链球菌属纸片扩散法药物敏感试验标准操作规程

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药敏试验的步骤

药敏试验的步骤药敏试验药敏纸片法药敏纸片法是最常用的一种试验方法,能直接体现出抗菌药物的抗菌效用,其优点是：直观明显,对比鲜明，有一定的实验依据。

缺点是：仅表现体外抗菌效果,由于抗菌药物在体内受体液环境,代谢分布,组织扩散浓度,半衰期等因素的影响,个别药物并不能真实反应出实际的抗菌疗效。

下面介绍抗菌药物的药敏纸片法。

试验材料经分离和鉴定后的纯培养菌株(例如大肠杆菌、链球菌等),营养肉汤,琼脂平皿,棉拭子,镊子,酒精灯, 药敏纸片若干。

1.1药敏纸片的制作方法将要试验的抗菌药物按其有效浓度稀释成1mL备用，脂溶性的抗菌药物使用乙醇或丙酮溶解。

用打孔器将滤纸打成6mm直径的圆片100张高压灭菌，加入到抗菌药物有效浓度1mL稀释液中充分混合，阴凉处干燥备用。

多种联合的抗菌药物制剂以其成分中某种含量最高的抗菌药物为标准稀释成有效浓度。

抗菌中草药药敏纸片的制作：取中草药粉剂1g加适量的水充分浸泡煮沸，滤液浓缩成1mL，也加入100张纸片干燥备用。

1.2药敏试验的操作步骤1.2.1 取自然发病动物的病料心血、脾、肝脏、淋巴结或病变明显的组织无菌操作接种鉴别培养基37℃分离培养24h，选典型菌落备用。

1.2.2 将病料中分离出的病原菌用密集划线法或涂布法接种至专用琼脂平板培养基上，均匀的粘贴各药敏纸片，并记录每种抗菌药物药敏纸片的位置。

1.2.3 37℃培养12～18h，取出观察结果。

1.3判定结果1.3.1 量取各药敏纸片抑菌直径大小，并仔细观察抑菌圈的清晰度,通常直径小于10mm的判为该抗菌药物为低度敏感,10～15mm之间为中度敏感，15～25mm为高度敏感，25mm以上为极度敏感。

1.3.2 抑菌圈边缘分界清晰，内部洁净透明,说明该抗菌药物作用迅速，多半为杀菌剂；边缘十分清晰，内部朦胧说明该抗菌药物可能是慢效抑菌剂或有耐药的产生，或分解较快维持抗菌时间短。

1.3.3 抑菌圈中分层次形成同心年轮样，说明可能是联合使用抗菌药物或该抗菌药物失效过快或细菌产生了耐药性。

纸片扩散法药敏试验

纸片扩散法药敏试验一、原理纸片扩散法是将含有定量抗菌药物的滤纸片贴在已接种了测试菌的琼脂表面上，纸片中的药物在琼脂中扩散，随着扩散距离的增加，抗菌药物的浓度呈对数减少，从而在纸片的周围形成一种浓度梯度。

在药物扩散的同时，纸片周围抑菌浓度范围内的测试菌不能生长，而抑菌浓度范围外的菌株则继续生长，从而在纸片的周围形成透明的抑菌圈。

不同抗菌药物抑菌圈的直径因受药物在琼脂中的扩散速率的影响而可能不同，抑菌圈的大小可反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的最低抑菌浓度（MIC）呈负相关，即抑菌圈越大，MIC越小。

二、进行药敏实验指征为保证治疗效果，对引起感染的任何病原菌，若不能从该菌的种属特征可靠地推知其对抗菌药物的敏感性，就需要进行药敏试验。

尤其当病原菌属于对常用抗菌药物能产生耐药时，就更需进行药敏试验。

若感染是公认的对某一高效抗菌药物敏感的微生物引起的，就很少需要进行药敏试验了。

三、标本要求参加药敏试验的菌株包括从临床标本中分离的常见的、快生长的菌株，如肠杆菌科菌、葡萄球菌、肠球菌、非发酵糖菌；还包括某些苛养的病原菌，如流感嗜血杆菌、肺炎链球菌及其他链球菌、淋病奈瑟菌等。

标本内的正常菌群，通常不作药敏。

对每一种可能致病的细菌进行敏感试验时，使用的单个菌落都应选自原始的琼脂平板，鉴定种属的过程常与此同时进行。

不同菌种的混合物不能在同一药敏平皿上进行试验。

除非在临床急症患者的标本（如阳性血培养物）经涂片革兰染色提示单一的病原菌，一般应避免直接用临床标本（如无菌体液和尿液）做药敏试验。

若用临床标本作了直接药敏试验，也必须按标准方法重复第二次药敏。

四、选药原则详见临床实验室标准化研究所（CLSI）对各种非苛养菌和苛养菌进行常规药敏试验和报告时的选药指南表。

表中的抗菌药物可满足绝大多数临床实验室的常规需要，在此表中各种抗菌药物针对具体的菌种或菌群被分成许多纵列，每一列又根据不同的选择要求分成A、B、C、U等不同的组，其中A组药物用于常规和首选试验，其结果也应常规报告。

纸片琼脂扩散法检测抗菌药物敏感试验方法分析

纸片琼脂扩散法检测抗菌药物敏感试验方法分析发表时间：2013-05-21T09:52:49.343Z 来源：《中外健康文摘》2013年第12期供稿作者：刘海珠杨燕徐建利[导读] 接种菌量加大可使抑菌圈减小，反之可使抑菌圈扩大。

刘海珠杨燕徐建利 (山东省威海市立医院264200)【中图分类号】R978.5 【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2013）12-0154-02【关键词】抗菌药物敏感试验方法抗菌药物敏感试验(AST)是指在体外测定药物抑制或杀死细菌能力的试验，纸片琼脂扩散法又称K－B法，是将含有一定量抗菌药物的纸片贴在已接种待测菌的琼脂平板表面，药物将在培养基中由纸片往周围扩散，且浓度递减。

在抑菌浓度范围内待测菌的生长被抑制，形成透明的抑菌圈。

根据抑菌圈的大小可判断待测菌对测定药物的敏感程度[1]。

该法操作简便、选药灵活，适用于快速生长的需氧菌及兼性厌氧菌。

1 实验材料抗菌药物纸片选择直径6.35mm，吸水量20μL的专用药敏纸片，灭菌后，经逐片加样或浸泡的方法使每片的含药量相当于所示浓度。

纸片冷冻干燥后储藏于密封瓶内，－20℃保存。

日常工作用的少量纸片可保存于4℃冰箱内，1周内使用。

培养基水解酪蛋白(M－H)培养基是CLSI推荐采用的需氧菌和兼性厌氧菌药敏试验标准培养基，pH7.2～7.4，溶化后倾注平板(琼脂厚度为4 mm)。

使用前应将琼脂平板放入35℃孵育至表面干燥。

药敏试验菌液：浓度应为0.5麦氏比浊标准。

①生长法：挑取已分离纯化的菌落4～5个，接种于3～5mLM－H肉汤中，35℃孵育4h，用生理盐水或肉汤校正菌液浓度至0.5麦氏比浊标准。

②直接调制法：用接种环挑取纯菌落数个，混悬于生理盐水或肉汤中，充分混匀并调整浓度为0.5麦氏比浊标准[1]。

2 实验方法2.1接种以无菌棉拭子蘸取试验菌液，在管内壁旋转挤压除去多余的菌液后，涂布于整个M－H琼脂平板表面，涂布3次，每次旋转平板60°，最后沿平板边缘涂抹1圈。

药敏试验纸片扩散法操作步骤

药敏试验纸片扩散法操作步骤
药敏试验纸片扩散法是一种常用的检测细菌对抗生素敏感性的方法，其操作步骤如下：
1. 准备培养基：根据需要选择合适的培养基，如Mueller-Hinton（MH）琼脂（常用于细菌药敏试验）。

按照制造商的
说明溶解固体培养基，并加入适当量的琼脂（通常为2%），
将其加热溶解，然后用无菌盘口装好。

2. 菌液制备：从培养基上的细菌菌落中接种一根病菌棒，将其浸入含有3-5毫升无菌盐水的试管中。

3. 菌液浓度调整：将试管中的细菌菌液用比例稀释至合适的浓度（通常为0.5麦克百尼尔/毫升）。

4. 纸片扩散：用无菌的棉签将稀释后的菌液均匀地涂抹在一块布拉格琼脂平板上，然后在琼脂上按要求摆放敏感纸片（一般为阿莫西林、头孢菌素等常用抗生素），注意要与纸片相距一定距离。

5. 培养：将布拉格琼脂平板反面朝上，用无菌培养皿盖好，然后放入恒温培养箱中进行孵育。

通常在35-37°C条件下培养
24小时。

6. 结果录入和解读：观察纸片周围的细菌生长情况，通过测量纸片周围形成的抑制圈直径来评估细菌对不同抗生素的敏感性。

根据抑制圈的直径大小，将细菌的敏感性分为敏感、中等和耐
药三个等级。

注意事项：
- 操作过程需要严格无菌，以免细菌的外源污染影响结果。

- 确保培养皿紧闭，避免细菌的空气传播。

- 操作前后要做好清洁，避免微生物交叉感染。

- 移栽过程要注意避光，避免紫外线对细胞的破坏。

药敏试验操作方法

药敏试验操作方法药敏试验是一种常用的实验方法，用于确定某种药物对细菌的敏感性或抗性。

下面是药敏试验的一般操作方法：1. 菌株的培养与准备：首先，选择要测试的细菌株。

常用的菌株包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等。

将菌株从冻存状态中转移到琼脂平板上进行培养，然后选取单个菌落进行继续培养。

2. 制备药物浓度梯度：为了测试细菌对不同浓度药物的敏感性，需要制备一系列药物浓度梯度。

可以选择常用的抗生素，如青霉素、利福平等。

根据药物的最小抑菌浓度（MIC）确定所需药物的最高浓度。

3. 制备洗涤液：制备1倍洗涤液，一般使用生理盐水或缓冲液。

如要进行中药药敏试验，可根据实验需求选择适当的提取液。

4. 制备菌悬液：从培养得到的菌落中选择单个菌落，接种到含有洗涤液的试管或培养皿中。

使用比例约为1:100（菌悬液：洗涤液），均匀混合。

5. 药物与细菌接触：将制备好的菌悬液均匀涂布在琼脂平板上，然后使用定量器将一定量的药物滴在琼脂平板上。

确定滴药量时应根据具体药物的MIC进行调整。

6. 培养与观察结果：将涂有菌悬液和药物的琼脂平板进行孵育，时间和温度可以根据具体的实验目的和菌株要求进行调整。

观察培养后的平板上是否出现菌落生长，以及菌落的数量和形态特征。

7. 结果解读与分析：根据观察到的结果，分析不同浓度药物对细菌的抑菌效果，评估细菌对药物的敏感性。

可以根据菌落的出现与否、数量的多少和生长的形态特征来判断细菌是否对药物敏感。

总结：药敏试验是一种重要的实验方法，可以评估细菌对药物的敏感性或抗性。

操作时需要注意菌株的选择和培养方法、药物浓度的制备、菌悬液的制备和药物与细菌的接触方法，以及培养和观察结果等。

通过药敏试验的结果，可以帮助医生选择适当的药物治疗感染病情。

纸片扩散法药物敏感试验

纸片扩散法药物敏感试验若只根据是否出现抑菌环而不考虑抑菌环的直径大小来判断细菌是否对抗菌药物敏感的实验方法，其结果是不正确的。

而纸片扩散法试验是应用标准的方法学原理，根据抑菌环直径大小与最低抑菌浓度的相关性，结合临床上已知敏感或耐药菌株的状态，其结果是可靠的。

WHO推荐K-B法，其目的在于技术的简单和可重复性。

本法特别适用于肠杆菌科细菌，也可用于快速生长的致病菌，但不适用于其他细菌，如嗜血杆菌、奈瑟菌、专性厌氧菌及酵母样菌等。

无论用哪种方法接种，只要质控菌株的抑菌环在预期范围内，均可按同一解释标准报告结果。

但并非从感染患者分离到的微生物都必须做敏感试验，对于污染、机体共生的正常细菌群和那些与感染无关的细菌，可不必做敏感试验，只有那些被认为引起感染的微生物，应先分离提纯、鉴定菌种后再做敏感试验。

试验方法：一、试验材料：(一)培养基：Kirby-Bauer法指定用Mueller-Hinton琼脂。

多年大量的有关敏感试验的方法学研究，均采用该培养基；维持细菌正常发育，绝大多数细菌在此培养基上生长良好。

此培养基不拮抗抗菌药物活性以及商品的批次间差异等方面均优于其他培养基。

若检测肺炎链球菌的敏感性时，须在培养基中加5％的脱纤维羊血，制成血平板。

测嗜血杆菌及淋病奈瑟菌的敏感性时，在培养基中须加入1％血红素和 2.5mg/ml 辅酶I后应校正pH 7.2～7.4。

制备MH琼脂平板应用直径90cm平皿。

在水平的实验台上倾制。

琼脂厚为4mm，允许误差为土1mm。

琼脂凝固后，应测一下pH。

琼脂于板应放4℃保存，在7日内用完。

若当天不用，用塑料袋密封包装贮藏于冰箱（2-8℃）。

每批平板都应抽样，在30-50℃下培养24h或更长时间检查是否被感染。

MH琼脂培养基配方(1L)：Beef Extract 2.0g Acid Hydrolysis of Casein 17.5gStarch 1.5g Agar 17.0gFinal PH 7.3 at 25℃高压灭菌后立即水浴冷却至45-50℃。

纸片法抗菌药物敏感实验操作标准

纸片法抗菌药物敏感实验操作标准4.３标准比浊管用硫酸钡比浊管(０、5麦氏比浊标准),标定接种菌液浓度。

比浊管制备方法如下:(１)0、048mｏl/L BaＣｌ2,(１、175% w／v BaＣｌ2·2H2O)0、５ml,加到99、5ml的０、18 mol/Ｌ(0.3６N)H2SＯ4(1％v/ｖ)溶液中,制成比浊管;(2)用光径为1cｍ的分光光度计测定光吸收来标定比浊管。

0、5麦氏标准比浊管在６25nｍ波长的吸收光度应为0、0８-0、1;(3)选管径与制备菌液试管相同的螺口试管,每管分装4-6ml;(4)将试管帽拧紧,放室温暗处保存;(5)用前,将比浊管在旋转振荡器上混匀。

如出现大颗粒,应更换;(6)每个月更换比浊管或复检比浊管的浊度。

５操作步骤5、1 制备接种菌液5、1、１增菌法步骤如下:(1)选琼脂平板上形态相同的菌落至少4-5个,用接种环挑其顶部,移至4－5ml肉汤或大豆酪蛋白消化液中;(２)置35℃培养至菌液浓度达到或超过比浊管浓度(一般需2－6小时),浓度约1－２×10８CFU/ml;(３)用生理盐水或肉汤校正菌液浓度,与比浊管相同。

可用光电比浊。

目测比浊须在适当光照下以黑色线条为反衬。

5、１、2 直接菌悬液法步骤如下:(1)做常规药敏试验,可直接用过夜培养的菌落(必须用无选择性培养基平板,如普通琼脂培养基)在盐水或肉汤中制备接种菌液。

菌液浓度调至0、5麦氏管;(2)此法适用于在肉汤培养基中生长不好的细菌如嗜血杆菌、淋病奈瑟氏菌与链球菌及葡萄球菌的甲氧苯青霉素或苯唑青霉素的耐药试验;(３)当用此法做复方磺胺药的试验时,从平板上直接挑菌落时会携带相当量的拮抗剂,造成敏感菌株的抑菌环内出现轻微的生长菌膜。

５.2 接种平板步骤如下:(1)校正的菌液须在15分钟内使用。

用一无菌棉试子蘸取菌液并在上端管壁旋转挤压几次,去掉过多的菌液;(2)用试子涂布整个琼脂平板表面,反复涂布几次,每次将平皿旋转60度,保证涂布均匀。

纸片扩散法药敏试验

纸片扩散法药敏试验纸片扩散法（K-B法）药物敏感试验是在涂有细菌的琼脂平板培养基上按照一定要求贴浸有抗菌药的纸片，培养一段时间后测量抑菌圈大小，并根据相关解释标准进行结果分析，从而得出受试菌株药物敏感性的结论。

中文名纸片扩散法药敏试验临床意义得出受试菌株药物敏感性的结论目录.1试验原理.2试验步骤.3结果分析.4注意事项基本信息中文名纸片扩散法药敏试验临床意义得出受试菌株药物敏感性的结论试验原理纸片扩散药敏试验的原理：将含有定量的抗菌药物的纸片贴在接种有待测菌的固体培养基上，通过抗菌药物在培养基上的扩散，观察是否出现抑菌环，推断是否抑制细菌的生长。

药物扩散的距离越远，药物浓度越低抑菌能力越强，因此可根据抑菌环的大小，判定药物对细菌的抑制作用强弱。

试验步骤1. 待测菌株接种物制备（1）通用情况：从过夜孵育的平板，优先选择哥伦比亚血琼脂平板上的菌落上挑取数个单个菌落，直接接种4.5%生理盐水制成菌悬液，使用比浊仪调整悬液的浊度使其达到0.5麦氏单位，使菌悬液中含有相当于ATCC 25922大肠埃希菌（1-2）*1012CFU/mL浓度。

（2）特殊情况：嗜血杆菌属（本程序中所指的嗜血杆菌仅包括流感嗜血杆菌、副流感嗜血杆菌）：从过夜孵育的HTM平板，直接接种4.5%生理盐水制成菌悬液，使用比浊仪调整悬液的浊度使其达到0.5麦氏单位，使菌悬液中含有相当于ATCC 25922大肠埃希菌（1-2）*1012CFU/mL浓度。

2.接种平板（1）调整好悬液的浊度后，用无菌棉签浸入悬液内，紧贴试管内壁在液体上方旋转拭子数次，除去棉签上多余的液体，但也应适度。

（2）用拭子划线整个琼脂表面，从平板顶部到底部，均匀涂布，重复两次此过程（一共三次）每次旋转平板约60度，确保每次接种菌液均匀分布，最后在琼脂平板的边缘涂抹一圈，防止有流动的菌悬液，并使菌液涂布于整块平板的每个角落。

（3）涂布菌液完成的平板，可在室温放置一会（3-5分钟），以便在放置含有药物的纸片前使琼脂吸收表面多余的水分，但放置时间不应超过15分钟。

纸片扩散法药敏试验

药物扩散的距离越远，药物浓度越低抑菌能力越强，因此可根据抑菌环的大小，判定药物对细菌的抑制作用强弱。

2.接种平板（1）调整好悬液的浊度后，用无菌棉签浸入悬液内，紧贴试管内壁在液体上方旋转拭子数次，除去棉签上多余的液体，但也应适度。

（3）涂布菌液完成的平板，可在室温放置一会（3-5分钟），以便在放置含有药物的纸片前使琼脂吸收表面多余的水分，但放置时间不应超过15分钟。

纸片扩散法药敏试验操作程序

纸片扩散法药敏试验操作程序1.目的规范纸片扩散法（K-B法）药敏试验标准操作程序，确保药敏结果准确。

2.原理将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种待检菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分溶解后会不断地向纸片周围区域扩散，形成递减的梯度浓度，在纸片周围抑菌浓度范围内待检菌的生长被抑制，从而产生透明的抑菌圈。

抑菌圈的大小反映待检菌对测定药物的敏感程度，并与该药物对待检菌的最低抑菌浓度（MIC）呈负相关，即抑菌圈越大，MIC越小。

3.设备、材料和试剂3.1.设备、材料恒温培养箱、比浊仪、0.45%NaCl、一次性使用拭子、无菌医用棉签、游标卡尺、镊子3.2.药敏纸片药敏纸片为直径6mm、吸水量为0.02ml的商品化专用药敏纸片（OXOID）；纸片需密封贮存于-20℃冰箱内；开封后的纸片与干燥剂一起置2℃-8℃冰箱保存；每次使用前先室温平衡1-2h，以避免开启贮存容器时产生冷凝水。

3.3.培养基自配或购买的水解酪蛋白（Mueller-Hinton，M-H）培养基是CLSI推荐的兼性厌氧菌和需氧菌药敏试验标准培养基，PH为7.2-7.4。

3.4.接种菌量比浊标准菌液浓度为1.5×108/ml，相当于0.5麦氏单位标准。

4.菌悬液制备4.1.制备接种菌液：临床标本分离的细菌或标准菌株做药敏试验时，应挑取已分纯的菌落4-5个制备菌悬液。

4.1.1.直接菌落法：用一次性拭子挑取生长在无选择性琼脂平板上新鲜菌落，悬浮于0.45%生理盐水中，混匀后，采用比浊仪调整浊度至0.5麦氏浊度。

4.1.2.肉汤增菌法：将单个菌落接种至肉汤培养基，置于35℃孵育，采用比浊仪调整浊度至0.5麦氏浊度（通常孵育2-6h）。

5.实验方法常用在检测菌或标准菌株平板上挑取培养18~24h的纯菌落均匀溶解于3ml 0.45%无菌生理盐水中，调校浓度至0.5麦氏单位；校正后的菌液应在15min内接种。

5.1.接种用无菌医用棉签蘸取调好的菌液，在试管内壁将多余的菌液旋转挤去后在琼脂表面均匀涂布接种3次，每次旋转平板60°，最后沿平板边缘涂抹1周，校正浓度后的菌液在15min内接种完毕。

纸片扩散法抗生素敏感试验标准操作程序

SOP_15-25 纸片扩散法（K-B法）抗生素敏感试验标准操作程序【目的】用于分离菌的抗生素敏感试验。

【适用范围】WHO推荐K-B法，其目的在于技术的简单和可重复性。

本法特别适用于肠杆菌科细菌，也可用于快速生长的致病菌，但不适用于其他细菌，如嗜血杆菌、奈瑟菌、专性厌氧菌及酵母样菌等。

无论用哪种方法接种，只要质控菌株的抑菌环在预期范围内，均可按同一解释标准报告结果。

【该SOP变动程序】本标准操作程序的改动,可由任一使用本SOP的工作人员提出,并报经下述人员批准签字：专业主管、科主任。

【试验用材料】1.培养基Kirby-Bauer法指定用Mueller-Hinton琼脂。

多年大量的有关敏感试验的方法学研究，均采用该培养基，维持细菌正常发育，绝大多数细菌在此培养基上生长良好。

此培养基不拮抗抗菌药物活性以及商品的批间差异等方面均优于其他培养基。

若检测肺炎链球菌的敏感性时，在培养基中加5％的脱纤维羊血，制成血平板。

测嗜血杆菌及淋病奈瑟菌的敏感性时，在培养基中须加入1％血红素和2.5mg/ml辅酶I后应校正pH 7.2～7.4。

制备MH琼脂平板应用直径90cm平皿。

在水平的实验台上倾制。

琼脂厚为4mm，允许误差为土lmm。

琼脂凝固后，应测一下pH是否正确。

琼脂于板应放4℃保存，在7日内用完。

2.药物纸片抗菌药物纸片直径约为6.00～6.35mm，每片的吸水量约20μl。

采用K-B法，纸片的药物含量必须与该法规定的一致，不得任意更改。

药物纸片可以购买，也可自制，用前必须做质量鉴定。

用以下两个指标判定纸片的质量：2.1片间差：是衡量不同纸片含药是否均一的指标。

测定方法：以质控菌株接种M-H琼脂平板，一块平板上贴6张相同的纸片。

35C过夜，培养后，记录6个抑菌直径，其最大和最小之差不应大于1～2mm。

2.2准确度:判定纸片的实际含药量与标量是否一致。

纸片的合理保存十分重要。

药物纸片必须在有干燥剂的容器内低温(-10℃以下)保存。

临床各种属细菌的药敏试验方法和试验条件

临床各种属细菌的药敏试验方法和试验条件1.采用自动化仪器法和梯度扩散法等进行药敏试验需遵照厂家说明书。

自动化仪器法通常只能用于常见细菌，而梯度扩散法可用于苛养菌和少见菌的药敏试验，但需要获得相关管理部门的批件。

2.检测达托霉素时，培养基加入50 mg/L的钙离子；检测磷霉素时，加入25 mg/L的6-磷酸葡萄糖；检测达巴万星和奥利万星时，加入0.002%的聚山梨醇酯-80。

3.纸片扩散法、琼脂稀释法和肉汤稀释法检测苯唑西林和万古霉素的敏感性宜孵育24 h。

纸片扩散法检测头孢西丁的敏感性和凝固酶阴性葡萄球菌对所有抗菌药物的敏感性孵育24 h。

4.检测葡萄球菌属对苯唑西林的敏感性，须在CAMHB加入2%NaCl。

5.嗜血杆菌属若检测甲氧苄啶或磺胺甲噁唑，培养基中加入0.2 IU胸苷磷酸化酶。

HTM 肉汤为CAMHB中加入15 mg/L的β-NAD、15 mg/L的牛血红素或猪血红素、5 g/L的酵母提取物。

6.淋病奈瑟菌可采用CAMHB或pH7.0 的0.9%的磷酸盐缓冲液配制菌悬液。

纸片扩散法1%的特定生长添加剂不宜含半胱氨酸；琼脂稀释法检测碳青霉烯类和克拉维酸时宜含半胱氨酸；检测其他抗菌药物，是否含有半胱氨酸对检测结果影响不大。

特定生长添加剂配制方法如下：将1.1 g左旋胱氨酸、0.03 g盐酸鸟嘌呤、0.003 g盐酸硫胺素、0.013 g对氨基苯甲酸、0.01 g维生素B12、0.1 g焦磷酸硫胺素、0.25 gNAD、1 g腺嘌呤、10 g左旋谷氨酰胺、100 g葡萄糖、0.02 g硝酸铁和25.9 g左旋半胱氨酸溶于1L无菌去离子水中，搅拌混匀。

7.嗜盐弧菌属采用0.85%NaCl溶液制备0.5 麦氏单位标准菌悬液。

8.幽门螺杆菌采用0.85%NaCl溶液配制成2.0 麦氏浊度单位菌悬液。

9.潜在生物恐怖病原菌送至生物安全II级BSL-2 以上的实验室进行操作。

对极易产生气溶胶的操作在BSL-3 实验室进行。

药敏试验---纸片扩散法

药敏试验---纸片扩散法实践六药敏试验---纸片扩散法实验目的:学习了解细菌对药物的敏感试验的常用方法。

学习对药物的敏感试验的操纸片法作方法。

实验内容与基本要求:药物敏感试验的操法方法.抗菌药物在疾病防治上已得到了广泛的使用,但是对某种抗菌药物长期或不合理地使用,可引起这些细菌产生耐药性,。

如果盲目地滥用抗菌药物,不仅造成药物的浪费,同时也贻误了治疗时机。

药物敏感试验,是一项药物体外抗菌作用的测定技术,通过本试验,可选用最敏感的药物进行临诊治疗, 同时也可根据这一原理,测定抗菌药物的质量,防伪劣假冒产品和过期失效药物。

主要器材与药品器材:试管架、试管、平皿、接种环、镊子、普通琼脂培养基或特殊培养基等。

药品:药敏试纸，被试细菌。

经分离和鉴定后的纯培养菌株(例如大肠杆菌、链球菌等)，黄色葡萄球菌、痢疾杆菌18,24小时培养物、普通琼脂平板、小镊子;含有青霉素、庆大霉素、红霉素、复合磺胺、链霉素等抗生素的干燥滤纸片。

,营养肉汤,琼脂平皿,棉拭子,镊子,酒精灯, 药敏纸片若干。

原理:又称Bauer-Kirby法。

是将干燥的浸有一定浓度抗菌药物的滤纸片放在已接种一定量某种细菌的琼脂平板上，经培养后，可在纸片周围出现无细菌生长区，称抑菌圈。

测量抑菌圈的大小，测量各种药敏纸片抑菌圈直径的大小(以毫米表示)，即可判定该细菌对某种药物的敏感程度。

体外药敏结果可作为动物选用药物的参考。

方法(1)将金黄色葡萄球菌、痢疾杆菌培养物密集均匀地涂布整个平板，也可以挑取待试细菌于少量灭菌生理盐水中制成细菌混悬液，用灭菌的棉拭子沾取菌液涂布到上述培养基表面，尽可能涂布的致密而均匀。

(2)将含有抗生素药物的滤纸片用烧灼灭菌的镊子分别贴于平板表面，相互间应间隔一定距离，为了抗菌纸药片与培养基表面密贴，可用镊子轻按下纸片。

纸片在培养基上的分布，一般可为中央贴一种纸片，外周以等距离贴若干种纸片，这样一个直径为90mm平板可贴6,7个抗菌药纸片。

链球菌属纸片扩散法药物敏感试验标准操作规程

链球菌属纸片扩散法药物敏感试验标准操作规程1．目的规范链球菌属纸片扩散法药物敏感试验标准操作规程，确保药敏结果的准确。

2．适用范围本操作规程适用于链球菌属的细菌。

3．选药原则在本规程所列受试抗菌药物主要根据以下因素选择。

3.1 现行版本的 CLSI M02 和 M100对链球菌属纸片扩散法药物敏感试验的要求。

3.2 本单位处方手册中的抗菌药物名册。

3.3 本单位上一年度链球菌属细菌耐药监控数据。

4．质控纸片药敏试验应使用肺炎链球菌ATCC49619 进行质量控制，质控菌株可接受的抑菌圈范围参见现行版本的CLSI M100-A19 。

5．材料和仪器加 5%羊血的 MHA 培养基、无菌生理盐水、药敏纸片、无菌棉签、 35℃孵育箱、测量尺、标准比浊管或比浊仪。

6．操作步骤参见《药物敏感性试验标准操作规程》。

7．判断标准见表 5-52.表 5-52 葡萄球菌属细菌纸片扩散试验判断标准判断标准（ mm）药敏纸片备注敏感（ S）中介（I）耐药（ R）青霉素（ 10U）≥24参见结果解释 9.1头孢曲松（ 30μg）≥24红霉素（ 15μg）≥2116~20≤15参见结果解释 9.2 9.3克林霉素（2μg）≥1916~18≤ 15参见结果解释9.29.3万古霉素（ 30μg）≥17左氧氟沙星（ 5μg）≥ 1714~16≤13 8．注意事项抑菌圈直径量取的范围为包括药敏纸片在内的被药物完全抑制的区域（肉眼判断）。

量取时应打开药敏平板盖子，用反射光源，用肉眼观测，从上侧测量抑菌圈直径。

测量区域应为肉眼观察无明显可见菌落生长的区域，忽略只有用放大镜才能观察到的位于抑菌圈外缘的细菌菌落。

9．结果解释9.1对青霉素敏感的链球菌菌株可以认为对氨苄西林、阿莫西林、阿莫西林-克拉维酸、氨苄西林 - 舒巴坦、头孢克洛、头孢唑林、头孢迪尼、头孢吡肟、头孢罗齐、头孢噻肟、头孢布坦（仅对 A 群链球菌）、头孢曲松、头孢呋新、头孢泊肟、头孢唑肟、头孢噻吩、头孢吡硫、厄他培南、亚胺培南、洛拉卡比、美罗培南等抗菌药敏感，无需对这些抗菌药进行药物敏感试验。

K-B纸片扩散法药敏试验技术要点

4.2.1如果是加血的MH琼脂培养基（如对链球菌），则应在透射光照射下，打开培养皿盖，从上表面测量抑菌圈。
4.2.2如果被测菌是葡萄球菌或肠球菌，则应孵育24小时，再在透射光下分别观察苯唑西林或万古霉素的透明抑菌圈内有无耐甲氧西林或耐万古霉素菌落的微弱生长。抑菌圈内的任何可见的生长，都表示甲氧西林或万古霉素耐药。
贴完纸片后，应在15分钟内，将平板反转过来，置于35℃空气温箱中。但嗜血杆菌属、淋病奈瑟菌和链球菌药敏平板应置5%CO2 35℃孵育。
2菌液
2.1菌液的浓度对于任何细菌的药敏试验，将提纯的细菌配置成适当的浓度是得到正确结果的基本保证，菌液浓度过高会出现假性耐药，过低则会出现假性敏感。用分光光度计法测量菌液浓度非常精确，但无条件的中、小实验室仍采用麦氏比浊法：直接用肉汤或0.9%生理盐水制成悬液，调整至0.5麦氏标准管，或使用比浊仪调成0.5麦氏单位的标准菌液浓度。
K-B纸片扩散法药敏试验技术要点
近年来，由于抗生素、磺胺等抗菌药物广泛应用，导致了耐药菌株不断出现，正确、准确测定细菌对药物的敏感程度，对于临床治疗中选择用药、避免滥用药、及时有效地控制感染以及细菌鉴定，具有重要意义。
目前，细菌对抗生素敏感试验（以下简称药敏试验）的方法主要有：Etest法、稀释法、Kirby-BaueVitek、ATB等）进行药敏测试。但WHO推荐的是K-B纸片扩散法，因此方法具有多重优点，如重复性好、操作简单、试验成本相对较低、结果直观、容易判读、便于基层开展等。K-B纸片扩散法受药敏纸片质量、细菌浓度与纯度、培养基等诸多因素的影响较大[1]，如何提高K-B纸片扩散法药敏试验的准确性，现从以下几点加以阐述：
kb纸片扩散法药敏试验技术要点王莉新疆阿拉尔市人民医院检验科843300关键词细菌药敏试验kb纸片扩散法中图分类号r446文献标识码a文章编号20951752201325005902近年来由于抗生素磺胺等抗菌药物广泛应用导致了耐药菌株不断出现正确准确测定细菌对药物的敏感程度对于临床治疗中选择用药避免滥用药及时有效地控制感染以及细菌鉴定具有重要意义