鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验

至肉汤中.37'G振荡培养10小时。存活细菌密度可达1---2 X 109 l mI o
五菌株鉴定和保存
四种标准试验菌株必须进行基因型鉴定、自发回变数鉴定及对鉴别性致突变物的反
应鉴定，合格后才能用于致突变试验。
1.菌株基因型鉴定
}I)组氨酸营养缺陷鉴定(组氨酸需求试验):
取两个底层培养基、其中一组于培养基表面涂加0. 1毫升0.
培养基成分或试剂除说明外，应是化学纯，无诱变性。避免重复高温处理，选择适当
保存温度和期限。
2.培养基制备_
C1)营养肉汤培养基
牛肉膏2. 5g
胰陈(或混合蛋白膝)5. 0g
氯化钠2. 5g
磷酸氢二钾(KZHPO}.3H20 ) }. . 3 g
蒸馏水至500mL
加热溶解，调pH至7. 4，分装后0. 103MPa 20min灭菌，4℃保存备用。C2}?营养肉汤琼脂培养基:
迅速混匀，倒在底层培养基上，转动平皿使顶层培养基均匀分布在底层上，平放固化，37艺培养拐介时观察结果。
二，点试法
在攻层培养平皿上写上记号。取已融化并在45℃水浴中保温的顶层培养基一管(2m } )，加
人是试菌菌涛}_ }h-(_pmt }}}}(} }3}r,，、。"} } }}二_;、}1} .,e} \}
肝S9液1. 0 mL
混匀，置冰浴待用。菌株及增菌培养
试验菌株
四
采用四株鼠伤寒沙门氏突变型菌株TA97, TA98, TA100和TA102 o TA97, TA98可检侧
移码型诱变剂:TA100可检测碱基置换型诱变剂;TAZOZ检出移码型和碱基置换型诱变剂。
这4种标准菌株除均有组氨酸突变(his)外还有一些附加突变，可以提高试验菌株对致突
和阴性(溶剂)对照。
七方法和步骤
实验方法有平板掺入法和点试法。一般先用点试法作预试验，以了解受试物对沙门
氏菌的毒性和可能的致突变性，平板掺入法是标准试验方法。
1.平板掺入法
在底层培养平皿上写上记号。取已融化并在}5℃水浴中保温的顶层培养基一管(Zm } )
依次加入受试物溶液4. 1mL，测试菌菌液0. 05-0. 1mL }需活化时加} 0} s s混合液0. 5mL)
这4种试验菌株用途不同。TA97和TA98检测移码突变;TA}00检测碱基置换突变;
TA102检测碱基置换和移码突变，可检出多种对其它菌株不敏感的致突变物(如甲醛、乙
醛、.博莱霉素、苯麟、X线、紫外线及一些交联剂)。‘2.增菌培养
取灭菌的25m1三角烧瓶，加入营养肉汤10mI，从试验菌株母板上刮取少量细菌，接种
(1)D. Imo 1 /L组氨酸/0.02moI/L D一生物学素溶液(鉴定菌株用，
称取L一盐酸组氨酸(MW191. 17 )191. ?mg，D一生物素I2. Zmg，溶于
2Dmin灭菌，保存于4'C冰箱.
无菌配制)
14mL蒸馏水，0. 103MPa (2)0. 8}6氨节青霉素溶液(鉴定菌株用，无菌配制)称取氨节青霉素40mg，用0. 02mo1/L
3) 1096 S9混合液的配制:每10m1由以下成分组成，临用时配制。
灭菌蒸馏水3. 8m1
磷酸盐缓冲液(0. 2mo1/L, pH?. 4) 5. OmL
1.65mo1/L氯化钾/0. 4mo1/L氯化镁溶液0. 2mL
葡萄糖一6-磷酸溶液((0. 05mo 1几)40 } mo 1
辅酶II溶液(0. 05mo }. /L)50 } mol
水分及检查有无污染。(4)顶层培养基
1)顶层琼脂
琼脂粉一.0. fig
氧化钠‘0. 5g
加蒸馏水至100 ml
2 ) 0. 5mmo1/L组氨酸一生物素溶液(诱变试验用)
D-生物素(分子量244 ) 30. 5mg
L一组氨酸(分子量155 ) 17. 4mg
加蒸馏水至250mL
3。鉴定菌株基因型用试剂
含p}AQI质粒具有抗四环素的特性。
用结晶紫抑菌试验的方法，在二个肉汤平板上分别滴加氨节育祥素溶液20 a }.(浓度
为1毫克/毫升
溶于0. 02 c.0 }.,}L
，溶于0. 02mo 1 /L NaOH )’和四环素溶液20 u 1(浓度为0. O8奄克/奄升，
HC1)，并在肉汤平板表面涂成一条带，_待挤
苯))诱导的大鼠肝匀浆制备的S9混合液作为代谢活化系统。
正向突变
眼伤寒沙门氏苗原养型}113}
一------一卜
气}}}
组氮酸营养缺陷型突变株(hiss
!士S9代谢活化系统
受试物
三仪器和试剂
I.低温高速离心机，低温冰箱(-80 0C)或液氮罐，洁净工作台，恒温培养箱，恒温水浴，
蒸气压力锅，匀浆器等实验室常用设备。
、丁，，-·，
脸菌株.经3?℃培养2448小时，观察生长情况.4个亩株
证明它们都带有R因子.TA102菌株生长应不受四环t抑低
2。自发回变数侧定
!粉E_2.自发回变数测定
取己融化并在45℃水浴中保温的顶层培养墓一管C2ml)，加入测试菌菌液4.05-}0.2mL,
迅速混匀，倒在底层培养荃上，转动平皿使顶层培葬墓均匀分布在底层上，平放固化.37
作为指示生物。这些菌株在无组氨酸的培养基上不能生·长，在有组氨酸的培养基上可以正
常生长。致突变物可使沙门氏菌突变型回复突变为野生型(hi s})，恢复了合成组氨酸能力，
因而在无组氨酸培养基上也能生长为可见的菌落。故可根据在无组氨酸的培养基上菌落生
成数量，检查受试物是否为致突变物。对于间接致突变物，可用经Aroclor1254(或多氯联
『一再蔽轰晶升与泉在低叔C 0-4'}C)高速离心机上，以9000g离心‘Omi.n。吸出上清液为
59组分，分装。液氮或一80℃低温保存。S9应经无菌检查，蛋白含量测定(CLowry法)，
及间接致突变剂鉴定其生物活性合格。
}2 } S9混合液的配制
}) 0. 4mo1/L化镁/1. fi5 mol/L氯化钾称取MgCLa ' 6Ha} 8. 1 g, KCL 12. 3g加
基上，转动平皿使顶层培养基均匀分布在底层上，平放固化。取无菌滤纸圆片(直径
，心放在已固化的顶层培养基的适当位置上，用移液器取适量受试物(如10，L ),
片上，或将少量固体受试物结晶加到纸上或琼脂表面，37℃培养48小时观察结果。
6mm)，
点在纸
八结果与评价
王.点试法凡在点样纸片周围长出一圈密集的hi s+回变菌落者，该受试物即为致突变物质.
变物的敏感性。这4种菌株均有脂多糖突变(rfa)，使分子较大的化合物如结晶紫、去氧胆
酸、苯并(}a)花等能进入胞体。TA97, TA98和TA100菌株均有切除修复突变，即△urvBa
这4种菌株均有R因子，对氨节青霉索具有抗药性，R因子可增强对DNA损伤的易误修复.
而且，TA102菌株还有pAQi质粒，对四环素具有抗药性(表)。
氢氧化钠溶液5毗溶解，保存于4'C冰箱。
(3) 0. 8%四环素溶液(鉴定菌株用，无菌配制)称取40mg四环素，用0. 02moZ/L盐酸SrnL
溶解，保存于4'}C冰箱。
}4) 0. }%结晶紫溶液(鉴定菌株用)称取结晶紫0.制备
}l)大鼠肝S9的诱导和制备:选健康雄性成年SD或}istar大白鼠，体重i50g左右，周
磷酸氢二钾(Ka HPO,) 1fi3. bg’
硫酸镁(MgSO,’7H20) 2. 5 g
加蒸馏水至500mL，0. i 03 MPa 20m i n灭菌
待其他试剂完全溶解后，再将硫酸镁缓慢放入其中继续溶解，否则易析出沉淀。
2 ) 4096葡萄糖溶液
葡萄糖‘40. 0g
加蒸馏水至140mL，0.055 MPa 20min灭菌
凉脂粉
营养肉汤培养基
加热融化后调pH为7.
C3)底层培养基
用于基因型C rfa突变，
2. 0g
R因子，P}Q1
...，份，卜州‘闷，r闷.
质粒，△
urvB)鉴定。
100mL
4, 0. 103MPa 20m i n灭菌。
1)磷酸盐贮备液(V--B盐贮备液)磷酸氢钠铁(NaNH,HP04)43 .8g
柠檬酸(C}Ha07 .H20 ) }5g
℃培养48h观察结果。计数回变菌落数。每株的自发回变率应落在表A1所列正常范围内.
3。对鉴别性致突变物的反应
试验菌株对不同致突变物的反应不同，应该在有和没有代谢活化的条件下鉴定各试验菌
株对致突变物的反应。可按下述的点试验或平皿掺入试验的方法进行.各试验菌株对鉴别
性致突变物的反应见表A2d
4.菌株保存
鉴定合格的菌种应加入DMSO作为冷冻保护剂，保存在一sa℃或液氮c-}ss}c }，或者冰
冻干燥制成干粉，4℃保存。六实验设计
受试物最低剂量为每平皿4.1ug，最高剂量为5mg，或出现沉淀的剂量，或对细菌产
生最小毒性剂量。一般选用4}--5个剂量，进行剂量一反应关系研究，每个剂量应做2}‘或3
个平行平皿。溶剂可选用水、二甲基亚矾或其他溶剂。每次实验应有同时进行的阳性对照
物素溶液，另一个仅加0. 1毫升0. }mmol/L生物素溶液。
0.1mo1/L组氨酸/0. 5r}mo1}L生
将试验菌株在此两组培养基上划线接种，经37 }培养24--} 48小时，观察生长情况。此4种菌株应在补充有组氮酸的培养
基上生长，而在无组氮酸的培养墓上不能生长。
C2)深粗糙型Crfa)鉴定(结晶紫抑菌试验);深粗糙型突变的细菌，缺失脂多锗屏降，
蒸馏水稀释至100m1。0. 1031VIPa 24min灭菌或滤菌。
2) 0.2mo1/L磷酸盐缓冲液(pH7. 4)，每500mL由以下成分组成: