片扩散法测定微生物的药敏性
实验6 抗生素等对细菌的药敏性检测antimicrobial susceptibility testing in vitro（圆盘滤纸片法disc diffusion test）一、实验目的：1、了解抗生素及化学试剂对微生物生长的影响2、掌握不同化学试剂的作用原理、常用浓度及使用方法二、实验原理许多微生物可以产生抗生素，能选择性的抑制或杀死其他微生物。
凡是抗菌谱即抗菌范围不广泛的抗生素称为窄谱抗生素，如青霉素只对革兰氏阳性菌有抗菌作用，而对革兰氏阴性菌、结核菌、立克次体等均无疗效，故青霉素就属于窄谱抗生素。
原来窄谱的抗生素如青霉素经过改造，产生了许多半合成的青霉素，扩大了原来的抗菌范围，如氨苄青霉素，不但对革兰氏阳性菌有效，而且对革兰氏阴性菌也很有效，对伤寒杆菌、痢疾杆菌效果也不错。
不同化学药品或同一化学药品对不同微生物的杀菌能力不同，此外，试剂浓度、作用时间及环境条件不同，其效果也不同。
应用前需进行试验，灵活选择。
三、实验器材1、菌种：培养24~28 h大肠杆菌、金黄色葡萄球菌斜面菌种。
2、培养基和试剂：牛肉膏蛋白胨培养基，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的菌液3、仪器与其他用品：无菌平皿，无菌吸管（1ml），酒精灯，接种环，涂布棒，无菌滤纸片，无菌镊子，记号笔, 消毒棉球和培养箱。
四、实验步骤（以金黄色葡萄球菌操作为例）（1）菌液制备：将待检菌接种于普通营养琼脂平板，37℃培养16～18小时，然后挑取普通营养琼脂平板上的纯培养菌落，悬于3ml生理盐水中，混匀后与菌液比浊管比浊。
以有黑字的白纸为背景，调整浊度与比浊管（0.5麦氏单位）相同。
（2）倒平板：将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基溶化后倒平板，注意平皿中培养基厚度均匀，倒3套平板。
（平板厚度均匀，滤纸片大小一致）（3）涂平板：无菌操作，用无菌棉棒儿蘸取菌液（金葡）。
将多余菌液在液面上方管壁内轻轻旋转挤出，涂布在MH琼脂平板整个平面三次，每次旋转60度，最后沿周边绕两圈，保证涂均匀。
纸片扩散试验的原理和过程
纸片扩散试验的原理和过程纸片扩散试验是一种常用的微生物灭菌效果评价方法，用于评估抗菌剂或消毒剂对细菌的杀灭作用。
它通过测量试验物质对细菌的抑制或杀灭效果，可以判断抗菌剂的有效性。
1. 实验原理：纸片扩散试验基于Kirby-Bauer法，利用试验物质通过纸片扩散，与培养基中的细菌接触，观察抑菌、杀菌或促进菌落生长的效果，从而评估抗菌剂的抗菌效果。
2. 实验过程：- 准备工作：- 准备试验物质：需要测试的抗菌剂或消毒剂。
- 准备培养基：适合所要测试细菌的培养基。
- 制备纸片：用纸片切割成规定大小，通常为6mm直径的圆片。
- 培养细菌：选择所需的细菌株，通过预培养使其处于对数生长期。
- 操作步骤：- 第一步，将培养基倒入培养皿中，使其均匀平铺在培养皿底部。
- 第二步，用针头取一圈培养菌液，沿着培养皿的边缘均匀涂抹。
- 第三步，将试验纸片浸泡在抗菌剂溶液中，使其吸满试验物质。
- 第四步，将纸片放置在培养皿上，轻轻按压，使纸片与培养基充分接触。
- 第五步，将培养皿盖上盖子，反转，将其放置在恒温箱中培养。
- 结果观察：- 培养时间结束后，观察培养皿内是否出现抑菌圈或促进菌落生长的现象。
- 抑菌圈直径越大，表示抗菌剂对细菌的抑制作用越强。
- 通过抗菌圈的直径，可根据标准抗生素灭菌试验的结果判定细菌对于不同抗生素的产生耐药性。
- 对于消毒剂，观察培养皿上是否有菌落生长，如果有，则说明消毒剂没有起到抑制细菌生长的作用。
3. 结果解释：纸片扩散试验的结果通过抗菌圈的直径来评估试验物质对细菌的抑制效果。
根据不同的抗生素或消毒剂对不同菌种的最低抑菌浓度（MIC），可以判断抗菌剂的强度以及菌株对其的耐药性水平。
4. 注意事项：- 纸片扩散试验只是一种初步评价抗菌剂或消毒剂效果的方法，结果可能受到多种因素的影响，如扩散速度、温度、湿度等。
- 该方法主要适用于评估新抗菌剂的抗菌活性，对于临床已经使用的抗菌剂可能不适用，因为细菌株可能已经产生了相应的耐药性。
K-B 纸片扩散法测定抗生素敏感试验
平板霉素类似物生物活性评价平板霉素对耐甲氧西林金葡菌(MRSA)和耐万古霉素肠球菌(VREF)等耐药菌具有很好的抑制活性。
抗菌活性的测试主要针对MRSA和VREF进行测定和相比。
最小抑制浓度（MIC）被确定抑制细菌生长的最低浓度。
通过生物活性数据的反馈，进一步指导平板霉素类似物的合成方向，希望获得活性更高、药效活性更好的抗耐药菌抗生素和药物先导化合物。
纸片扩散法测定抗生素敏感试验及MIC：1.原理：将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上。
纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分溶解后不断地向纸片周围区域扩散形成递减的梯度浓度。
在纸片周围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制,从而形成透明的抑菌圈。
抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度,并与该药对测试菌的最低抑菌浓度(MIC)呈负相关关系,即抑菌圈愈大,MIC愈小。
2.仪器及试剂仪器：纸片、试管、移液枪、烘箱、培养皿、培养箱、镊子、pH试纸、量筒、天平、高压灭菌锅、三角瓶、打孔器、超净工作台试剂：样品溶液、培养基3.菌液的配置从琼脂平板挑取新鲜分离的菌落数个或从保存的斜面上移种至3～5mL LB肉汤培养液中37℃培养2～8h，以待生长至轻微或中等浊度。
也可直接从孵育18～24h的琼脂平板上挑去纯菌落制成肉汤。
为保证药敏试验的准确度和精度，必须对接种菌液的浓度做相应的控制。
因此，将菌液稀释并校正浊度至0.5麦氏标准浓度，稀释时使用无菌肉汤或生理盐水，此时菌液的浓度约为1.5×108CFU/mL。
4.接种平板在超净工作台中，用量筒量取15mL配置好的灭菌培养基，倒在平板中，冷却凝固。
吸取稀释好的菌液500μL于洁净的灭菌试管中，加入4500μL的培养基，冷却到不烫手，摇匀，均匀倾倒置已凝固的平板表面，放置冷却至凝固。
5.粘贴药敏纸片用纸片分配器或无菌镊子取纸片（直径6mm，厚度1mm），贴于平板表面，并用镊子尖轻压一下纸片，使其贴平。
每张纸片的间距不小于24mm，纸片的中心距平板的边缘不小于15mm。
纸片扩散法药物敏感试验
纸片扩散法药物敏感试验若只根据是否出现抑菌环而不考虑抑菌环的直径大小来判断细菌是否对抗菌药物敏感的实验方法，其结果是不正确的。
而纸片扩散法试验是应用标准的方法学原理，根据抑菌环直径大小与最低抑菌浓度的相关性，结合临床上已知敏感或耐药菌株的状态，其结果是可靠的。
WHO推荐K-B法，其目的在于技术的简单和可重复性。
本法特别适用于肠杆菌科细菌，也可用于快速生长的致病菌，但不适用于其他细菌，如嗜血杆菌、奈瑟菌、专性厌氧菌及酵母样菌等。
无论用哪种方法接种，只要质控菌株的抑菌环在预期范围内，均可按同一解释标准报告结果。
但并非从感染患者分离到的微生物都必须做敏感试验，对于污染、机体共生的正常细菌群和那些与感染无关的细菌，可不必做敏感试验，只有那些被认为引起感染的微生物，应先分离提纯、鉴定菌种后再做敏感试验。
试验方法：一、试验材料：(一)培养基：Kirby-Bauer法指定用Mueller-Hinton琼脂。
多年大量的有关敏感试验的方法学研究，均采用该培养基；维持细菌正常发育，绝大多数细菌在此培养基上生长良好。
此培养基不拮抗抗菌药物活性以及商品的批次间差异等方面均优于其他培养基。
若检测肺炎链球菌的敏感性时，须在培养基中加5％的脱纤维羊血，制成血平板。
测嗜血杆菌及淋病奈瑟菌的敏感性时，在培养基中须加入1％血红素和 2.5mg/ml 辅酶I后应校正pH 7.2～7.4。
制备MH琼脂平板应用直径90cm平皿。
在水平的实验台上倾制。
琼脂厚为4mm，允许误差为土1mm。
琼脂凝固后，应测一下pH。
琼脂于板应放4℃保存，在7日内用完。
若当天不用，用塑料袋密封包装贮藏于冰箱（2-8℃）。
每批平板都应抽样，在30-50℃下培养24h或更长时间检查是否被感染。
MH琼脂培养基配方(1L)：Beef Extract 2.0g Acid Hydrolysis of Casein 17.5gStarch 1.5g Agar 17.0gFinal PH 7.3 at 25℃高压灭菌后立即水浴冷却至45-50℃。
纸片扩散法资料
抗生素敏感实验——纸片扩散原理：纸片扩散法是将含有定量抗菌药物的滤纸片贴在已接种了测试菌的琼脂表面上，纸片中的药物在琼脂中扩散，随着扩散距离的增加抗菌药物的浓度呈对数减少，从而在纸片的周围形成一种浓度梯度。
在药物扩散的同时，纸片周围抑菌浓度范围内的测试菌不能生长，而抑菌浓度范围外的菌株则继续生长，从而在纸片的周围形成透明的抑菌圈。
不同抗菌药物抑菌圈的直径因受药物在琼脂中的扩散速率的影响而可能不同，抑菌圈的大小可反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的最低抑菌浓度（MIC）呈负相关，即抑菌圈越大，MIC越小原理通俗说法：将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测定菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分，溶解后便不断的向纸片周围区域扩散形成递减的梯度浓度。
在纸片周围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制，从而形成透明的抑菌圈。
该抑菌圈表示药物对该种细菌的生长繁殖具有抑制作用。
通过测定抑菌圈的直径大小，可以判定药物的抑菌强弱，抑菌圈直径越大表示药物抑菌作用越强，抑菌圈直径越小表示药物抑菌作用弱，没有抑菌圈表示该药物没有抑菌作用。
并且，经稀释法测得的MIC的对数和用纸片测定相应的菌株得到的抑菌直径之间大致呈直线相关，因此将两种方法相对应地测试各种据菌株所得数据，进行统计学的相关回归分析处理，可得到一条回归线，依此可推断该菌株的MIC，两者呈负相关关系，即MIC愈小，抑菌圈直径愈大。
材料（以大肠杆菌为例）：1.药品及细菌——诺氟沙星、新霉素、硫酸链霉素、氟苯尼考、卡那霉素、泰乐菌素、生理盐水、磷酸盐缓冲液、MH营养肉汤、MH琼脂培养基、大肠杆菌。
2.器材——纸片、试管、移液器、烘箱、培养皿、培养箱、镊子、1000ml烧杯、PH试纸、量筒、天平、高压灭菌锅、三角瓶、打孔器方法1.培养基的制备：2.药敏纸片的制备2.1纸片制备：选择优质新华1号滤纸，用打孔器制成直径6mm的圆形滤纸片。
每200张一管，经120℃2h灭菌后备用2.2药物稀释每张以吸入20μL药液为标准，如纸片薄，药物原液需作调整。
纸片扩散法药物敏感试验
纸片扩散法药物敏感试验若只根据是否出现抑菌环而不考虑抑菌环的直径大小来判断细菌是否对抗菌药物敏感的实验方法，其结果是不正确的。
而纸片扩散法试验是应用标准的方法学原理，根据抑菌环直径大小与最低抑菌浓度的相关性，结合临床上已知敏感或耐药菌株的状态，其结果是可靠的。
WHO推荐K-B法，其目的在于技术的简单和可重复性。
本法特别适用于肠杆菌科细菌，也可用于快速生长的致病菌，但不适用于其他细菌，如嗜血杆菌、奈瑟菌、专性厌氧菌及酵母样菌等。
无论用哪种方法接种，只要质控菌株的抑菌环在预期范围内，均可按同一解释标准报告结果。
但并非从感染患者分离到的微生物都必须做敏感试验，对于污染、机体共生的正常细菌群和那些与感染无关的细菌，可不必做敏感试验，只有那些被认为引起感染的微生物，应先分离提纯、鉴定菌种后再做敏感试验。
试验方法：一、试验材料：(一)培养基：Kirby-Bauer法指定用Mueller-Hinton琼脂。
多年大量的有关敏感试验的方法学研究，均采用该培养基；维持细菌正常发育，绝大多数细菌在此培养基上生长良好。
此培养基不拮抗抗菌药物活性以及商品的批次间差异等方面均优于其他培养基。
若检测肺炎链球菌的敏感性时，须在培养基中加5％的脱纤维羊血，制成血平板。
测嗜血杆菌及淋病奈瑟菌的敏感性时，在培养基中须加入1％血红素和 2.5mg/ml 辅酶I后应校正pH 7.2～7.4。
制备MH琼脂平板应用直径90cm平皿。
在水平的实验台上倾制。
琼脂厚为4mm，允许误差为土1mm。
琼脂凝固后，应测一下pH。
琼脂于板应放4℃保存，在7日内用完。
若当天不用，用塑料袋密封包装贮藏于冰箱（2-8℃）。
每批平板都应抽样，在30-50℃下培养24h或更长时间检查是否被感染。
MH琼脂培养基配方(1L)：Beef Extract 2.0g Acid Hydrolysis of Casein 17.5gStarch 1.5g Agar 17.0gFinal PH 7.3 at 25℃高压灭菌后立即水浴冷却至45-50℃。
纸片扩散法药敏试验原理
纸片扩散法药敏试验原理
嘿，朋友们！今天咱来唠唠纸片扩散法药敏试验原理这档子事儿。
你说这药敏试验就像是一场细菌和药物的大作战！咱得想办法知道哪种药物能把那些捣乱的细菌给收拾得服服帖帖呀。
想象一下，咱把含有药物的小纸片就像一个个小战士一样，整整齐齐地放在涂满了细菌的培养基上。
这些小纸片就开始发挥它们的魔力啦！药物会从纸片里慢慢扩散出来，就像孙悟空画的那个圈圈一样，形成一个药物浓度逐渐变化的区域。
这时候细菌们可就面临考验啦！有的细菌比较弱，一碰到稍微厉害点的药物浓度就不行啦，直接被打败，这周围就变得干干净净，没它们的影儿啦。
可有的细菌比较顽固，还能在药物浓度不那么高的地方顽强抵抗呢。
这不就跟咱生活中一样嘛，遇到困难有的人一下子就被打倒了，有的人还能撑一会儿。
那通过观察这些小纸片周围细菌的生长情况，咱不就清楚哪种药物对这些细菌最有效啦！这多重要啊，就像医生治病得找对药一样，不然那不就白折腾啦！
你看，这纸片扩散法药敏试验不就是这么个道理嘛！它就像是一个神奇的魔法，能帮我们找到制服细菌的法宝。
而且操作起来也不难呀，只要咱细心点，按照步骤来，就能得到准确的结果。
咱可别小瞧了这个试验，它可是为了咱的健康保驾护航呢！医生们能根据这个结果来给病人开药，让病人能快点好起来。
这就像是在黑暗中找到了一盏明灯，给人指明了方向。
所以啊，这纸片扩散法药敏试验原理真的是太实用啦！它就像一个默默无闻的英雄，在背后为我们的健康默默付出呢！大家说是不是呀！。
纸片扩散法药敏试验
纸片扩散法药敏试验纸片扩散法（K-B法）药物敏感试验是在涂有细菌的琼脂平板培养基上按照一定要求贴浸有抗菌药的纸片，培养一段时间后测量抑菌圈大小，并根据相关解释标准进行结果分析，从而得出受试菌株药物敏感性的结论。
中文名纸片扩散法药敏试验临床意义得出受试菌株药物敏感性的结论目录.1试验原理.2试验步骤.3结果分析.4注意事项基本信息中文名纸片扩散法药敏试验临床意义得出受试菌株药物敏感性的结论试验原理纸片扩散药敏试验的原理：将含有定量的抗菌药物的纸片贴在接种有待测菌的固体培养基上，通过抗菌药物在培养基上的扩散，观察是否出现抑菌环，推断是否抑制细菌的生长。
药物扩散的距离越远，药物浓度越低抑菌能力越强，因此可根据抑菌环的大小，判定药物对细菌的抑制作用强弱。
试验步骤1. 待测菌株接种物制备（1）通用情况：从过夜孵育的平板，优先选择哥伦比亚血琼脂平板上的菌落上挑取数个单个菌落，直接接种4.5%生理盐水制成菌悬液，使用比浊仪调整悬液的浊度使其达到0.5麦氏单位，使菌悬液中含有相当于ATCC 25922大肠埃希菌（1-2）*1012CFU/mL浓度。
（2）特殊情况：嗜血杆菌属（本程序中所指的嗜血杆菌仅包括流感嗜血杆菌、副流感嗜血杆菌）：从过夜孵育的HTM平板，直接接种4.5%生理盐水制成菌悬液，使用比浊仪调整悬液的浊度使其达到0.5麦氏单位，使菌悬液中含有相当于ATCC 25922大肠埃希菌（1-2）*1012CFU/mL浓度。
2.接种平板（1）调整好悬液的浊度后，用无菌棉签浸入悬液内，紧贴试管内壁在液体上方旋转拭子数次，除去棉签上多余的液体，但也应适度。
（2）用拭子划线整个琼脂表面，从平板顶部到底部，均匀涂布，重复两次此过程（一共三次）每次旋转平板约60度，确保每次接种菌液均匀分布，最后在琼脂平板的边缘涂抹一圈，防止有流动的菌悬液，并使菌液涂布于整块平板的每个角落。
（3）涂布菌液完成的平板，可在室温放置一会（3-5分钟），以便在放置含有药物的纸片前使琼脂吸收表面多余的水分，但放置时间不应超过15分钟。
纸片扩散法
二、实验原理
将含有一定量抗菌药物的纸片或药片， 平贴于已接种被检细菌的琼脂培养基上，纸 片或药片中的药物即呈梯度向周围扩散，敏 感菌株在纸片或药片的周围生长受到抑制， 而形成抑菌圈。根据抑菌圈的大小，可判断 细菌对抗菌药物的敏感性。
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影响药敏结果的因素
一、培养基：应根据试验菌的营养需要进行配制。倾注 平板时，厚度合适（约5-6mm），不可太薄，且培养基 内应尽量避免有抗菌药物的拮抗物质，如钙、镁离子。 二、细菌接种量：细菌接种量应恒定，如太多，抑菌圈 变小。 三、药物浓度：药物的浓度和总量直接影响抑菌试验的 结果，需精确配制。 四、培养时间：一般在37℃下培养18-24小时。
三、实验材料与器材
1、实验材料 分离培养的细菌、平板，药敏纸片
2、实验器材 超净工作台、分光光度计、量尺或游标卡尺
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四、实验内容与步骤
（一）倒平板：固体培养基的准备 （二）细菌纯培养及菌悬液的制备
确定细菌的浓度：将细菌离心沉淀后用无菌PBS 稀释至OD值为0.2左右（细菌OD600吸光度在0.2-1.5 范围内，细菌数与OD值呈线性相关，OD值为0.2的 细菌数约为1*108 CFU/mL）。
一、实验目的
1、掌握细菌纯化再培养的方法 2、掌握人工药敏实验方法
1
二、药敏试验常用方法
1. 纸片扩散法（Disk Diffusion Test）： Kirby-Bauer法（K-B纸片琼脂扩散法）
和直接纸片药敏法 2. 稀释法（Dilution Test）：
包括琼脂稀释法（药物混合在培养基中） 和肉汤稀释法（抗生素梯度稀释） 3. 抗生素浓度梯度法-E 试 验（E-test）
药物敏感实验判定标准
抑菌圈直径（毫米）
K-B纸片扩散法药敏试验技术要点
2.3菌液的接种量细菌接种量是药敏试验结果产生较大差的原因之一，余修中[3]在K-B纸片扩散法药敏试验菌液量的规范研究中提出固定接种0.35ml菌液量的规范。到目前为止，NCCLS推荐使用的是采用无菌棉拭子蘸取调好的菌液，在液面上方管壁处旋转并用力挤压几次，以从中挤出过多的接种菌液。然后在琼脂表面均匀涂布接种3次，每次将平板转动约60度，最后用棉拭子涂抹琼脂的边缘，对接种菌量未做客观要求。鉴于上述情况，建议在进行药敏试验用棉拭子涂布时，尽量保证选用同一品牌、大小相同的棉拭子，以减少误差，确保药敏试验的准确可靠。
3培养基
3.1培养基的选择药敏试验中，为保证结果重复性及抑菌环的大小清晰，应选择对抗生素及磺胺药物无拮抗剂的培养基。水解酪蛋白（Mueller-Hinton,MH）培养基是CLSI推荐采用的需氧菌和兼性厌氧菌药敏试验标准培养基，PH为7.2-7.4，临床实验室常规敏感试验，除了检测容易生长的在M-H培养基的需氧、兼性厌氧菌外，尚有许多不能在M-H培养基上生长或生长不良的菌株。如链球菌属、流感嗜血杆菌及淋病奈瑟菌。培养基内必须补充特殊的营养成份。流感嗜血杆菌应选用嗜血杆菌试验培养基（HTM）[4]；肺炎链球菌和其他链球菌所用培养基是在M-H琼脂中加5%脱纤维羊血。
[3]余修中，K-B法药敏试验中菌液量的规范[J],四川省卫生管理干部学院学报，2002.9（21）：177.178.
[4]王传新、王国礼，现代检验医学技术及质量控制[M]，济南，山东科学技术出版社，204:171.
纸片扩散法药敏试验
纸片扩散法药敏试验纸片扩散法（K-B法）药物敏感试验是在涂有细菌的琼脂平板培养基上按照一定要求贴浸有抗菌药的纸片，培养一段时间后测量抑菌圈大小，并根据相关解释标准进行结果分析，从而得出受试菌株药物敏感性的结论。
中文名纸片扩散法药敏试验临床意义得出受试菌株药物敏感性的结论目录.1试验原理.2试验步骤.3结果分析.4注意事项基本信息中文名纸片扩散法药敏试验临床意义得出受试菌株药物敏感性的结论试验原理纸片扩散药敏试验的原理：将含有定量的抗菌药物的纸片贴在接种有待测菌的固体培养基上，通过抗菌药物在培养基上的扩散，观察是否出现抑菌环，推断是否抑制细菌的生长。
药物扩散的距离越远，药物浓度越低抑菌能力越强，因此可根据抑菌环的大小，判定药物对细菌的抑制作用强弱。
试验步骤1. 待测菌株接种物制备（1）通用情况：从过夜孵育的平板，优先选择哥伦比亚血琼脂平板上的菌落上挑取数个单个菌落，直接接种4.5%生理盐水制成菌悬液，使用比浊仪调整悬液的浊度使其达到0.5麦氏单位，使菌悬液中含有相当于ATCC 25922大肠埃希菌（1-2）*1012CFU/mL浓度。
（2）特殊情况：嗜血杆菌属（本程序中所指的嗜血杆菌仅包括流感嗜血杆菌、副流感嗜血杆菌）：从过夜孵育的HTM平板，直接接种4.5%生理盐水制成菌悬液，使用比浊仪调整悬液的浊度使其达到0.5麦氏单位，使菌悬液中含有相当于ATCC 25922大肠埃希菌（1-2）*1012CFU/mL浓度。
2.接种平板（1）调整好悬液的浊度后，用无菌棉签浸入悬液内，紧贴试管内壁在液体上方旋转拭子数次，除去棉签上多余的液体，但也应适度。
（2）用拭子划线整个琼脂表面，从平板顶部到底部，均匀涂布，重复两次此过程（一共三次）每次旋转平板约60度，确保每次接种菌液均匀分布，最后在琼脂平板的边缘涂抹一圈，防止有流动的菌悬液，并使菌液涂布于整块平板的每个角落。
（3）涂布菌液完成的平板，可在室温放置一会（3-5分钟），以便在放置含有药物的纸片前使琼脂吸收表面多余的水分，但放置时间不应超过15分钟。
纸片扩散法药敏试验
纸片扩散法药敏试验纸片扩散法（K-B法）药物敏感试验是在涂有细菌的琼脂平板培养基上按照一定要求贴浸有抗菌药的纸片，培养一段时间后测量抑菌圈大小，并根据相关解释标准进行结果分析，从而得出受试菌株药物敏感性的结论。
中文名纸片扩散法药敏试验临床意义得出受试菌株药物敏感性的结论目录.1试验原理.2试验步骤.3结果分析.4注意事项基本信息中文名纸片扩散法药敏试验临床意义得出受试菌株药物敏感性的结论试验原理纸片扩散药敏试验的原理：将含有定量的抗菌药物的纸片贴在接种有待测菌的固体培养基上，通过抗菌药物在培养基上的扩散，观察是否出现抑菌环，推断是否抑制细菌的生长。
药物扩散的距离越远，药物浓度越低抑菌能力越强，因此可根据抑菌环的大小，判定药物对细菌的抑制作用强弱。
试验步骤1. 待测菌株接种物制备（1）通用情况：从过夜孵育的平板，优先选择哥伦比亚血琼脂平板上的菌落上挑取数个单个菌落，直接接种4.5%生理盐水制成菌悬液，使用比浊仪调整悬液的浊度使其达到0.5麦氏单位，使菌悬液中含有相当于ATCC 25922大肠埃希菌（1-2）*1012CFU/mL浓度。
（2）特殊情况：嗜血杆菌属（本程序中所指的嗜血杆菌仅包括流感嗜血杆菌、副流感嗜血杆菌）：从过夜孵育的HTM平板，直接接种4.5%生理盐水制成菌悬液，使用比浊仪调整悬液的浊度使其达到0.5麦氏单位，使菌悬液中含有相当于ATCC 25922大肠埃希菌（1-2）*1012CFU/mL浓度。
2.接种平板（1）调整好悬液的浊度后，用无菌棉签浸入悬液内，紧贴试管内壁在液体上方旋转拭子数次，除去棉签上多余的液体，但也应适度。
（2）用拭子划线整个琼脂表面，从平板顶部到底部，均匀涂布，重复两次此过程（一共三次）每次旋转平板约60度，确保每次接种菌液均匀分布，最后在琼脂平板的边缘涂抹一圈，防止有流动的菌悬液，并使菌液涂布于整块平板的每个角落。
（3）涂布菌液完成的平板，可在室温放置一会（3-5分钟），以便在放置含有药物的纸片前使琼脂吸收表面多余的水分，但放置时间不应超过15分钟。
kb纸片琼脂扩散法原理
kb纸片琼脂扩散法原理KB纸片琼脂扩散法是一种常用的分子生物学技术，可以用于分析DNA、RNA、蛋白质等分子的浓度、大小、电荷等性质，为分子生物学研究提供了重要的实验手段。
下面我们来详细介绍一下KB纸片琼脂扩散法的原理和操作步骤。
一、原理KB纸片琼脂扩散法是利用琼脂凝胶的孔隙和分子的迁移速度不同来实现分子的分离和分析。
琼脂凝胶是一种由海藻提取的多糖物质，可以在水中形成均匀的凝胶状物质，并具有透明度和可扩散性。
当样品在凝胶上扩散时，由于分子大小和电荷的差异，不同的分子会在凝胶孔隙中扩散的速度不同，从而形成不同的“扩散环”，用来分析样品中不同分子的含量和性质。
二、操作步骤1、制备琼脂凝胶：将琼脂粉溶解在热水中，加入缓冲液和硼酸，调节pH值和含量，混合均匀后倒入琼脂扩散皿中，待其凝固后即可作为样品分析的凝胶。
2、制备样品：将待测样品加入适当的缓冲液中，加热（蛋白质样品需加入还原剂），再冷却至室温，使其处于最适合扩散的状态。
3、将样品加到凝胶中央的凹槽中，尽量避免产生气泡，使其均匀地扩散到凝胶中。
4、放置凝胶经过一定时间，待不同分子扩散到一定范围时，用无色显微镜观察凝胶表面出现的“扩散环”数量和大小。
5、根据“扩散环”的数量和直径，利用数学公式和标准曲线，计算出样品中分子的浓度、电荷等性质。
6、可将凝胶切下来进一步分析或保存，同时清洗皿子和工具以备下次使用。
三、注意事项1、制备凝胶要注意温度、pH值的控制，否则会影响凝胶的质量和效果。
2、将样品加入凝胶要均匀、避免气泡，避免扰乱分子扩散的状态。
3、观察“扩散环”要避免光源过强或过弱，过弱会使“扩散环”难以看清，过强会使皿子发热、影响凝胶扩散。
4、注意安全操作，避免接触凝胶时损伤皮肤和口腔。
总之，KB纸片琼脂扩散法是一种简单、快捷、便宜的分子生物学技术，可为不同领域的科学研究提供重要的帮助，但我们需要认真学习和掌握正确的操作方法和注意事项，才能充分发挥其作用。
纸片扩散法的注意事项
纸片扩散法的注意事项
纸片扩散法是一种用于研究颗粒在流体中扩散行为的实验方法。
在进行这一实验时，需要注意一些重要的事项，以确保实验的准确性和安全性。
首先，实验人员在进行纸片扩散法实验时，应当遵循实验室的安全规定，穿戴好实验服和防护眼镜，以免受到纸片切割或者实验溶液溅到皮肤和眼睛造成伤害。
同时，实验室内应当保持清洁整洁，避免杂物干扰实验的进行。
其次，实验人员在制备纸片时，需要确保纸片的大小和形状尽可能一致，以减小实验误差。
同时，在放置纸片到溶液中时，也要小心轻放，避免溅起溶液造成污染或者损坏纸片。
另外，在进行实验时，应当控制好实验条件，比如温度、溶液浓度等，以确保实验结果的可比性。
同时，还需要在一定时间间隔内记录纸片的扩散情况，以便后续数据分析和结果总结。
此外，实验结束后，需要对实验设备进行清洗和消毒，保持实验环境的整洁和卫生。
同时，实验人员也要及时处理实验产生的废弃物和污染物，以免对环境造成影响。
总的来说，纸片扩散法实验需要严格遵守实验操作规程和安全操作规定，确保实验过程的安全性和准确性。
只有在安全的前提下，才能得到可靠的实验结果，为进一步的科研工作提供可靠的数据支持。
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抗生素敏感实验——纸片扩散原理：纸片扩散法是将含有定量抗菌药物的滤纸片贴在已接种了测试菌的琼脂表面上，纸片中的药物在琼脂中扩散，随着扩散距离的增加抗菌药物的浓度呈对数减少，从而在纸片的周围形成一种浓度梯度。
在药物扩散的同时，纸片周围抑菌浓度范围内的测试菌不能生长，而抑菌浓度范围外的菌株则继续生长，从而在纸片的周围形成透明的抑菌圈。
不同抗菌药物抑菌圈的直径因受药物在琼脂中的扩散速率的影响而可能不同，抑菌圈的大小可反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的最低抑菌浓度（MIC）呈负相关，即抑菌圈越大，MIC越小原理通俗说法：将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测定菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分，溶解后便不断的向纸片周围区域扩散形成递减的梯度浓度。
在纸片周围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制，从而形成透明的抑菌圈。
该抑菌圈表示药物对该种细菌的生长繁殖具有抑制作用。
通过测定抑菌圈的直径大小，可以判定药物的抑菌强弱，抑菌圈直径越大表示药物抑菌作用越强，抑菌圈直径越小表示药物抑菌作用弱，没有抑菌圈表示该药物没有抑菌作用。
并且，经稀释法测得的MIC的对数和用纸片测定相应的菌株得到的抑菌直径之间大致呈直线相关，因此将两种方法相对应地测试各种据菌株所得数据，进行统计学的相关回归分析处理，可得到一条回归线，依此可推断该菌株的MIC，两者呈负相关关系，即MIC愈小，抑菌圈直径愈大。
材料（以大肠杆菌为例）：1.药品及细菌——诺氟沙星、新霉素、硫酸链霉素、氟苯尼考、卡那霉素、泰乐菌素、生理盐水、磷酸盐缓冲液、MH营养肉汤、MH琼脂培养基、大肠杆菌。
2.器材——纸片、试管、移液器、烘箱、培养皿、培养箱、镊子、1000ml烧杯、PH试纸、量筒、天平、高压灭菌锅、三角瓶、打孔器方法1.培养基的制备：2.药敏纸片的制备2.1纸片制备：选择优质新华1号滤纸，用打孔器制成直径6mm的圆形滤纸片。
每200张一管，经120℃2h灭菌后备用2.2药物稀释每张以吸入20μL药液为标准，如纸片薄，药物原液需作调整。
根据纸片内各种抗菌药物的不同浓度配制药物原液，其浓度需比纸片浓度大200倍，如青霉素G的纸片为10U/片，青霉素G的原液浓度为2000U/mL，200张纸片内即加入1mL青霉素G原液。
药液浓度见下表。
纸片内抗菌药物含量2.3 纸片浸润、干燥、保存用无菌操作法将待测的抗菌药物溶液1ml（含药量按表所列计算，例如，庆大霉素10μg /片×100片=1000μg /ml），加入摊布于灭菌平皿中的100片纸片中，置冰箱内浸泡1~2小时，必要时可不时翻动，使滤纸片将药液均匀吸净，如立即实验可不烘干，若保存备用可用下列一种方法烘干（干燥的抗菌素纸片可保存6个月）。
A．培养皿烘干法将浸有抗菌药液的纸片摊平在培养皿中，于37℃温箱内保持2~3h即可干燥，或放在无菌室内过夜干燥。
B．真空抽干法将放有抗菌药物纸片的试管置于干燥器了，用真空抽气机抽干。
纸片的保存将制好的各种药物纸片装入无菌小瓶中置冰箱内保存备用。
（纸片不应长期保存于常开的普通冰箱中，也不要放在其他不能维持适宜温度的容器中。
）收到纸片后应立即保存在-20~4℃中，由于实验室冰箱频繁地开关而不能维持适宜的温度，故常开的冰箱中只能放置1周使用的纸片；纸片容器打开前先置室温平衡（装纸片的容器自冰箱取出后，必须在室温10min以上才能打开，如立即打开，空气中的水分会冷凝在纸片上，易潮解），纸片贴毕应把未用完的放回冰箱中。
3.细菌的制备从琼脂平板挑取新鲜分离的菌落数个或从保存的斜面上移种至3～5mLMH肉汤培养液中37℃培养2～8h，以待生长至轻微或中等浊度。
也可直接从孵育18～24h的琼脂平板上挑去纯菌落制成肉汤。
为保证药敏试验的准确度和精度，必须对接种菌液的浓度做相应的控制。
因此，将菌液稀释并校正浊度至0.5麦氏标准浓度，稀释时使用无菌肉汤或生理盐水，此时菌液的浓度约为1.5×108个/L。
下表为麦氏比浊管制法：4.接种平板制备好的接种菌液必须在15min内使用。
用灭菌好的棉试子蘸取菌液，在管壁上旋转挤压几次，去掉过多的菌液。
然后用试子涂布整个培养基表面，反复几次，每次将平板旋转60°，最后沿平皿周边绕两圈，保证涂布均匀。
5.粘贴药敏试纸待平板上的水分被琼脂完全吸收后开始贴纸片。
用镊子取纸片一张，贴在琼脂平板表面，用镊子尖轻压，使其贴平，纸片一旦贴上就不能再拿起，因为纸片中的药物已经扩散到琼脂中。
纸片间距离不小于24mm，纸片中心距平皿边缘不小于15mm。
直径为90mm 的平板最好贴6张。
贴好纸片后，需在15min内置35℃培养箱内培养。
培养时，平板需在培养箱内单独摆放，否则中间的平板达不到培养箱内的温度而产生预扩散作用，平板培养18～24h后，读取结果。
四、结果判定培养后取出平板，测量抑菌圈的直径。
抑菌圈的边缘以肉眼看不到细菌明显生长为限。
有的菌株可出现蔓延生长进入抑菌圈，磺胺类药的抑菌圈内会出现轻微生长，这些均不作为抑菌圈边缘。
按抑菌圈直径判断细菌的敏感性。
五．实验结果多黏菌素 9.61 低敏诺氟沙星 23.58 高敏泰乐菌素23.63 高敏六、结果分析与讨论1.抗菌药物敏感性试验方法－纸片扩散法药敏试验，是指对敏感性不能预测的分离菌株进行试验，测试抗菌药在体外对病原微生物有无抑制作用，以指导选择治疗药物和了解区域内常见病原菌耐药性变迁，有助于经验性治疗选药。
抗菌药物敏感性试验方法很多，常见有纸片扩散法，稀释法，E试验。
本实验中采用纸片扩散法，操作简便，所需器材简单。
通过此试验可以帮助我们学习了解细菌对药物的敏感试验的常用方法，并根据这一原理,测定抗菌药物的质量,防伪劣假冒产品和过期失效药物。
2.实验中大肠杆菌的耐药情况大肠杆菌对24种抗菌药物的敏感性如上表所示。
从表中可以看出，大肠杆菌对多粘菌素的敏感性较低外，对诺氟沙星、新霉素、氟苯尼考、卡那霉素、泰乐菌素等5种抗菌药物抗菌药物都显示很高的敏感性。
由此可见，实验中所采用的大肠杆菌还未产生明显的耐药性。
该株大肠杆菌对多粘菌素的敏感性明显降低，说明其耐药性有上升趋势，应注重平时抗生素的合理使用。
3.实验中抗生素的主要作用诺氟沙星具广谱抗菌作用，尤其对需氧革兰阴性杆菌的抗菌活性高，对肠杆菌科的大部分细菌在体外具良好抗菌作用，体外对多重耐药菌亦具抗菌活性。
诺氟沙星为杀菌剂，通过作用于细菌DNA螺旋酶的A亚单位，抑制DNA的合成和复制而导致细菌死亡。
新霉素对葡萄球菌、棒状杆菌属有良好作用，对大肠埃希菌、克雷伯菌属、变形杆菌属等肠杆菌科细菌亦有良好作用，对各组链球菌、肺炎链球菌、肠球菌属等活性差，铜绿假单胞菌、厌氧菌等对本品耐药。
链霉素对许多革兰阴性杆菌如大肠埃希菌、克雷伯菌属、变形杆菌属、肠杆菌属、沙门菌属、志贺菌属、布鲁菌属、巴斯德杆菌属等也具抗菌作用；脑膜炎奈瑟菌和淋病奈瑟菌亦对该品敏感。
链霉素对葡萄球菌属及其他革兰阳性球菌的作用差。
各组链球菌、铜绿假单胞菌和厌氧菌对该品耐药。
氟苯尼考对多种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌及支原体等均有作用。
泰乐菌素在临床上主要用于治疗和预防由支原体、金黄葡萄球菌、化脓杆菌、肺炎双球菌、丹毒杆菌、副嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟氏菌、巴氏杆菌、螺旋体、球虫等病原体引起的各种呼吸道、肠道、生殖道和运动系统感染。
并且对预防和治疗畜禽在暴发病毒性疾病时支原体的继发感染有很好疗效，是世界公认治疗和预防畜禽支原体感染的首选药物，效果优于红霉素和泰妙菌素。
种呼吸道、肠道、生殖道和运动系统感染。
并且对预防和治疗畜禽在暴发病毒性疾病时支原体的继发感染有很好疗效，是世界公认治疗和预防畜禽支原体感染的首选药物，效果优于红霉素和泰妙菌素。
4.控制细菌耐药性的主要对策[3~6]4.1 普及相关医疗知识，合理使用抗菌药物细菌耐药性的出现主要是在临床上滥用抗生素的结果。
特别是在畜禽养殖业中，基层人员缺乏相关的知识，认为只要加大剂量、延长疗程使用就一定能控制疾病，而全然不考虑药物的残留和耐药性的产生。
因此，应加强基层医务人员的相关医疗知识，用药时要严格掌握适应症、适当的剂量和疗程，既要避免剂量过大造成的药物浪费和毒性反应的出现，又要注意剂量不足而导致疾病的复发及耐药性的产生。
严格掌握抗菌药物的局部用药、预防用药和联合用药，避免滥用。
在控制动物疾病时尽量减少抗菌药物的使用，最好的方法是改善动物的饲养条件，防止疾病发生。
4.2 加强药政管理严格控制抗菌药物的审批、生产标准，加强抗菌药物的质量监督，控制抗菌药物的使用管理。
4.3 研制和开发新的药物根据细菌耐药性的发生机制及其与抗菌药物结构的关系，寻找和研制具有抗菌活性，尤其对耐药菌有活性的新抗菌药；同时可以针对某些因细菌灭活酶而失效的抗菌药物，寻找适当的酶抑制剂，与抗菌药物联合应用时可保护药物不受灭活酶的破坏而保存其抗菌活性。
4.4 开发不使用抗菌药来治疗感染的治疗策略药敏试验方法（Kirby-Bauer法）：1、试验材料：（1）培养基：Kirby-Bauer法指定用Mueller-Hinton琼脂，该培养基具有对大多数细菌生长良好、不拮抗药物活性以及商品批间差小等优点。
配制方法见培养基配制。
（2）药物纸片：直径为6.00～6.35mm,每片吸水量约20μl。
（3）质控菌株：金黄色葡萄球菌ATCC25923，大肠埃希菌ATCC25922，铜绿假单胞菌ATCC27853。
测定M—H琼脂是否适合做磺胺类试验须用粪链球菌ATCC29212或33186，上述菌株可向卫生部或省临床检验中心购买。
质控菌株保存方法：将新得到的冻干菌株接种含血的M—H平板复活，然后每株细菌接种10支高层琼脂，放冰箱保存，每月取1支，传种细菌供常规使用，待用至最后1支再传代在M—H平板上接种一批高层琼脂备用。
（4）菌液比浊管：为保证药敏试验的准确度和精密度，必须对接种菌液的浓度做相应控制，采用比浊法来控制菌悬液浓度，接种浓度 1.5×108 ml，浊度相当于麦氏标准管第一号的1/2，比浊管配制方法如下：0.048mol/L BaCl2 0.5ml和0.18mol/L H2SO4 99.5ml，将两液混合，置螺口试管中或普通试管玻璃纸加塞后，再用石蜡封住，放室温保存。
用前混匀。
有效期6个月。
（相当于1/2号比浊管）2、操作方法：（1）制备接种菌液：挑临床标本中分纯的菌落4～5个于M—H液体培养基中，置35℃水浴箱孵育4小时，校正浊度。
或用接种环挑取菌落悬浮于生理盐水中，振荡混匀后与标准比浊管比浊，以有黑字的白纸为背景，调整浊度与比浊管相同。
（2）接种平板：用无菌的棉试子蘸取菌液，在管壁上旋转挤压去掉多余的菌液，用棉拭子涂布整个培养基表面，反复三次，每次将平板旋转60度，最后沿平板边缘绕两圈。