8011戴安U3000高效液相色谱仪标准操作规程03

目的：建立戴安U3000高效液相色谱仪标准操作规程，确保仪器使用的规范化、标准化。范围：适用于戴安U3000高效液相色谱仪的操作。

责任：QC主管、仪器操作员对本规程的实施负责。

内容：

内容：

1、流动相的配制

1.1首先配制常用流动相以及泵后密封圈清洗液小瓶（5%-10%甲醇溶液)如下图（图1）。配制过程中有机相必须用有机系0.45 μm的滤膜过滤，水相或缓冲盐用水系0.45μm的滤膜过滤。然后超声20分钟，超声时应避免超声温度过高以使有机相挥发。一般流动相可以保存3天，含缓冲盐的流动相必须临用新配，注意水相、5%甲醇或10%甲醇溶液（清洗液）必须每天更换！

1.2 D通道抽滤并超声的10%甲醇；注意各通道必须保证流动相充足，当流动相体积150ml

2、开机、仪器方法设置。

2.1稳压电源打开JJW-3KV A稳压器“ON”位置，等2-3分钟稳定后，按下ON-LINE 1KV A 蓄电池电源前面板的“ON”，等2-3分钟。

2.2 打开泵(Pump)、自动进样器(Sampler)及所需检测器后面板电源线下方的电源开关，仪器将开机自动进行自检。各部分自检成功后，方可进行以下各部操作。

2.3 打开电脑，等5-7分钟，电脑稳定。

2.4打开软件，连接仪器。打开变色龙软件控制面板

双击电脑桌面的“变色龙Chromeleon 7”图标。出现如下对话框

点击“确定”后出现进样器界面（图2）：

（图2）输入自己的用户名及密码，进入软件界面如下图（图3）

（图3）在图3左侧出现两台仪器，一台为—U3000，一台为—U3000-01，根据需要选择操作的仪器。

在主页项中连接“泵”，“Sampler(自动进样器)”，及所需检测器，UV是紫外检测器，FLD是荧光检测器，A2D是蒸发光和示差折光检测器（图4）。

然后点击“泵(Pump)”选项，再点击下方的“更多选项”（图5-6），

（图5）

将“通过进样器”后“Yes”改为“NO”。关闭泵-更多选项界面，当电脑关闭或泵断开连接时，需执行此步骤。（图5-6）

2.5冲洗泵

单击（图5）对话框的“继续”按钮，等一分钟左右出现连接按钮变绿，首先将B通道流动相调节100%，单击“冲洗”按钮，出现如下对话框（图6）：

（图7）

逆时针将单泵上方的金黄色螺母“排气阀”拧3圈左右，点击“忽略警告执行”按钮。依次按照B C D A顺序进行冲洗，结束后顺时针轻轻拧紧螺母，注意冲洗过程中流速必须为零。注意冲洗通道的比例必须是100%，当其他通道为比例0%时，A 通道为100%。

2.6流速的调节

一般选用90%甲醇或90%乙腈冲洗色谱柱，调节流速时需等如0.2ml/min的步进速度（每个平衡点保持0.5分钟以上时）进行流速的升降，当达到0.6ml/min时，在此流速平衡20-30min后，进行等度流动相比列或梯度流动相初始平衡比例调整；在此流动相平衡20-30分钟后，调整到方法要求的流动相，并等待压力稳定后方可进行样品分析。

①当比例调整幅度大于40%的变化时，应进行过渡（选择两步或两步以上调整后达到所需要比例），通常先调节待加入流动相比例为5%-10%，平衡约5分钟以上，再调节比例到要求的浓度；

②梯度泵开机时通常选择有机相调节平衡流速，再逐步加入水相；

③含盐流动相系统应以调节有机相比例5-10%平衡约30分钟以上，再逐步转换到盐通道。注意当达到0.5ml/min及以上才能打开柱温箱、连接自动进样器以及紫外灯等。

2.7柱温箱的设置

温度为30.0 0C, 注意柱温箱在待机状态时，流速最低为0.5ml/min,色谱柱不能用100%的纯水冲，最低为5%的甲醇或乙腈。

2.8 自动进样器的使用

2.8.1 进样针的清洗

单击“进样器(Sampler)”出现如下界面（图8）：

在启动项下点击“灌注注射器”，执行清洗，当模块状态项下绿色的“Ready”方可进行下一步，依次按照“灌注注射器清洗缓冲环外部洗针洗缓冲环”顺序清洗3遍。

（图8）

2.8.2 放置样品瓶

将待测物质放置专用样品瓶中（图9），注意：加样时不能超过瓶口最高的标线位置（样品瓶2/3位置）一般在1.0-1.5ml之间。

样品瓶（9） 样品瓶托盘（图10）

点击“样品盘控制”命令项下的红区扇区位置“移动盘到前部” ，当仪器面板出现“Sample Position 及Inject V olume ” 方可放置样品；盖上托盖。

注意：当批处理正在运行时，不能打开自动进样器的样品盘放置样品，必须等当前批处理中断或停止，进样针清洗结束后，进样阀在“Inject ”位置时，点击“盘控制”命令项下的红区扇区位置“移动盘到前部” ，当仪器面板出现“Sample Position 及Inject V olume ” 方可放置样品；样品瓶位置必须与设置样品序列的位置一致。样品分析结束后及时取出样品瓶防止腐蚀。 2.9 紫外检测器

单击“UV ”出现如下界面（图11）；等10-20分钟，流速达到0.5ml/min 稳定时点击命令项“模块连接”按钮。

（图11）

当“连接”变绿及出现绿色“Ready”时方可进行如下操作：

在波长对应的位置输入待测定条件波长值，按下键盘“enter”确定，等待5分钟左

右，方可点击命令项下的紫外灯，等待25-30分钟，方可打开主页界面监视基线，如图（12）

根据需要选择监视的通道，紫外选择UV-VIS-1，蒸发光检测器选择A2D-Analog，示差选择A2D-Analog2，荧光选择的是Emission-1和FLD-FlowCell两个同时选中，然后点击确定开始基线监测（如图12）。

2.10 衍生化泵的连接

（图13）（图14）

2.10.1需要连接衍生化泵时，将色谱柱流出端接到衍生化泵的红色螺母处。

2.10.2将衍生化泵的Det端口出来的管路接至FLD检测器入口端。

2.10.3 荧光检测器的设置

（图15）当连接FLD时，点击FLD出现如下界面（图16）：

等20分钟左右，点击“监视基线”，做黄曲霉毒素时激发波长360nm；发射波长450nm；仪器校验时激发波长290nm；发射波长330nm，其他参数不变。

2.11 蒸发光散射检测器设置

2.11.1用蒸发光散射检测器检测时，首先确认XWK- Ш全自动空气发生器干燥管内变色硅胶未变色（做1-2次样需更换变色硅胶），打开XWK- Ш全自动空气发生器开关，等压力稳定在0.44-0.48MPa之间时，打开蒸发光散射检测器（ELSD-UM3000）右下角电源开关；出现如下图所示界面（图17）：

（图17）

2.11.3按面板上“MENU”出现如图18所示界面，通过调节温度（Te）至75o C，按面板上的“ENTER”键确定，如下图（图18）：

（图18）

2.11.4然后如下图所示界面，通过、调节流速F至2.50L/M，按面板上的“ENTER

（图19）

2.11.5按面板上的“RUN”键，再按面板上“V ALVE”键，POWER、RUN、V ALVE三灯全亮出现如下图20：

（图20）

2.11.6当T=075、F=2.50 P=

3.10 左右，再调节试验所需流动相。

2.11.7关闭蒸发光检测器时先停止流动相，继续用空气吹30min左右，再按面板上的“V ALVE”键，再按面板上的“MENU”键，再关黑色开关。再间断地按XWK- Ш全自动空气发生器红色放液按钮，直至压力表上的压力为“0”，然后关机。

2.11.8蒸发光界面一般打开软件自动连接。模块状态显示连接（绿色）才可做样。如下图（图21）；

（图21）

2.12示差检测器设置

2.12.1将色谱柱流出端接到检测器“IN”端口，检测器“OUT”端口是废液流出端。按下左下角的电源开关，检测器显示如下（图22）：

（图22）

2.12.2设置操作参数。

用左右方向键切换到参数设置界面。如下（图23）：

（图23）通过按上下方向键，切换当前显示的参数界面。顺序如下图所示（图24）。

（图24）

参数设置说明（图25）

（图25）请按照下列步骤更改参数设置：

2.12.2.1切换当前显示的参数界面至需要更改的参数；

2.12.2.2按下确认键（ENTER），参数部分的光标开始闪烁；

2.12.2.3 通过上下方向键来更改具体参数数值；

2.12.2.4按确认键（ENTER）使新设置的参数生效；

2.12.2.5按ESC 键返回监控界面；

2.12.3将流动相的流速定为1 ml/min通过参比池(冲洗)。

2.12.4间隔十秒钟按下冲洗键（PURGE），以打开/关闭冲洗阀（当打开时，LED灯亮，流路通过参比池，再按一次就关闭），持续几分钟。

2.12.5从上述步骤2.12.3开始让洗脱液流经参比池，保持约20分钟。

2.12.6按下冲洗键（PURGE）关闭冲洗阀，流动相流入样品池。

2.12.7 等待基线稳定。

2.12.8 按归零键（Zero）自动调节零点。

2.12.9开始进样操作。

2.13 建立程序文件

2.1

3.1选择所要使用的仪器（图26）

2.1

3.2点击文件菜单，再点击创建选择“序列”出现下（图27）

（图26）

（图27）

1、选择样品瓶数

2、进样次数

3、起始位置

4、进样量选择好之后点击下一步出现下（图28）

（图28）点击“浏览”选择仪器方法出现下（图29）、

（图29）点击黑色圈标注的图标选择U3000/U3000-01仪器方法出现下图一般常用的仪器方法有UV（紫外）、ELSD蒸发光检测器/示差检测器、FLD（荧光）检测器，根据样品检测要求选择所需要的检测器（图30）。

（图30）仪器方法选定之后回到一下界面（图31）：

（图31）点击“下一步”完成新建序列完成接下来选择保存序列界面（图32）：

（图32）选择需要保存路径，完成即可。

所有检测器使用之前都应提前打开预热半个小时，波长调到所需波长，流动相调到做样需要的比例即可开始基线测试如（图33）

（图33）

3、运行批处理程序如（图34）

（图34）新建序列的命名以前列舒乐为例如下（图35）

（图35）各品种对应各自的对照品及样品，修改完之后点击上方的“开始”即可做样。

4、数据处理

4.1批处理完成后双击打开需要处理的色谱图进行积分处理如下（图36）：