食品中双歧杆菌检验方法
双歧杆菌实验操作
双歧杆菌实验操作双歧杆菌（Lactobacillus）是一种常见的革兰氏阳性菌，广泛存在于人体的肠道、口腔、阴道等部位，对人体具有重要的生理功能和健康益处。
在实验室中，通过培养双歧杆菌，我们可以进一步研究它的特性、代谢途径、功能以及应用价值。
以下是一个关于双歧杆菌实验操作的示例，包括菌株的分离、培养、保存和鉴定等步骤。
1.菌株的分离和纯化从人体标本或商业产品中获得含有双歧杆菌的样品，例如：粪便、口腔漱口水、乳制品等。
将样品悬浮于无菌PBS（磷酸盐缓冲溶液）中，并进行10倍序列稀释。
将适量的悬浮液均匀涂布在含有适宜培养温度和营养成分的琼脂平板上。
经过孵育后，从单个菌落中刺取分离得到的单菌株。
2.菌株的培养将分离得到的单菌株接种到含有适宜培养基（如MRS培养基）的液体培养物中。
培养条件包括适宜的温度（通常在30-37℃之间）、PH值和氧气供应等。
静态培养通常在试管中进行，而摇床培养则需提供常规的摇床条件。
3.菌株的保存为了长期保存双歧杆菌菌株，常常采用冷冻保存和干燥保存。
其中，冷冻保存利用甘油或液氮冷冻对菌株进行保藏。
干燥保存是将菌株培养物在适当的保护剂（如蔗糖、蛋白质）的作用下，通过真空或喷雾冻干处理。
冷冻保存要求贮存于低温（-70℃至-80℃）环境中，而干燥保存则可在室温下进行。
4.菌株的鉴定确定菌株是双歧杆菌的一种，需要通过鉴定方法进行确认。
传统的鉴定方法包括菌落形态观察、革兰氏染色、形态学特征、生理和生化试验等。
另外，分子生物学技术也可以用于鉴定双歧杆菌，如PCR扩增特定的双歧杆菌基因片段或测序分析菌株的16SrRNA基因序列。
5.功能研究在鉴定菌株后，可以进一步研究双歧杆菌的功能特性和代谢途径。
例如，可以采用培养基成分和环境参数的调整来研究双歧杆菌的生长条件。
也可以评估双歧杆菌在产生保健益生素、抑制致病菌、增强免疫等方面的功能。
总结：通过以上的实验操作，可以实现对双歧杆菌菌株的分离、培养、保存和鉴定。
双歧杆菌的分离鉴定及保藏性能研究
双歧杆菌的分离鉴定及保藏性能研究乌云;刘红霞;李洪亮;母智深【摘要】为丰富发酵剂及益生菌菌种资源,从内蒙古阿拉善盟采集7份新生婴儿粪便样品,在传统细菌分离方法的基础上,通过添加莫匹罗星锂盐和X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)改良基础培养基,快速有效地分离获得双歧杆菌.结合全自动微生物分析系统和API20A试剂条鉴定菌种.结果共分离获得6株双歧杆菌,其中3株动物双歧杆菌,2株青春双歧杆菌,1株短双歧杆菌.试验验证甘油浓度为70%时冷冻保藏效果最佳.%In order to enrich more types of leavening agents and probiotics resources, faeces collected from sev-en infants(Alashan, Inner Mongolia) were investigated. On the basis of traditional bacterial separation method, Mupirocin lithium salt and X-Gal were added to the basic medium, to separate the bifidobacterium effectively. Automatic microorganism analytical system and API20A reagent strip were applied to identify the bifidobacteri-um. In total, six strains of bifidobacterium were obtained from infacts' faeces, among which three strains were Bifidobacterium lactis, two strains were Bifidobacterium adolescentis, and one strain was Bifidobacterium breve, and the optimum storage condition for the bifidobacterium is 70%glycerol.【期刊名称】《食品研究与开发》【年(卷),期】2017(038)023【总页数】6页(P171-176)【关键词】双歧杆菌;全自动微生物分析系统;API20A试剂条;冷冻保藏【作者】乌云;刘红霞;李洪亮;母智深【作者单位】内蒙古蒙牛乳业(集团)股份有限公司,内蒙古呼和浩特011500;内蒙古蒙牛乳业(集团)股份有限公司,内蒙古呼和浩特011500;内蒙古蒙牛乳业(集团)股份有限公司,内蒙古呼和浩特011500;内蒙古蒙牛乳业(集团)股份有限公司,内蒙古呼和浩特011500【正文语种】中文双歧杆菌是存在于人体肠道中的益生菌，在长期进化过程中与宿主形成了互惠共存的关系，具有改善肠道健康、增强免疫功能、防治便秘腹泻、缓解乳糖不耐、促进营养物质吸收、降三高和抗肿瘤等多种保健功能[1-4]。
实时荧光定量PCR法鉴定婴幼儿配方乳粉中动物双歧杆菌乳亚种
实时荧光定量PCR法鉴定婴幼儿配方乳粉中动物双歧杆菌乳亚种王青龙;貌达;周燕霞;李爽;王雨婷;杨霞;冉令辉;李庆尧;王凯毅;汤娱涵;丁珊珊;蔡雪凤【期刊名称】《中国酿造》【年(卷),期】2022(41)6【摘要】该研究通过系统发育树分析确定目标基因,并设计引物和探针,建立一种婴幼儿配方乳粉中动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animalis ctis)的实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-fqPCR)鉴定方法。
通过特异性、灵敏性和抗干扰实验对该方法进行验证,并对市售的64份标识含有动物双歧杆菌乳亚种的婴幼儿配方乳粉样品进行检测。
结果表明,atpD基因在动物双歧杆菌乳亚种间具有较高的种间特异性,种间差异率>10%,确定其为目标基因。
基于该基因建立的RT-fqPCR 方法能够特异性的检测动物双歧杆菌乳亚种,检测绝对灵敏度可以达到1 pg/μL,相对灵敏度可以达到10^(3) CFU/mL;基因水平和培养物水平抗干扰能力良好。
采用该方法从64份标识含有动物双歧杆菌乳亚种的乳粉样品中均能检测出动物双歧杆菌乳亚种,表明基于atpD基因建立的RT-fqPCR方法能够快速准确的对动物双歧杆菌乳亚种进行检测。
【总页数】7页(P224-230)【作者】王青龙;貌达;周燕霞;李爽;王雨婷;杨霞;冉令辉;李庆尧;王凯毅;汤娱涵;丁珊珊;蔡雪凤【作者单位】北京食品安全监控和风险评估中心(北京市食品检验所);中国计量科学研究院化学计量与分析科学研究所【正文语种】中文【中图分类】Q93-331【相关文献】1.荧光定量PCR法计数农家干酪中动物双歧杆菌乳酸亚种2.TaqMan实时荧光聚合酶链式反应(PCR)技术定量检测婴幼儿配方食品中的金黄色葡萄球菌3.实时荧光PCR法鉴定食品中双歧杆菌4.基于荧光定量PCR法鉴定婴幼儿配方羊奶粉中牛源性成分5.实时荧光定量PCR法与常规细菌鉴定法在肠道致病菌检测中的应用效果对比分析因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
食品中双歧杆菌检验及鉴定方法研究
双歧杆菌是一种需要厌氧培养的革兰氏阳性杆 菌，是食品中典型的益生菌，具有调节肠道促消化、预 防腹泻、减少便秘、抗过敏、抗肿瘤及改善营养等特殊 生理功能，被作为一种活性菌添加到不同食品中。已 有研究表明，当食品中双歧杆菌含量在106 CFU/mL以 上时,才能发挥其应有的生理功效［1-2］遥双歧杆菌活菌 数量及菌株类别是判断食品质量好坏以及是否具有 保健功能的重要指标。市面上销售添加有双歧杆菌的 水果糖、发酵乳及保健食品的品种越来越多，厂家添 加活菌数量不一,有必要对这些含益生菌产品进行风 险监测与鉴定。自1899年法国学者Tissier从母乳营 养儿的粪便中分离出双歧杆菌开始，双歧杆菌已发现 有32个亚型［3］,其鉴定手段也从形态学描述鉴定发展 到分子进化树％本研究依据《食品安全国家标准食 品微生物学检验双歧杆菌检验》(GB 4789.34—2016) 对食品中双歧杆菌做活菌含量计数检验并鉴定,采用 生化鉴定API法、全自动细菌鉴定仪及分子生物学 Riboprinter核糖体分型法对食品中双歧杆菌的鉴定进 行比较研究。Riboprinter核糖体分型技术法，是使用限 制性内切酶(如EcoR I、PvuII、PstI等)消化目标菌基 因组产生基因片段，再把该片段经过电泳分离后转移
2结果与分析 2.1样品测定结果
如表1所示,发酵乳只有50%的产品计数结果达 到1.0x106CFU/g ,而发酵剂、奶粉、糖果和益生菌固体 饮料计数结果大多数能达到1.0伊106 CFU/go由此得 出,双歧杆菌在固体食品中的含量较稳定 ,在发酵乳 中含量不稳定,易受到保存时间、温度等条件的影响° 2.2形态分析
分型法能准确鉴定出双歧杆菌的种名，是这次研究中鉴定双歧杆菌的最佳方法。
关键词双歧杆菌；检验;鉴定
中图分类号TS207.3 文献标识码A
保健食品功能检验与评价方法(2023年版)有助于调节肠道菌群
保健食品功能检验与评价方法（2023年版）有助于调节肠道菌群1.1试验项目1.1.1 动物实验1.1.1.1 体重1.1.1.2 双歧杆菌11.1.3乳杆菌1.1.1.4 肠球菌1.1.1.5 肠杆菌1.1.1.6 产气荚膜梭菌1.1.2 人体试食试验1.1.2.1 双歧杆菌1.1.2.2 乳杆菌1.1.2.3 肠球菌1.1.2.4 肠杆菌1.1.2.5 拟杆菌1.1.2.6 产气荚膜梭菌2.2试验原则2.2.1 动物实验和人体试食试验所列指标均为必做项目。
2.2.2 正常动物或肠道菌群紊乱模型动物任选其一。
2.2.3 受试样品中含双歧杆菌、乳杆菌以外的其它益生菌时，应在动物和人体试验中加测该益生菌。
2.2.4 在进行人体试食试验时，应对受试样品的食用安全性作进一步的观察。
3.3结果判定3.3.1动物实验：符合以下任一项，可判定该受试样品有助于调节肠道菌群动物实验结果阳性。
3.3.1.1双歧杆菌和/或乳杆菌（或其它益生菌）明显增加，梭菌减少或无明显变化，肠球菌、肠杆菌无明显变化。
3.3.1.2双歧杆菌和/或乳杆菌（或其它益生菌）明显增加，梭菌减少或无明显变化，肠球菌和/或肠杆菌明显增加，但增加的幅度低于双歧杆菌、乳杆菌（或其它益生菌）增加的幅度。
3.2.1人体试食试验：符合以下任一项，可判定该受试样品具有有助于调节肠道菌群的作用。
3.2.1.1双歧杆菌和/或乳杆菌（或其它益生菌）明显增加，梭菌减少或无明显变化，肠球菌、肠杆菌、拟杆菌无明显变化。
双歧杆菌和/或乳杆菌（或其它益生菌）明显增加，梭菌减少或无明显变化，肠球菌和/或肠杆菌、拟杆菌明显增加，但增加的幅度低于双歧杆菌、乳杆菌（或其它益生菌）增加的幅度。
有助于调节肠道菌群检验方法1动物实验1.1实验动物推荐用近交系小鼠，18-22g,单一性别，每组10-15只。
1.2剂量分组及受试样品给予时间实验设三个剂量组和一个阴性对照组，以人体推荐量的10 倍为其中的一个剂量组，另设二个剂量组，必要时设阳性对照组。
利用16SrRNA的PCR法鉴定双歧杆菌
利用16S rRNA的PCR法鉴定双歧杆菌中华微生钫学和免疫学杂志2001年9月第21卷第5期ChinJMicmbioll…l利用16SrRNA的PCR法鉴定双歧杆菌沈采玎袁佩娜随着以双歧杆菌为主的微生态制剂在医疗,保健,食品等行业的广泛应用,建立特异,灵敏,快速,简易的双歧杆菌分类鉴定方法日益引起人们的关注.荧光原位杂交…,PCR等已被引入双歧杆菌的鉴定.双歧杆菌各种型问发生学上密切相关,其16SrRNA相似性大于93%,这就为直接利用这些序列设计属特异性引物或寡核苷酸探针检测双歧杆菌提供了依据.本研究利用双歧杆菌16SrRNA基因序列设计属特异性引物,通过PCR鉴定双歧杆菌,通过琼脂糖凝胶电泳和Southern杂交法对扩增产物进行特异性及灵敏度方面的研究.材料与方法实验用菌株:双歧杆菌8株,6株来自本室保存菌种,2株为微生态制品,大肠杆菌和干酪乳杆菌来自中国医学细菌保藏中心.培养基:Y用于双歧杆菌培养,MRS用于需氧或兼性厌氧菌培养.PCR引物及Southern杂交用探针:本研究利用Clustalw软件(http:/)比较大肠杆菌与常见的几种双歧杆菌(长双歧杆菌,青春双歧杆菌和婴儿双歧杆菌)的16SrRNA基因序列.第培～38位的序列,仅青春双歧杆菌有1个碱基未定,其余碱基完全相同,而大肠杆菌有4个碱基不一致;第1425～1445处的序列,青春双歧杆菌有1个碱基与其它双歧杆菌不同,而大肠杆菌有7个碱基不一致.故根据这两个位置(培～38;1425～1445)设计上游引物为5.GATT℃TGGc1℃AGGA|I℃AAc03;下游引物为5'-CGGGTGCTI'CCCACTITCATG一3(I代表次黄嘌呤棱苷,可与A,G,C,T任何碱基配对),均为2lbp第167～184处的序列,两歧双歧杆菌有1个碱基未定.其余碱基完全相同,而大肠杆菌有6个碱作者单位:100050北京.中国药品生物制品检定所[泷永才(现工作单位:北京天坛生物制品股份有限公司),袁佩挪]通信作者:沈永才.100024北京天坛生物制品股份有限公司细菌学基不同.故根据这个位置设计用于Southern杂交的探针序列:5一CATCCGGCA TI'ACCACCC.3.PCR反应:将适量菌体重悬于0.2ml裂解液(50mmol/LTris—HCI,pH80,05%Tween20,1mg/ml蛋白酶K)中裂解,经55℃孵育3h,95℃加热10min,立即在冰水中冷却,离心除去细胞碎片,lOgl上清液用于PcR扩增在O.5ml的离心管中加入下列成分:10×PCRbuffer5ul,Mg2(25ramo】/L)3出,10retool/ LdNTPS1l,上下游引物(25tnnol/L)各0.5出,待检样品10gl,Taq酶l(2U/g1),ddH029bd混匀后加5O1液体石蜡以防反应液蒸发,按下列程序进行PCR反应.反应程序:94℃×1n一55℃×3n一72℃×4min,n=35次.PCR扩增产物的检测采用琼脂糖凝胶电泳法和Sou~em杂交法.灵敏度测定:将青春双歧杆菌2627号菌体连续稀释在0.2ml裂解液中,使菌体在每一份裂解液中数量分别为2×10～2×10个菌,经55℃孵育12h,95℃加热10min,离心除去细胞碎片,此时每10出中含有的模板DNA相当于10～1O个双歧杆菌释放出的染色体DNA,按上述方法进行PCR扩增.Southern杂交试剂盒:德国宝灵曼公司产品.结果与讨论双歧杆菌是革兰阳性菌,其细胞壁比革兰阴性菌厚,约为250埃,含有较多的肽聚糖和磷壁酸,比革兰阴性菌细胞壁的机械强度大,因此提取染色体DNA时破坏细胞壁较困难.本研究参考Kolk等方法用0.2ml裂解液(50mmol/LTris—HCI,pH8.0,05%Tween20,hng/ml蛋白酶K)进行破壁,通过延长破壁时间,将缓冲液中Tris—HCI浓度加大为50mn~l/LpH89,将KCI换成166ramol,LNH|CI,反应中加入0O1%的明胶,调整引物浓度为02/xmol/L,这些措施均有助于扩增时酶的稳定性,提高PCR产量,经上述改进,所有双歧杆菌均有1428bp的特异性扩增带,其它细菌无此特异性扩增带(见图1);青春双歧杆菌2627号灵敏度可达100个菌(见图2)中华散生物学和免疫学杂志21301年9月第21卷第5期ch?l【:唑竺!,! 田1以DNEcoRI4-RindⅡ为相对分于质量标准.部分双歧杆菌夏其它细菌的琼脂糖凝肢图谱l长双歧杆菌3号;2长取歧杆菌6号;3长双歧杆菌50号;4.长双歧杆菌5O6号;5大哂杆菌CMCC44106;6n~ker;7干酪乳杆菌CMCC34103;8长积歧杆菌HMgO08;9青春双歧杆菌2627;10婴儿双歧杆菌CGMCC313—2:ll要儿驭歧杆菌LCL1721234567892027l904;田2青春双歧杆菌2627号灵敏度I:Mather;2:168十苗;3:107十菌;4:l06十苗;5:1o5十苗;6:l0'十菌;7:l十菌;8:个菌;9:10十菌本实验还用Sounthem杂交法对结果进行了特异性确证试验(见图3).在Southern杂交过程中,杂交温度是试验成功的关键,本试验的杂交温度为42℃～52℃,其中以50%杂交背景最低,故选用50%为杂交温度,因为本试验采用的杂交探针较短.所以采取适当延长杂交时间,降低洗涤时间的办法来防止假阴性.利用16SrRNA的F'CR方法鉴定双歧杆菌不但可以克服传统方法的不确定性,而且具有特异,灵敏,操作简单等优点.≤围3用地高辛3末端标记寡核苷酸对双歧杆菌进行Southetll杂交的部分结果】:长l积歧杆菌3号;2长积蠖杆菌6号;3:长双歧杆菌5O号:4长双歧杆菌506号;5:rrm州6:干酪乳杆菌CMCC34103;7:长双歧杆菌HMg008;8:青春双歧杆菌2627;9:婴JLJI~歧杆菌CGMCC313—2; lO:婴儿积歧杆菌LCLI72参考文献l修淑丽,熊德鑫.扬毅.等荧光原位杂交法橙测双歧杆菌中华教生铆学和免疫学杂志,0000,20(2)1782KaZanP,FetterkomAP,TeuberM,日alIdenfifi~don蚰dqaantl一6eafion批肿P一tedfromfoodwithgenusspecific16SrRNA-targetedp~besc0lyhybrlth~tionandPCRApplE…口MicrobloI,1997,63:1268.12733F~thinghamR,Dm-t~AJ,WilsonKHRibosomalDNABeqe—sdobac.ter~impltea6om,forqu一basedidentificationoftheh…eofonicflo讯.MiembE∞【Health13is1993,6:23-27.4KolkAⅢ,SchttitemaAaJ,LeeuwenJY,al1)et~tion0fh-e【mincLinical&∞mP0lnechainm0n…∞mcdet~fonsystem.JClinMic~bloI,[992.2567—2575.(收稿日期:2009-11.02I)《中国抗感染化疗杂志》征订启事(中国抗醵染化疗素志'由复旦大学医学院(厚上海医科大学)主疳,复王犏.丰刊2001年3月正式刨刊,由《中国抗序染也疗杂志'箱辑委员舍箱辑,出版,主要栏百:连评,论着,塘进,临床研究,寰验研究雠康坚验,痛倒报告,合理用葑,信E变流,专题讲座,善内外动寿,作者?读者?蝙者莘.读者对象:内,外妇,儿尊軎斟医师,医赃药剂科工作人员,临康微生精植驻凡员及鼠事拄摩染化疗的茸理学,临床药理学和临床茸学等吝毁研兜^员.丰刊为季刊,【6开丰.64页,每鞋定计8O0置国际标准号ISSN[0097708.国内统一标准刊号CN31一l8441R.丰刊现已哥站征2002年杂志.由皇国邮局统一发行,邮发代号4—686.圭国各地邮局(所)均可办理订阿,也可向萃蝙辑部邮购地址:上海市乌鲁丰齐中路【2号,华山医院《中国抗蒋染亿疗素志'编辑部邮编:21~O40电话:(021)624s9999—6507传真:(02l】62488290E.mail:ci?c@hsh咖eh.tn誓。
双歧杆菌检验(食品微生物学检验)
食品安全国家标准食品微生物学检验双歧杆菌检验1范围本标准规定了双歧杆菌(B i f i d o b a c t e r i u m)的鉴定及计数方法㊂本标准适用于双歧杆菌纯菌菌种的鉴定及计数㊂本标准适用于食品中仅含有单一双歧杆菌的菌种鉴定㊂本标准适用于食品中仅含有双歧杆菌属的计数,即食品中可包含一个或多个不同的双歧杆菌菌种㊂2设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:2.1恒温培养箱:36ħʃ1ħ㊂2.2冰箱:2ħ~5ħ㊂2.3天平:感量0.01g㊂2.4无菌试管:18mmˑ180mm㊁15mmˑ100mm㊂2.5无菌吸管:1m L(具0.01m L刻度)㊁10m L(具0.1m L刻度)或微量移液器(200μL~1000μL)及配套吸头㊂2.6无菌培养皿:直径90mm㊂3培养基和试剂3.1双歧杆菌培养基:见A.1㊂3.2 P Y G培养基:见A.2㊂3.3 M R S培养基:见A.3㊂3.4甲醇:分析纯㊂3.5三氯甲烷:分析纯㊂3.6硫酸:分析纯㊂3.7冰乙酸:分析纯㊂3.8乳酸:分析纯㊂4检验程序双歧杆菌的检验程序见图1㊂图1双歧杆菌的检验程序5操作步骤5.1无菌要求全部操作过程均应遵循无菌操作程序㊂5.2双歧杆菌的鉴定5.2.1纯菌菌种5.2.1.1样品处理:半固体或液体菌种直接接种在双歧杆菌琼脂平板或M R S琼脂平板㊂固体菌种或真空冷冻干燥菌种,可先加适量灭菌生理盐水或其他适宜稀释液,溶解菌粉㊂5.2.1.2接种:接种于双歧杆菌琼脂平板或M R S琼脂平板㊂36ħʃ1ħ厌氧培养48hʃ2h,可延长至72hʃ2h㊂5.2.2食品样品5.2.2.1样品处理:取样25.0g(m L),置于装有225.0m L生理盐水的灭菌锥形瓶或均质袋内,于8000r/m i n~10000r/m i n均质1m i n~2m i n,或用拍击式均质器拍打1m i n~2m i n,制成1ʒ10的样品匀液㊂冷冻样品可先使其在2ħ~5ħ条件下解冻,时间不超过18h;也可在温度不超过45ħ的条件解冻,时间不超过15m i n㊂5.2.2.2接种或涂布:将上述样品匀液接种在双歧杆菌琼脂平板或M R S琼脂平板,或取0.1m L适当稀释度的样品匀液均匀涂布在双歧杆菌琼脂平板或M R S琼脂平板㊂36ħʃ1ħ厌氧培养48hʃ2h,可延长至72hʃ2h㊂5.2.2.3纯培养:挑取3个或以上的单个菌落接种于双歧杆菌琼脂平板或M R S琼脂平板㊂36ħʃ1ħ厌氧培养48hʃ2h,可延长至72hʃ2h㊂5.2.3菌种鉴定5.2.3.1涂片镜检:挑取双歧杆菌平板或M R S平板上生长的双歧杆菌单个菌落进行染色㊂双歧杆菌为革兰氏染色阳性,呈短杆状㊁纤细杆状或球形,可形成各种分支或分叉等多形态,不抗酸,无芽孢,无动力㊂5.2.3.2生化鉴定:挑取双歧杆菌平板或M R S平板上生长的双歧杆菌单个菌落,进行生化反应检测㊂过氧化氢酶试验为阴性㊂双歧杆菌的主要生化反应见表1㊂可选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统㊂表1双歧杆菌菌种主要生化反应编号项目两歧双歧杆菌(B.b i f i d u m)婴儿双歧杆菌(B.i n f a n t i s)长双歧杆菌(B.l o n g u m)青春双歧杆菌(B.a d o l e s c e n t i s)动物双歧杆菌(B.a n i m a l i s)短双歧杆菌(B.b r e v e)1L-阿拉伯糖--+++-2D-核糖-+++++ 3D-木糖-++d++ 4L-木糖------5阿东醇------6D-半乳糖d+++d+ 7D-葡萄糖++++++ 8D-果糖d++d d+ 9D-甘露糖-++---10L-山梨糖------表1(续)编号项目两歧双歧杆菌(B.b i f i d u m)婴儿双歧杆菌(B.i n f a n t i s)长双歧杆菌(B.l o n g u m)青春双歧杆菌(B.a d o l e s c e n t i s)动物双歧杆菌(B.a n i m a l i s)短双歧杆菌(B.b r e v e)11L-鼠李糖------12卫矛醇------13肌醇-----+ 14甘露醇----a--a 15山梨醇----a--a 16α-甲基-D-葡萄糖甙--+---17N-乙酰-葡萄糖胺-----+ 18苦杏仁甙(扁桃甙)---++-19七叶灵--+++-20水杨甙(柳醇)-+-++-21D-纤维二糖-+-d--22D-麦芽糖-+++++ 23D-乳糖++++++ 24D-蜜二糖-+++++ 25D-蔗糖-+++++ 26D-海藻糖(覃糖)------27菊糖(菊根粉)--a--a--a 28D-松三糖--++--29D-棉籽糖-+++++ 30淀粉---+--31肝糖(糖原)------32龙胆二糖-+-+++ 33葡萄糖酸钠---+--注:+表示90%以上菌株阳性;-表示90%以上菌株阴性;d表示11%~89%以上菌株阳性;a表示某些菌株阳性㊂5.2.3.3有机酸测定:测定双歧杆菌的有机酸代谢产物(可选项),见附录B㊂5.3双歧杆菌的计数5.3.1纯菌菌种5.3.1.1固体和半固体样品的制备:以无菌操作称取2.0g样品,置于盛有198.0m L稀释液的无菌均质杯内,8000r/m i n~10000r/m i n均质1m i n~2m i n,或置于盛有198.0m L稀释液的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打1m i n~2m i n,制成1ʒ100的样品匀液㊂5.3.1.2液体样品的制备:以无菌操作量取1.0m L样品,置于9.0m L稀释液中,混匀,制成1ʒ10的样品匀液㊂5.3.2食品样品5.3.2.1样品处理:取样25.0g(m L),置于装有225.0m L生理盐水的灭菌锥形瓶或均质袋内,于8000r/m i n~10000r/m i n均质1m i n~2m i n,或用拍击式均质器拍打1m i n~2m i n,制成1ʒ10的样品匀液㊂冷冻样品可先使其在2ħ~5ħ条件下解冻,时间不超过18h;也可在温度不超过45ħ的条件解冻,时间不超过15m i n㊂5.3.3系列稀释及培养用1m L无菌吸管或微量移液器,制备10倍系列稀释样品匀液,于8000r/m i n~10000r/m i n均质1m i n~2m i n,或用拍击式均质器拍打1m i n~2m i n㊂每递增稀释一次,即换用1次1m L灭菌吸管或吸头㊂根据对样品浓度的估计,选择2个~3个适宜稀释度的样品匀液,在进行10倍递增稀释时,吸取1.0m L样品匀液于无菌平皿内,每个稀释度做两个平皿㊂同时,分别吸取1.0m L空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照㊂及时将15m L~20m L冷却至46ħ的双歧杆菌琼脂培养基或MR S琼脂培养基(可放置于46ħʃ1ħ恒温水浴箱中保温)倾注平皿,并转动平皿使其混合均匀㊂从样品稀释到平板倾注要求在15m i n内完成㊂待琼脂凝固后,将平板翻转,36ħʃ1ħ厌氧培养48hʃ2h,可延长至72hʃ2h㊂培养后计数平板上的所有菌落数㊂5.3.4菌落计数5.3.4.1可用肉眼观察,必要时用放大镜或菌落计数器,记录稀释倍数和相应的菌落数量㊂菌落计数以菌落形成单位(c o l o n y-f o r m i n g u n i t s,C F U)表示㊂5.3.4.2选取菌落数在30C F U~300C F U之间㊁无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数㊂低于30C F U 的平板记录具体菌落数,大于300C F U的可记录为多不可计㊂每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数㊂5.3.4.3其中一个平板有较大片状菌落生长时,则不宜采用,而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数;若片状菌落不到平板的一半,而其余一半中菌落分布又很均匀,即可计算半个平板后乘以2,代表一个平板菌落数㊂5.3.4.4当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时,则将每条单链作为一个菌落计数㊂5.3.5结果的表述5.3.5.1若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内,计算两个平板菌落数的平均值,再将平均值乘以相应稀释倍数,作为每克或每毫升中菌落总数结果㊂5.3.5.2若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时,按式(1)计算:N= C(n1+0.1n2)d (1)式中:N 样品中菌落数;C 平板(含适宜范围菌落数的平板)菌落数之和;n1 第一稀释度(低稀释倍数)平板个数;n2 第二稀释度(高稀释倍数)平板个数;d 稀释因子(第一稀释度)㊂5.3.5.3若所有稀释度的平板上菌落数均大于300C F U,则对稀释度最高的平板进行计数,其他平板可记录为多不可计,结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算㊂5.3.5.4若所有稀释度的平板菌落数均小于30C F U,则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算㊂5.3.5.5若所有稀释度(包括液体样品原液)平板均无菌落生长,则以小于1乘以最低稀释倍数计算㊂5.3.5.6若所有稀释度的平板菌落数均不在30C F U~300C F U之间,其中一部分小于30C F U或大于300C F U时,则以最接近30C F U或300C F U的平均菌落数乘以稀释倍数计算㊂5.3.6菌落数的报告5.3.6.1菌落数小于100C F U时,按 四舍五入 原则修约,以整数报告㊂5.3.6.2菌落数大于或等于100C F U时,第3位数字采用 四舍五入 原则修约后,取前2位数字,后面用0代替位数;也可用10的指数形式来表示,按 四舍五入 原则修约后,采用两位有效数字㊂5.3.6.3称重取样以C F U/g为单位报告,体积取样以C F U/m L为单位报告㊂5.4结果与报告根据5.2.3.1㊁5.2.3.2,5.2.3.3结果,报告双歧杆菌属的种名㊂根据5.3.6菌落计数结果出具报告,报告单位以C F U/g(m L)表示㊂附录A培养基和试剂A.1双歧杆菌琼脂培养基A.1.1成分蛋白胨15.0g酵母浸膏2.0g葡萄糖20.0g可溶性淀粉0.5g氯化钠5.0g西红柿浸出液400.0m L吐温801.0m L肝粉0.3g琼脂粉20.0g加蒸馏水至1000.0m LA.1.2制法A.1.2.1半胱氨酸盐溶液的配制:称取半胱氨酸0.5g,加入1.0m L盐酸,使半胱氨酸全部溶解,配制成半胱氨酸盐溶液㊂A.1.2.2西红柿浸出液的制备:将新鲜的西红柿洗净后称重切碎,加等量的蒸馏水在100ħ水浴中加热,搅拌90m i n,然后用纱布过滤,校正p H7.0ʃ0.1,将浸出液分装后,121ħ高压灭菌15m i n~ 20m i n㊂A.1.2.3制法:将A.1.1所有成分加入蒸馏水中,加热溶解,然后加入半胱氨酸盐溶液,校正p H至6.8ʃ0.1㊂分装后121ħ高压灭菌15m i n~20m i n㊂A.2P Y G液体培养基A.2.1成分蛋白胨10.0g葡萄糖2.5g酵母粉5.0g半胱氨酸-H C l 0.25g盐溶液20.0m L维生素K1溶液0.5m L氯化血红素溶液5m g/m L2.5m L加蒸馏水至500.0m LA.2.2制法A.2.2.1盐溶液的配制:称取无水氯化钙0.2g,硫酸镁0.2g,磷酸氢二钾1.0g,磷酸二氢钾1.0g,碳酸。
食品安全国家标准 食品微生物学检验 乳酸菌检验
中华人民共和国国家标准G B4789.35 2016食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验2016-12-23发布2017-06-23实施中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会前言本标准代替G B4789.35 2010‘食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验“㊁S N/T1941.1 2007‘进出口食品中乳酸菌检验方法第1部分:分离与计数方法“㊂本标准与G B4789.35 2010相比,主要变化如下:增加了乳酸菌总数计数培养条件的选择及结果说明;修改了改良M R S培养基成分;修改了平板计数的接种方法和接种量㊂食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验1范围本标准规定了含乳酸菌食品中乳酸菌(l a c t i c a c i db a c t e r i a)的检验方法㊂本标准适用于含活性乳酸菌的食品中乳酸菌的检验㊂2术语和定义2.1乳酸菌l a c t i c a c i db a c t e r i a一类可发酵糖主要产生大量乳酸的细菌的通称㊂本标准中乳酸菌主要为乳杆菌属(L a c t o b a c i l l u s)㊁双歧杆菌属(B i f i d o b a c t e r i u m)和嗜热链球菌属(S t r e p t o c o c c u s)㊂3设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:3.1恒温培养箱:36ħʃ1ħ㊂3.2冰箱:2ħ~5ħ㊂3.3均质器及无菌均质袋㊁均质杯或灭菌乳钵㊂3.4天平:感量0.01g㊂3.5无菌试管:18mmˑ180mm㊁15mmˑ100mm㊂3.6无菌吸管:1m L(具0.01m L刻度)㊁10m L(具0.1m L刻度)或微量移液器及吸头㊂3.7无菌锥形瓶:500m L㊁250m L㊂4培养基和试剂4.1生理盐水:见A.1㊂4.2 M R S(M a nR o g o s aS h a r p e)培养基及莫匹罗星锂盐(L i-M u p i r o c i n)和半胱氨酸盐酸盐(C y s t e i n eH y d r o c h l o r i d e)改良M R S培养基:见A.2和A.3㊂4.3 M C培养基(M o d i f i e dC h a l m e r s培养基):见A.4㊂4.40.5%蔗糖发酵管:见A.5㊂4.40.5%纤维二糖发酵管:见A.5㊂4.60.5%麦芽糖发酵管:见A.5㊂4.70.5%甘露醇发酵管:见A.5㊂4.80.5%水杨苷发酵管:见A.5㊂4.90.5%山梨醇发酵管:见A.5㊂4.100.5%乳糖发酵管:见A.5㊂4.11七叶苷发酵管:见A.6㊂4.12革兰氏染色液:见A.7㊂4.13莫匹罗星锂盐(L i-M u p i r o c i n):化学纯㊂4.14半胱氨酸盐酸盐(C y s t e i n eH y d r o c h l o r i d e):纯度>99%㊂5检验程序乳酸菌检验程序见图1㊂图1乳酸菌检验程序图6操作步骤6.1样品制备6.1.1样品的全部制备过程均应遵循无菌操作程序㊂6.1.2冷冻样品可先使其在2ħ~5ħ条件下解冻,时间不超过18h,也可在温度不超过45ħ的条件解冻,时间不超过15m i n㊂6.1.3固体和半固体食品:以无菌操作称取25g样品,置于装有225m L生理盐水的无菌均质杯内,于8000r/m i n~10000r/m i n均质1m i n~2m i n,制成1ʒ10样品匀液;或置于225m L生理盐水的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打1m i n~2m i n制成1ʒ10的样品匀液㊂6.1.4液体样品:液体样品应先将其充分摇匀后以无菌吸管吸取样品25m L放入装有225m L生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中,充分振摇,制成1ʒ10的样品匀液㊂6.2 步骤6.2.1 用1m L 无菌吸管或微量移液器吸取1ʒ10样品匀液1m L ,沿管壁缓慢注于装有9m L 生理盐水的无菌试管中(注意吸管尖端不要触及稀释液),振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀,制成1ʒ100的样品匀液㊂6.2.2 另取1m L 无菌吸管或微量移液器吸头,按上述操作顺序,做10倍递增样品匀液,每递增稀释一次,即换用1次1m L 灭菌吸管或吸头㊂6.2.3 乳酸菌计数6.2.3.1 乳酸菌总数乳酸菌总数计数培养条件的选择及结果说明见表1㊂表1 乳酸菌总数计数培养条件的选择及结果说明样品中所包括乳酸菌菌属培养条件的选择及结果说明仅包括双歧杆菌属按G B4789.34的规定执行仅包括乳杆菌属按照6.2.3.4操作㊂结果即为乳杆菌属总数仅包括嗜热链球菌按照6.2.3.3操作㊂结果即为嗜热链球菌总数同时包括双歧杆菌属和乳杆菌属1) 按照6.2.3.4操作㊂结果即为乳酸菌总数;2) 如需单独计数双歧杆菌属数目,按照6.2.3.2操作同时包括双歧杆菌属和嗜热链球菌1) 按照6.2.3.2和6.2.3.3操作,二者结果之和即为乳酸菌总数;2) 如需单独计数双歧杆菌属数目,按照6.2.3.2操作同时包括乳杆菌属和嗜热链球菌1) 按照6.2.3.3和6.2.3.4操作,二者结果之和即为乳酸菌总数;2) 6.2.3.3结果为嗜热链球菌总数;3) 6.2.3.4结果为乳杆菌属总数同时包括双歧杆菌属,乳杆菌属和嗜热链球菌1) 按照6.2.3.3和6.2.3.4操作,二者结果之和即为乳酸菌总数;2) 如需单独计数双歧杆菌属数目,按照6.2.3.2操作6.2.3.2 双歧杆菌计数根据对待检样品双歧杆菌含量的估计,选择2个~3个连续的适宜稀释度,每个稀释度吸取1m L 样品匀液于灭菌平皿内,每个稀释度做两个平皿㊂稀释液移入平皿后,将冷却至48ħ的莫匹罗星锂盐和半胱氨酸盐酸盐改良的M R S 培养基倾注入平皿约15m L ,转动平皿使混合均匀㊂36ħʃ1ħ厌氧培养72h ʃ2h ,培养后计数平板上的所有菌落数㊂从样品稀释到平板倾注要求在15m i n 内完成㊂6.2.3.3 嗜热链球菌计数根据待检样品嗜热链球菌活菌数的估计,选择2个~3个连续的适宜稀释度,每个稀释度吸取1m L 样品匀液于灭菌平皿内,每个稀释度做两个平皿㊂稀释液移入平皿后,将冷却至48ħ的M C 培养基倾注入平皿约15m L ,转动平皿使混合均匀㊂36ħʃ1ħ需氧培养72h ʃ2h ,培养后计数㊂嗜热链球菌在M C 琼脂平板上的菌落特征为:菌落中等偏小,边缘整齐光滑的红色菌落,直径2m mʃ1m m ,菌落背面为粉红色㊂从样品稀释到平板倾注要求在15m i n 内完成㊂6.2.3.4 乳杆菌计数根据待检样品活菌总数的估计,选择2个~3个连续的适宜稀释度,每个稀释度吸取1m L 样品匀液于灭菌平皿内,每个稀释度做两个平皿㊂稀释液移入平皿后,将冷却至48ħ的M R S 琼脂培养基倾注入平皿约15m L ,转动平皿使混合均匀㊂36ħʃ1ħ厌氧培养72h ʃ2h ㊂从样品稀释到平板倾注要求在15m i n 内完成㊂6.3菌落计数注:可用肉眼观察,必要时用放大镜或菌落计数器,记录稀释倍数和相应的菌落数量㊂菌落计数以菌落形成单位(c o l o n y-f o r m i n g u n i t s,C F U)表示㊂6.3.1选取菌落数在30C F U~300C F U之间㊁无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数㊂低于30C F U 的平板记录具体菌落数,大于300C F U的可记录为多不可计㊂每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数㊂6.3.2其中一个平板有较大片状菌落生长时,则不宜采用,而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数;若片状菌落不到平板的一半,而其余一半中菌落分布又很均匀,即可计算半个平板后乘以2,代表一个平板菌落数㊂6.3.3当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时,则将每条单链作为一个菌落计数㊂6.4结果的表述6.4.1若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内,计算两个平板菌落数的平均值,再将平均值乘以相应稀释倍数,作为每克或每毫升中菌落总数结果㊂6.4.2若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时,按式(1)计算:N=ðC(n1+0.1n2)d (1)式中:N 样品中菌落数;ðC 平板(含适宜范围菌落数的平板)菌落数之和;n1 第一稀释度(低稀释倍数)平板个数;n2 第二稀释度(高稀释倍数)平板个数;d 稀释因子(第一稀释度)㊂6.4.3若所有稀释度的平板上菌落数均大于300C F U,则对稀释度最高的平板进行计数,其他平板可记录为多不可计,结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算㊂6.4.4若所有稀释度的平板菌落数均小于30C F U,则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算㊂6.4.5若所有稀释度(包括液体样品原液)平板均无菌落生长,则以小于1乘以最低稀释倍数计算㊂6.4.6若所有稀释度的平板菌落数均不在30C F U~300C F U之间,其中一部分小于30C F U或大于300C F U时,则以最接近30C F U或300C F U的平均菌落数乘以稀释倍数计算㊂6.5菌落数的报告6.5.1菌落数小于100C F U时,按 四舍五入 原则修约,以整数报告㊂6.5.2菌落数大于或等于100C F U时,第3位数字采用 四舍五入 原则修约后,取前2位数字,后面用0代替位数;也可用10的指数形式来表示,按 四舍五入 原则修约后,采用两位有效数字㊂6.5.3称重取样以C F U/g为单位报告,体积取样以C F U/m L为单位报告㊂7结果与报告根据菌落计数结果出具报告,报告单位以C F U/g(m L)表示㊂8乳酸菌的鉴定(可选做)8.1纯培养挑取3个或以上单个菌落,嗜热链球菌接种于M C琼脂平板,乳杆菌属接种于M R S琼脂平板,置36ħʃ1ħ厌氧培养48h㊂8.2鉴定8.2.1双歧杆菌的鉴定按G B4789.34的规定操作㊂8.2.2涂片镜检:乳杆菌属菌体形态多样,呈长杆状㊁弯曲杆状或短杆状㊂无芽胞,革兰氏染色阳性㊂嗜热链球菌菌体呈球形或球杆状,直径为0.5μm~2.0μm,成对或成链排列,无芽胞,革兰氏染色阳性㊂8.2.3乳酸菌菌种主要生化反应见表2和表3㊂表2常见乳杆菌属内种的碳水化合物反应菌种七叶苷纤维二糖麦芽糖甘露醇水杨苷山梨醇蔗糖棉子糖干酪乳杆菌干酪亚种(L.c a s e i s u b s p.c a s e i)+++++++-德氏乳杆菌保加利亚种(L.de l b r u e c k i is u b s p.b u l g a r i c u s)--------嗜酸乳杆菌(L.a c i d o p h i l u s)+++-+-+d 罗伊氏乳杆菌(L.r e u t e r i)N D-+---++鼠李糖乳杆菌(L.r h a m n o s u s)+++++++-植物乳杆菌(L.p l a n t a r u m)++++++++注:+表示90%以上菌株阳性;-表示90%以上菌株阴性;d表示11%~89%菌株阳性;N D表示未测定㊂表3嗜热链球菌的主要生化反应菌种菊糖乳糖甘露醇水杨苷山梨醇马尿酸七叶苷嗜热链球菌(S.t h e r m o p h i l u s)-+-----注:+表示90%以上菌株阳性;-表示90%以上菌株阴性㊂附录A培养基及试剂A.1生理盐水A.1.1成分N a C l8.5gA.1.2制法将上述成分加入到1000m L蒸馏水中,加热溶解,分装后121ħ高压灭菌15m i n~20m i n㊂A.2M R S培养基A.2.1成分蛋白胨10.0g牛肉粉5.0g酵母粉4.0g葡萄糖20.0g吐温801.0m LK2H P O4㊃7H2O2.0g醋酸钠㊃3H2O5.0g柠檬酸三铵2.0gM g S O4㊃7H2O0.2gM n S O4㊃4H2O0.05g琼脂粉15.0gA.2.2制法将上述成分加入到1000m L蒸馏水中,加热溶解,调节p H至6.2ʃ0.2,分装后121ħ高压灭菌15m i n~20m i n㊂A.3莫匹罗星锂盐和半胱氨酸盐酸盐改良M R S培养基A.3.1莫匹罗星锂盐储备液制备:称取50m g莫匹罗星锂盐加入到50m L蒸馏水中,用0.22μm微孔滤膜过滤除菌㊂A.3.2半胱氨酸盐酸盐储备液制备:称取250m g半胱氨酸盐酸盐加入到50m L蒸馏水中,用0.22μm微孔滤膜过滤除菌㊂A.3.3制法将A.2.1成分加入到950m L蒸馏水中,加热溶解,调节p H,分装后121ħ高压灭菌15m i n~20m i n㊂临用时加热熔化琼脂,在水浴中冷至48ħ,用带有0.22μm微孔滤膜的注射器将莫匹罗星锂盐储备液及半胱氨酸盐酸盐储备液制备加入到熔化琼脂中,使培养基中莫匹罗星锂盐的浓度为50μg/m L,半胱氨酸盐酸盐的浓度为500μg/m L㊂A.4M C培养基A.4.1成分大豆蛋白胨5.0g牛肉粉3.0g酵母粉3.0g葡萄糖20.0g乳糖20.0g碳酸钙10.0g琼脂15.0g蒸馏水1000m L1%中性红溶液5.0m LA.4.2制法将前面7种成分加入蒸馏水中,加热溶解,调节p H至6.0ʃ0.2,加入中性红溶液㊂分装后121ħ高压灭菌15m i n~20m i n㊂A.5乳酸杆菌糖发酵管A.5.1基础成分牛肉膏5.0g蛋白胨5.0g酵母浸膏5.0g吐温800.5m L琼脂1.5g1.6%溴甲酚紫酒精溶液1.4m L蒸馏水1000m LA.5.2制法按0.5%加入所需糖类,并分装小试管,121ħ高压灭菌15m i n~20m i n㊂A.6七叶苷培养基A.6.1成分蛋白胨5.0g磷酸氢二钾1.0g七叶苷3.0g枸橼酸铁0.5g1.6%溴甲酚紫酒精溶液1.4m L蒸馏水100m LA.6.2制法将上述成分加入蒸馏水中,加热溶解,121ħ高压灭菌15m i n~20m i n㊂A.7革兰氏染色液A.7.1结晶紫染色液A.7.1.1成分结晶紫1.0g95%乙醇20m L1%草酸铵水溶液80m LA.7.1.2制法将结晶紫完全溶解于乙醇中,然后与草酸铵溶液混合㊂A.7.2革兰氏碘液A.7.2.1成分碘1.0g碘化钾2.0g蒸馏水300m LA.7.2.2制法将碘与碘化钾先进行混合,加入蒸馏水少许充分振摇,待完全溶解后,再加蒸馏水至300m L㊂A.7.3沙黄复染液A.7.3.1成分沙黄0.25g95%乙醇10m L蒸馏水90m LA.7.3.2制法将沙黄溶解于乙醇中,然后用蒸馏水稀释㊂A.7.4染色法A.7.4.1将涂片在酒精灯火焰上固定,滴加结晶紫染色液,染1m i n,水洗㊂A.7.4.2滴加革兰氏碘液,作用1m i n,水洗㊂A.7.4.3滴加95%乙醇脱色,约15s~30s,直至染色液被洗掉,不要过分脱色,水洗㊂A.7.4.4滴加复染液,复染1m i n㊂水洗㊁待干㊁镜检㊂。
母乳源长双歧杆菌的筛选鉴定及耐氧驯化
基金项目:广东省重点领域研发计划项目(编号:２０２２B ０２０２０５０００２);国家自然科学基金项目(编号:３２０７２６４６,３２２７２７８５)作者简介:张凤,女,华南农业大学在读硕士研究生.通信作者:林俊芳(１９６２ ),男,华南农业大学研究员,博士生导师,博士.E Ｇm a i l :l i n j f ＠s c a u ．e d u ．c n 刘春花(１９９０),女,南方医科大学第三附属医院主治医师,硕士.E Ｇm a i l :８３８２４００６７＠q q．c o m 收稿日期:２０２２Ｇ１２Ｇ２８㊀㊀改回日期:２０２３Ｇ０６Ｇ０９D O I :１０．１３６５２/j ．s p j x ．１００３．５７８８．２０２２．８１２１６[文章编号]１００３Ｇ５７８８(２０２３)１０Ｇ００１３Ｇ０６母乳源长双歧杆菌的筛选鉴定及耐氧驯化S c r e e n i n g a n d i d e n t i f i c a t i o no f B i f i d o b a c t e r i u ml o n gu m f r o m m a t e r n a l m i l ka n d i t s d o m e s t i c a t i o no f o x y ge n Ｇd o m e s t i c a t i o n 张㊀凤１,２,３Z HA N GF e n g１,２,３㊀侯心悦１,２,３H O U X i n y u e １,２,３㊀郭丽琼１,２,３G U OL I q i o n g １,２,３㊀刘春花４L I UC h u n h u a ４㊀林俊芳１,２,３L I N J u n f a n g１,２,３(１．华南农业大学食品学院,广东广州㊀５１０６４０;２．华南农业大学食品生物技术研究所,广东广州㊀５１０６４０;３．广东省微生态制剂工程技术研究中心,广东广州㊀５１０６４０;４．南方医科大学第三附属医院,广东广州㊀５１０６３０)(１．C o l l e g e o f F o o dS c i e n c e ,S o u t hC h i n aA g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t y ,G u a n g z h o u ,G u a n g d o n g ５１０６４０,C h i n a ;２．I n s t i t u t e o f F o o dB i o t e c h n o l o g y ,S o u t hC h i n aA g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t y ,G u a n g z h o u ,G u a n g d o n g ５１０６４０,C h i n a ;３．R e s e a r c hC e n t e r f o rM i c r o ＧE c o l o g i c a lA g e n tE n g i n e e r i n g a n dT e c h n o l o g y o f G u a n g d o n g P r o v i n c e ,G u a n g z h o u ,G u a n g d o n g ５１０６４０,C h i n a ;４．D e p a r t m e n t o f O b s t e t r i c s a n dG y n e c o l o g y ,T h i r dA f fi l i a t e d H o s p i t a l ,S o u t h e r n M e d i c a lU n i v e r s i t y ,G u a n g z h o u ,G u a n g d o n g ５１０６３０,C h i n a )摘要:目的:从母乳中筛选双歧杆菌,并提高双歧杆菌在有氧条件下的耐受性.方法:采用稀释涂布法结合１６S r D N A 鉴定法从母乳中筛选出双歧杆菌,并采用逐渐增加氧分压和有氧厌氧交替的方法进行驯化.结果:筛选得一株M E F Z Ｇ２２０１菌株,通过１６S r D N A 测序比对,其与长双歧杆菌模式菌(N C B I 登录号:O N ６３１７３３．１)的同源性达到了１００％,鉴定为长双歧杆菌(B i fi d o b a c t e r i u m l o n gu m ).将长双歧杆菌M E F Z Ｇ２２０１进行驯化后,其有氧培养最高的活菌数为８．９ˑ１０９C F U /m L ,比未经驯化的菌株活菌数提高了一个数量级;此外,驯化前后菌株的生理生化及形态特征并未发生变异;在短链脂肪酸的产生量上,驯化后菌株在厌氧条件下产酸量也显著高于驯化前的菌株.结论:驯化后的长双歧杆菌M E F Z Ｇ２２０１在有氧条件下的活菌数明显提高,有望成为潜在的益生菌菌株进一步开发利用.关键词:母乳;长双歧杆菌;分离鉴定;活菌数;耐氧驯化;短链脂肪酸A b s t r a c t :O b je c t i v e :T o s c r e e n B if i d o b a c t e r i u m f r o mb r e a s tm i l k a n di m p r o v e i t s o x yg e n t o l e r a n c e u n d e r a e r o b i c c o n d i t i o n s ．M e th o d s :Di l u t i o na n ds pr e a d p l a t e m e t h o d sw e r e p e r f o r m e dt o s e p a r a t ea n ds c r e e n B i fi d o b a c t e r i u m f r o m b r e a s t m i l k ．T h e i r B i fi d o b a c t e r i u m i d e n t i f i c a t i o n sw e r e c h a r a c t e r i z e db y １６Sr D N A s e q u e n c i n g ．T h eo x y ge nt o l e r a n td o m e s t i c a t i o n sw e r ec o n d u c t e d t h r o u g h g r a d u a l i n c r e a s eo fo x y g e n p r e s s u r ea n da l t e r n a t i o nof a e r o b i c a n d a n a e r o b i c c u l t i v a t i o n s ．R e s u l t s:A n o v e lB i fi d o b a c t e r i u m s t r a i n w a s i s o l a t e df r o m h u m a n m i l ka n d w a s i d e n t i f i e d a s B i f i d o b a c t e r i u ml o n g u m b y １６Sr D N As e q u e n c i n g ,w h i c hw a s n a m e d a sM E F Z Ｇ２２０１．T h e h o m o l o g y be t w e e nM E F Z Ｇ２２０１a n dm o d e l s t r a i n (a c c e s s i o n n u m b e r i nN C B I :O N ６３１７３３．１)r e a c h e d １００％．Af t e r o x yg e n t o l e r a n t d o m e s t i c a t i o n ,th ehi gh e s t v i a b l e b a c t e r i an u m b e r o f B i f i d o b a c t e r i u ml o n g u m M E F Z Ｇ２２０１d i na e r o b i c c u l t i v a t i o n r e a c h e d ８．９ˑ１０９C F U /m L ,w h i c hw a s t e nt i m e s h i g h e r t h a n t h a t o fi t s w i l d Ｇt y p e s t r a i n M E F Z Ｇ２２０１．W h e r e a s ,t h e m o r p h o l o g i c a l p r o p e r t y a n d p h ys i o Ｇb i o c h e m i c a l c h a r a c t e r i s t i c so f B i f i d o b a c t e r i u ml o n g u m M E F Z Ｇ２２０１dd i dn o t c h a n g e a f t e r o x y g e n t o l e r a n t d o m e s t i c a t i o n ．T h e s h o r t Ｇc h a i n f a t t y a c i d p r o d u c t i o no fd o m e s t i c a t e ds t r a i n B i f i d o b a c t e r i u ml o n g u m M E F Z Ｇ２２０１dw a s a l s os i g n i f i c a n t l y h i gh e r t h a nt h a to f i t sw i l d Ｇt y p e s t r a i ne v e nu n d e r a n a e r o b i c c o n d i t i o n s ．C o n c l u s i o n :An o v e l B i f i d o b a c t e r i u ml o n gu m s t r a i n M E F Z Ｇ２２０１w a si s o l a t e df r o m b r e a s tm i l k ．T h ev i a b l eb a c t e r i u m n u m b e ro fi t sd o m e s t i c a t e ds t r a i n M E F Z Ｇ２２０１d w a s s i g n i f i c a n t l y i n c r e a s e d u n d e r a e r o b i c c o n d i t i o n s ,i n d i c a t i n g t h a t i tw o u l db e a p o t e n t i a l pr o b i o t i c s t r a i n f o r f u r t h e r d e v e l o pm e n t a n du t i l i z a t i o n ．K e yw o r d s :b r e a s tm i l k ;B i f i d o b a c t e r i u ml o n g u m ;i s o l a t i o na n d i d e n t i f i c a t i o n ;c e l lv i a b i l i t y ;o x y g e n Ｇd o m e s t i c a t i o n ;s h o r t Ｇc h a i n f a t t y ac id ３１F O O D &MA C H I N E R Y 第３９卷第１０期总第２６４期|２０２３年１０月|母乳作为婴儿良好的营养源泉,含有大量的可以促进婴儿健康生长的活性物质,包括蛋白质㊁母乳寡糖㊁脂类㊁免疫因子㊁激素等[１].母乳也是婴儿肠道有益细菌的源泉,主要包括乳酸菌属和双歧杆菌属[２].近年来,有关母乳益生菌研究越来越多,大量研究[３－４]表明,母乳喂养的婴儿,其肠道中的细菌来源较多,但最早来自母乳,且母乳与婴儿肠道的细菌组成极为相似,因此,母乳源的益生菌相比其他来源更加安全可靠.研究[５]表明,双歧杆菌具有缓解腹泻和便秘㊁免疫调节㊁抑制肿瘤形成㊁维持肠道微生物群平衡以及产生维生素等多种益生功能.此外,双歧杆菌能够代谢产生多种短链脂肪酸(S C F A),如乙酸㊁丙酸㊁异丁酸和丁酸等[６],然而,双歧杆菌作为一种严格厌氧菌,本身对氧十分敏感,短时间接触氧气就会大量死亡,降低了其在生产加工和实际应用等过程中的经济价值,而对双歧杆菌进行耐氧驯化则可以良好地解决这一问题.目前,提高双歧杆菌在有氧条件下存活率的方法有逐渐增加培养基中的氧分压[７]㊁有氧厌氧交替驯化㊁基因工程改造[８]和微胶囊法[９].相比于基因工程改造和微胶囊法,逐渐增加培养基中的氧分压㊁有氧厌氧交替驯化更加简单高效且成本低廉.王猛等[１０]采用逐渐增加培养基中的氧分压和有氧㊁厌氧条件下交替培养两种方案对动物双歧杆菌进行了耐氧驯化,最终使其在有氧条件下的活菌数达到了６．３ˑ１０８C F U/m L.K a w a s a k i等[１１]采用液体摇床培养法探究不同O２浓度对双歧杆菌生长的影响,发现在２０％的氧浓度下双歧杆菌依然可以良好生长.目前对长双歧杆菌的耐氧驯化研究主要集中在益生特性及生长培养条件优化等,而对驯化前后长双歧杆菌生理生化特性及短链脂肪酸变化的研究鲜有报道.研究拟从母乳中筛选出长双歧杆菌,并采用有氧厌氧交替驯化及逐渐增加氧分压这两种较为温和的驯化方式驯化长双歧杆菌使其可在有氧条件下生长且具有较高的活菌数,并探究长双歧杆菌M E F ZＧ２２０１耐氧驯化前后形态㊁活菌数及短链脂肪酸产生量的变化情况,以期为长双歧杆菌M E F ZＧ２２０１进一步的开发利用提供理论依据.１㊀材料与方法１．１㊀材料与仪器１．１．１㊀材料与试剂M R S培养基:牛肉膏１０g/L,蛋白胨１０g/L,酵母浸粉５g/L,葡萄糖２０g/L,无水乙酸钠５g/L,柠檬酸氢二铵２g/L,七水硫酸镁０．２g/L,磷酸氢二钾２g/L,一水合硫酸锰０．０５４g/L,吐温Ｇ８０１g/L;M R S C培养基:在M R S培养基中加入０．５％的LＧ半胱氨酸盐酸盐制得;蛋白胨㊁酵母浸粉㊁葡萄糖㊁无水乙酸钠㊁柠檬酸氢二铵㊁七水硫酸镁㊁磷酸氢二钾㊁一水合硫酸锰㊁吐温:分析纯,国药集团化学试剂有限公司;LＧ半胱氨酸盐酸盐:分析纯,青岛海博生物有限公司.１．１．２㊀主要仪器设备厌氧培养箱:Y Q XＧⅠ型,上海跃进医疗器械厂;P C R仪:E T C８１１型,东盛龙精密技术有限公司;超净工作台:S WＧC JＧ１F型,苏州安泰空气技术有限公司;小型水平电泳槽:H E１２０型,上海天能科技有限公司;紫外分光光度计:U V１７００P C型,上海奥析科学仪器有限公司;显微镜:C X４１R F型,广州知镜科技有限公司.１．２㊀方法１．２．１㊀采样人群选择㊀采集样品的人群均为广州地区健康女性,年龄在２５~３５周岁,无家族遗传病,无乳腺炎等疾病.１．２．２㊀样品采样方法㊀共收集３０份顺产母亲的母乳样品.采集处理方法参考文献[１２].１．２．３㊀菌株的分离及纯化㊀将１．２．２中保存的母乳样品各取１m L用０．９％的无菌生理盐水进行梯度稀释.选择合适的稀释度进行涂布,取１００μL涂板在含有３％碳酸钙的M R S固体培养基上(３个平行),置于厌氧培养箱(C O２５％,H２１０％,高纯N２８５％)中,于３７ħ培养４８h.挑取同时具有溶钙圈和双歧杆菌形态特征的单菌落进行划线纯化,同时纯化后的单菌落用于接触酶试验,选取显示为阴性的菌株于M R S C液体培养基中培养,并进行革兰氏染色,筛选出染色呈紫色并具有杆状形态特征的菌液保藏,初步保藏采用５０％的甘油作为保护剂,于－８０ħ冰箱中冷冻保存.１．２．４㊀菌株鉴定(１)菌株D N A提取:采用美基细菌基因组D N A提取试剂盒提取菌株D N A.(２)１６Sr D N A序列扩增与分析:P C R反应程序如表１所示,反应体系如表２所示.表１㊀P h a n t aP C R反应循环参数T a b l e１㊀P h a n t aP C Rr e a c t i o n c y c l e p a r a m e t e r s步骤温度/ħ时间/s预变性㊀９５１８０变性㊀㊀９５３０退火㊀㊀５６３０(３５个循环)延伸㊀㊀７２１８０彻底延伸７２３００４１基础研究F U N D AM E N T A LR E S E A R C H总第２６４期|２０２３年１０月|表２㊀P h a n t aP C R反应体系T a b l e２㊀P h a n t aP C Rr e a c t i o n s y s t e m成分体积/μL２ˑP h a n t aM a xB u f f e r２５d D N T M i x１上游引物２下游引物２P h a n t aM a xS u p e rＧF i d e l i t y１模板D N A２d d H２O１７双歧杆菌上游引物B i f１６４Ｇf: G G G T G G T A A T G C C G G A T G;下游引物P b i R２: G A C C A T G C A C C A C C T G T G A A)[１３].扩增产物用１％琼脂糖凝胶电泳检测,送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序,根据测序结果通过B L A S T程序与G e n B a n k 基因库进行比对,得出结果.１．２．５㊀扫描电镜观察长双歧杆菌菌体形态㊀根据文献[１４],修改如下:用１．５m L离心管收集长双歧杆菌菌体,在４ħ条件下４０００r/m i n离心１０m i n后,用２．５％戊二醛进行长双歧杆菌菌体前固定,于４ħ冰箱过夜.用０．１m o l/L p H７．２P B S漂洗３次,每次漂洗１０m i n;然后进行长双歧杆菌菌体后固定,用１％锇酸固定２~３h;１m o l/L p H７．２P B S漂洗３次每次漂洗１０m i n,之后进行梯度脱水,分别采用体积分数为３０％,５０％,７０％,８０％,９０％,１００％的乙醇脱水２次,每次脱水１０m i n.最后于－２０ħ冰箱干燥３０m i n,冻干４h.离子溅射镀膜仪在样品表面镀一层１０~１５n m金属膜.场发射扫描电镜,电压１．０k V,放大倍率１００００~３００００.１．３㊀长双歧杆菌的耐氧驯化１．３．１㊀长双歧杆菌活化㊀将保存的长双歧杆菌于M R S C 平板上厌氧培养４８h后,挑取单菌落于M R S C液体培养基中厌氧培养２４h,并按５％的接种量于M R S C液体培养基厌氧条件下进行５次活化,得到的活化菌液备用.１．３．２㊀长双歧杆菌耐氧驯化方式㊀根据文献[１５]修改如下:通过有氧厌氧交替培养,同时不断降低培养基中的氧分压进行驯化.将１．３．１中得到的活化菌液以５％的接种量,按照如下方法于３７ħ培养２４h进行长双歧杆菌的驯化:①接种至液深１６c m的M R S C培养基中,有氧培养;②接种至液深１６c m的M R S培养基中,有氧培养;③接种到液深１３c m装有M R S C培养基的螺口试管中,并用灭菌液体石蜡封口,厌氧培养;④接种到液深１３c m的M R S C培养基中,有氧培养;⑤接种到液深１３c m的M R S培养基中,有氧培养;⑥接种到液深１０c m装有M R S C培养基的螺口试管中,并用灭菌液体石蜡封口,厌氧培养;⑦接种到液深１０c m的M R S C培养基中,有氧培养;⑧接种到液深１０c m的M R S培养基中,有氧培养,并连续传代５次.以上视为一代驯化,对第一代驯化后的菌液进行划线培养,并挑单菌落活化,重复以上操作５次.１．３．３㊀耐氧驯化前后菌株形态学特征㊀耐氧驯化后的长双歧杆菌在有氧培养时观察其菌落形态,挑取长双歧杆菌的单菌落至液体培养基中进行有氧培养,参照张苓花等[１６]的方法进行革兰氏染色和镜检,观察菌体形态,并与驯化前菌落及菌株形态对比.１．３．４㊀耐氧驯化前后菌株在有氧条件下活菌数的测定将驯化前后的菌株按２％的接种量分别接种在M R S培养基中３７ħ有氧培养３２h,每隔４h取样,稀释涂板测定活菌数,绘制生长曲线进行对比.１．３．５㊀耐氧驯化前后菌株短链脂肪酸含量的测定㊀分别取１m L驯化前后的长双歧杆菌发酵液,１２０００ˑg离心５m i n,加入２m L蒸馏水㊁２m L乙醚以及２０μL２Ｇ乙基丁酸(０．６２５m g/m L)于上清液中,涡旋振荡１０m i n,于４ħ㊁４０００ˑg离心２０m i n,取上层有机相过０．２２μm有机滤膜后,进行气相色谱 质谱联用仪(G CＧM S)检测.色谱及质谱条件分别参考陈春[１７]和黄诗铭[１８]的方法进行.定性定量分析:试验选用的短链脂肪酸标品共６种,分别为乙酸㊁丙酸㊁异丁酸㊁丁酸㊁异戊酸㊁戊酸.取标准品各１０μL和乙醚１０μL混合得混合标准品溶液(０．１４３μL/μL),将混合标准品配制成相应的浓度梯度,并根据不同浓度标准品的G CＧM S检测结果绘制标准曲线,制得的回归方程及回归系数如表３所示.根据标准曲线计算样品中短链脂肪酸含量.表３㊀短链脂肪酸标准曲线的回归方程和回归系数T a b l e３㊀R e g r e s s i o ne q u a t i o n s a n dr e g r e s s i o nc o e f f i c i e n t so f t h e s t a n d a r d c u r v e s o f d i f f e r e n t a c i d s p e c i e s标准品回归方程回归系数(R２)乙酸㊀y＝０．５０９９x－３．８２１５０．９９９丙酸㊀y＝０．６x－０．５９８４０．９９９异丁酸y＝１．０５５７x－０．３５６６０．９９９丁酸㊀y＝１．１２９９x－１．０４８７０．９９９异戊酸y＝１．３３４２x－０．６１２４１．０００戊酸㊀y＝１．２０２５x－２．３６０２０．９９９１．４㊀数据分析以上所有试验均重复３次,采用E x c e l２０１９和G r a p h P a dP r i s m８．０．１处理数据及绘图.２㊀结果与分析２．１㊀菌株鉴定结果从母乳样品中分离得到１株M E F ZＧ２２０１菌株,其５１|V o l．３９,N o．１０张㊀凤等:母乳源长双歧杆菌的筛选鉴定及耐氧驯化１６S r D N A 扩增产物在经过１％的琼脂糖凝胶电泳之后,置于凝胶成像系统内观察可见在１５００b p 处有较亮的条带,并且无降解㊁弥散等现象,符合测序要求(图１).测序结果通过N C B I 数据库进行B L A S T 同源性比对,其相似性长双歧杆菌模式菌(N C B I 登录号:O N ６３１７３３．１)的同源性达到了１００％,菌株M Z F Z Ｇ２２０１鉴定为长双歧杆菌(B i f i d o b a c t e r i u ml o n gu m ).M．D N A M a r k e r ３㊀１~３．M E F Z Ｇ２２０１菌株的３个平行图１㊀长双歧杆菌１６S r D N A 扩增产物凝胶电泳结果F i g u r e １㊀G e l e l e c t r o p h o r e s i s r e s u l t so f B i fi d o b a c t e r i u m l o n gu m １６S r D N Aa m p l i f i c a t i o n p r o d u c t s ２．２㊀扫描电镜观察菌体形态离株长双歧杆菌M E F Z Ｇ２２０１在场发射扫描电镜中观察结果如图２所示,大多数菌体呈长杆状,少数呈分叉状㊁单端膨大的勺状以及L 型状等.２．３㊀耐氧驯化前后菌株形态及生理生化特征比较耐氧驯化前后的长双歧杆菌菌落形态等对比结果如表４㊁图３所示,驯化后的菌落较驯化前小,但驯化前后的菌落均呈乳白色或者白色㊁表面突起㊁光滑㊁边缘完整;菌体形态特征变化如图４所示,驯化前的菌体呈多形态型,多为棒状杆菌,且不规则形态较多.驯化后的菌体较驯图２㊀长双歧杆菌M E F Z Ｇ２２０１扫描电镜观察菌体形态F i g u r e ２㊀B i f i d o b a c t e r i u ml o n gu m M E F Z Ｇ２２０１s c a n n i n g e l e c t r o nm i c r o s c o p e o b s e r v a t i o n o f t h e m o r p h o l o g y of t h eb a c t e r i u m 化前相比更为规则,大多呈直杆状.对于双歧杆菌属而言,在形态学上主要分为两种形态,分叉性定义为Ⅰ型,杆状形态为Ⅱ型.初分离时主要为Ⅰ型,包括V 型㊁Y 型不规则形态等;经过一定的培养后,分叉状会慢慢呈现出杆状㊁弯杆状㊁棒状等向Ⅱ型转变,且较为稳定的遗传.临床上认为,Ⅰ型向Ⅱ型转变,是为了更好地适应环境等表４㊀耐氧驯化前后长双歧杆菌M E F Z Ｇ２２０１形态特征比较T a b l e ４㊀C o m p a r i s o no fm o r p h o l o gi c a l c h a r a c t e r i s t i c so f B i f i d o b a c t e r i u m l o n gu m M E F Z Ｇ２２０１b e f o r e a n da f t e r o x y ge n t o l e r a n c e d o m e s t i c a t i o n 生理生化特征耐氧驯化前耐氧驯化后菌体㊀㊀㊀多为棒状长杆菌,菌体大多呈Y 型㊁L 型和V 型,部分呈单端膨大的不规则形状多为棒状长杆菌,较为细长,菌体较驯化前相比更为规则,其余无明显变化菌落㊀㊀㊀菌落为乳白色或白色㊁表面光滑㊁突起,边缘完整菌落较驯化前相比较小,菌落为如乳白色或白色,表面光滑㊁突起㊁边缘完整革兰氏染色紫色紫色触酶试验㊀阴性阴性同期培养７２h图３㊀耐氧驯化前后长双歧杆菌菌落形态对比图F i g u r e ３㊀C o m p a r i s o n o f B i f i d o b a c t e r i u ml o n gu m c o l o n y m o r p h o l o g yb e f o r ea n da f t e ro x y ge n t o l e r a n c e d o m e s t i c a t i on 图４㊀耐氧驯化前后长双歧杆菌菌体形态F i g u r e４㊀B i f i d o b a c t e r i u m l o n gu m m o r p h o l o g y a f t e r o x y ge n t o l e r a n c e d o m e s t i c a t i o n (ˑ１００)６１基础研究F U N D AM E N T A LR E S E A R C H 总第２６４期|２０２３年１０月|出现的进化现象[１９].耐氧驯化前后菌株经革兰氏染色均为紫色,接触酶试验均为阴性,通过１６Sr D N A序列比对及表２㊁图３㊁图４发现耐氧驯化前后菌株序列一致,因此菌株经过驯化后并未发生变异.２．４㊀耐氧驯化前后菌株在有氧条件下活菌数对比耐氧驯化前后的长双歧杆菌的活菌数对比结果如图５所示.由图５可以看出,耐氧驯化前后的长双歧杆菌在有氧条件下均可以生长,而驯化后的长双歧杆菌在有氧条件下的生长能力明显优于驯化前的菌株,在第４h 左右达到生长对数期,于第１６h开始稳定期,并在第２０h 左右达到最高活菌数,为８．９ˑ１０９C F U/m L;经过对比,未经驯化的菌株延滞期明显延长.对于双歧杆菌而言,与氧接触会严重抑制其生长.当双歧杆菌暴露在有氧环境中时,细胞膜的脂肪酸组成会发生改变,细胞形态变得细长,细胞表面由光滑变得粗糙,延滞期延长[２０].未经驯化的长双歧杆菌在第８h进入对数期,第１６h进入稳定期,并在第２４h左右达到最高活菌数,为５．４０ˑ１０８C F U/m L.２．５㊀耐氧驯化前后菌株短链脂肪酸含量分析由图６可以看出,长双歧杆菌可以代谢产生乙酸㊁丙酸㊁正丁酸㊁异丁酸㊁正戊酸和异戊酸６种短链脂肪酸图５㊀耐氧驯化前后长双歧杆菌M E F ZＧ２２０１的生长过程活菌数变化的比较F i g u r e５㊀C o m p a r i s o no f l i v eb a c t e r i u m n u m b e rb e t w e e no x y g e nＧr e s i s t a n t a n do r i g i n a l B i f i d o b a c t e r i u ml o n g u m M E F ZＧ２２０１(S C F A).其中,乙酸的产生量最高,其次是异丁酸.将耐氧驯化前后的长双歧杆菌M E F ZＧ２２０１同时在厌氧条件下培养,在乙酸的产生量上,驯化后的菌株明显高于驯化前的菌株,而其他５种酸并没有显著变化.而驯化前后的菌株同时在有氧条件下培养时,未经驯化的菌株短链脂肪酸的产量均低于驯化后的菌株,其中驯化前菌株Q Y．驯化前厌氧培养;驯化后厌氧培养;HH．驯化后有氧培养;驯化前有氧培养;驯化前后长双歧杆菌各种有机酸含量为稀释４倍所得;∗．P＜０．０５,∗∗．P＜０．０１,∗∗∗．P＜０．００１图６㊀耐氧驯化前后长双歧杆菌M E F ZＧ２２０１短链脂肪酸的产生量F i g u r e６㊀S h o r tＧc h a i n f a t t y a c i d p r o d u c t i o no f B i f i d o b a c t e r i u ml o n g u m M E F ZＧ２２０１b e f o r e a n da f t e r o x y g e n t o l e r a n c e d o m e s t i c a t i o n７１|V o l．３９,N o．１０张㊀凤等:母乳源长双歧杆菌的筛选鉴定及耐氧驯化丙酸产生量显著减少.有研究[２１]证明,乙酸等短链脂肪酸作为主要的抑菌物质,其作用是到达细胞质后进行解离,降低胞内的p H或胞内有机酸的离子积累,导致致病菌的死亡.因此,驯化后的长双歧杆菌与驯化前相比,抑菌性能可能会有所提升.３㊀结论研究通过稀释涂布法及１６Sr D N A鉴定法从母乳中筛选得到一株长双歧杆菌M E F ZＧ２２０１,并采用逐渐增加氧分压㊁有氧厌氧交替驯化的方法进行驯化,驯化后的菌株较驯化前可以更好地在有氧条件下生长,比未经驯化的菌株活菌数提高了一个数量级.通过测定驯化前后菌株的生理生化及形态特征发现菌株并未发生变异,在短链脂肪酸的产生量上驯化后菌株在厌氧条件下产酸量也显著高于驯化前的菌株,因此,耐氧驯化后的长双歧杆菌菌株较驯化前可能具有更好的性能.在今后的工作中将进一步通过全基因组测序结合生物信息学对此株菌进行安全性评估,深入研究其耐氧机制,以及相关益生菌产品的开发,以期挖掘长双歧杆菌M E F ZＧ２２０１的潜在价值.参考文献[1]ZIMMERMANN P,CURTIS N.Factors influencing the intestinalmicrobiome during the first year of life[J].Pediatric Infectious Disease Journal,2018,37(12):E315ＧE335.[2]GRONLUND M M,GUEIMONDE M,LAITINEN K,et al. 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保健食品各功能需要做的动物及人体试验
保健食品各功能需要做的动物及人体试验功效成分或标志性成分检测、卫生学试验、稳定性试验、复核检验（一）只要求动物实验的项目有：1. 增强免疫力功能检验方法主要指标：细胞免疫功能体液免疫功能单核－巨噬细胞功能NK细胞活性测定判定：四项指标中任两项结果阳性。
注意事项：不认可增强单项免疫力功能。
2. 改善睡眠功能检验方法主要指标：戊巴比妥纳睡眠时间实验巴比妥钠睡眠潜伏期实验戊巴比妥钠（或巴比妥钠）阈下剂量催眠实验判定：3项实验中任2项阳性，且直接睡眠作用。
注意事项：对动物进行直接睡眠实验时，也要同样注意进行30天灌胃。
3. 缓解体力疲劳检验方法主要指标：血乳酸血清尿素肝糖原/肌糖原动物负重游泳实验判定：负重游泳实验结果阳性，血乳酸曲线下面积、血清尿素、肝糖/肌糖原3项生化指标中任2项指标阳性。
注意事项：（1）对同批受试样品进行违禁药物的检测。
（2）在负重游泳实验时，酒类样品测试当天可以不灌胃。
4. 提高缺氧耐受力功能检验方法主要指标：常压耐缺氧实验亚硝酸钠中毒存活实验急性脑缺血性缺氧实验判定：三项试验中任二项实验结果阳性。
注意事项：每批实验动物的体重尽量保持一致。
5. 对辐射危害有辅助保护功能检验方法主要指标：外周血白细胞计数骨髓细胞DNA含量或骨髓有核细胞数小鼠骨髓细胞微核实验血/组织中SOD活性实验血清溶血素含量实验判定：以上5项实验中任3选项进行实验，3项实验中任何2项实验结果阳性。
注意事项：选用小鼠，受试样品于照射前给予14～30天，照射后仍然给予受试物，必要时可延至45天。
6. 增加骨密度功能检验方法根据受试样品作用的原理不同，分为方案一（补钙为主的受试物）和方案二（不含钙或不以补钙为主的受试物）两种。
主要指标：体重骨钙含量骨密度判定：（方案一）骨钙含量/骨密度显著高于低钙对照组且不低于相应剂量的碳酸钙对照组，钙的吸收率不低于碳酸钙对照组。
（方案二）①不含钙的产品：骨钙含量/骨密度较模型对照组明显增加，其它指标（体重除外）不显著低于卵巢切除＋溶剂组。
食品微生物学检验菌种鉴定
菌种鉴定计划一、菌种鉴定时间安排1.菌种收集整理：将质检和研发全部菌种统一收集整理，制作统计表格。
计划三个工作日内完成2.将菌种分几个大类，分批次进行复活和鉴定：根据微生物生长速度和鉴定的难易程度进行安排，每批次鉴定10~20株菌种，一周进行一批次实验。
大肠埃希氏菌大肠菌群沙门氏菌志贺氏菌李斯特氏菌铜绿假单胞菌葡萄球菌乳酸菌、链球菌等革兰氏阳性菌弧菌芽孢杆菌霉菌及酵母菌空肠弯曲菌、生孢梭菌、产气荚膜梭菌等对氧气有要求的菌3.完成鉴定报告：每株菌经鉴定后均做出鉴定报告，报告包括实验记录及鉴定过程的照片资料，经鉴定符合的菌株保存瓷珠继续使用。
计划每批次鉴定报告撰写2天。
二、各类菌种鉴定方法1.革兰氏阴性菌：纯培养后染色镜检，并接种到相应的分离平板，观察菌落特征是否典型，用博检系统进行生化鉴定，必要的可用相应的生化鉴定条进行鉴定。
2.李斯特氏菌：纯培养后染色镜检，并接种到李斯特显色培养基和PALCAM上观察菌落特征，利用李斯特氏菌生化鉴定条进行鉴定，另用血平板做溶血试验。
3.葡萄球菌：纯培养后染色镜检，并接种到B-P琼脂和血平板，观察菌落特征，然后做血浆凝固酶实验进行鉴定。
4.链球菌：纯培养后染色镜检，接种血平板观察溶血情况，然后分类，β溶血链球菌进行链激酶试验和杆菌肽敏感试验，α溶血和γ溶血菌进行高盐试验根据结果进行判断。
5.弧菌：纯培养后染色镜检，接种TCBS平板和弧菌显色平板观察菌落特征，然后利用弧菌鉴定条进行生化鉴定。
6.乳酸菌：纯培养后染色镜检，接种MRS或MC平板观察菌落特征，双歧杆菌接种双歧杆菌琼脂培养，然后利用乳酸菌鉴定条进行生化鉴定7.芽孢杆菌：纯培养后染色镜检，接种MYP和血平板，做溶血试验、根状生长试验、溶菌酶耐性实验和蛋白质毒素结晶试验，并利用蜡样鉴定条进行生化鉴定。
8.霉菌：根据菌落颜色形态、菌丝形态、孢子形态进行判断。
9.酵母菌：纯培养后染色镜检，接种到PDA平板和孟加拉红平板观察菌落形态，必要的做一些生化鉴定。
保健食品原料用菌种安全性检验与评价技术指导原则(2020年版)
保健食品原料用菌种安全性检验与评价技术指导原则（2020年版）1 范围本指导原则规定了保健食品原料用细菌、丝状真菌（子实体除外）和酵母的安全性评价中的致病性（毒力）检验与评价程序和方法。
本指导原则适用于保健食品原料用菌种（包括保健食品配方用及原料生产用菌种）的致病性检验与评价。
本指导原则不适用于基因改造微生物菌种和在我国无使用习惯的菌种致病性检验与评价。
2 术语和定义2.1 致病性，Pathogenicity微生物感染宿主造成健康损害引起疾病的能力。
2.2 产毒能力，Toxigenicity微生物产生对人和动物有毒作用的活性代谢产物的能力。
2.3 毒性，Toxicity微生物及其代谢产物对机体可能造成的潜在伤害（不良反应）。
3 对拟评价微生物菌种需提交的基本资料要求在进行致病性评价试验前，菌种送检单位需提供以下资料供评价单位审核。
3.1 基本信息拟评价菌种名称（包括学名、俗名、曾用名、拉丁名等）、来源及用途。
3.2 菌种分类学资料提供由有菌种鉴定资质的机构出具的对拟评价菌种的规范、科学的分类学（属、种名称及株）资料。
细菌的分类和命名应遵循原核生物分类学国际委员会（International Committee on Systematics of Prokaryotes）的规定，并符合原核生物国际命名法规（International Code of Nomenclature of Prokaryotes）要求。
真菌的分类和命名应按国际藻类、真菌和植物命名法规（International Code of Nomenclature for algae, fungi, and plants）进行。
3.3 菌种鉴定资料根据目前已有的知识，提供基于表型及基因测序技术鉴定到种水平的资料。
作为保健食品的功效成分（活菌），还应提供鉴定到株水平的资料。
3.4 菌种生长环境条件资料提供拟评价菌种生长最适培养基及培养条件（培养时间、培养温度和湿度、光照等），以及菌种保藏及复壮方法等相关资料。
保健食品注册检验相关规定
咖啡因
GB/T 5009.139-2003
丙烯酰胺
CTC-VM-011-2009
苏丹红（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）
NY/T 1258-2007
安赛蜜（乙酰磺胺酸钾）
GB/T 5009.140-2003
双酚A
GB/T 23296.16-2009
抗氧化剂（BHA、BHT、TBHQ）
GB/T 5009.30-2003
视样品基质而定
氯霉素类(氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考)
视样品基质而定
硝基呋喃代谢物（AOZ,AMOZ,SEM,AHD）
视样品基质而定
糖皮质类激素（泼尼松龙、甲基泼尼松、地塞米松、倍氯米松）
视样品基质而定
雄性激素（醇勃龙（去甲雄三烯醇酮）、睾酮、甲基睾酮、诺龙（19-去甲睾酮）、丙酸诺龙）
视样品基质而定
杂质
组织状态
一般理化指标
pH值
备案企业标准
净含量/负偏差
备案企业标准
脂肪
GB/T 5009.6-2003
蛋白质
GB 5009.5-2010
水分
GB 5009.3-2010
灰分
GB 5009.4-2010
（相对）密度
备案企业标准
崩解时限
中国药典2010年版(二部)附录XA
酸价（以氢氧化钾计）
GB/T 5009.37-2003
溶血性链球菌
GB/T 4789.11-2003
霉菌和酵母
GB 4789.15-2010
重金属
铅
GB 5009.12-2010
砷
GB/T 5009.11-2003
汞
GB/T 5009.17-2003
GB4789. 35乳酸菌检验
食品安全国家标准
食品微生物学检验 食品中乳酸菌检验
GB 4789.35－2010
定义
GB/T 4789.35－2007: 检验方法有三部分： 第1部分：分离与计数方法； 第2部分：PetrifilmTM测试片法； 第3部分：乳杆菌的PCR法
SN标准
GB/T 4789.35－2008 乳酸菌饮料中乳酸菌检验修订
本标准与GB/T 4789.35－2003相比主要修 改如下： ——将选择性分离培养基由改良TJA 培养基 （改良番茄汁琼脂培养基）改为MRS培养基； ——增加API 50CH 诊断试剂条； ——乳酸菌计数由倾注法改为涂布法。
乳酸菌计数
乳杆菌计数 乳酸菌总数结果减去 双歧杆菌与 嗜热链球 菌计数结果之和即得乳杆菌计数。
报告（GB/T4789.35-2008）
根据菌落计数结果出具检测报告。最终确定 的乳酸菌菌落在30～300之间的平板计数， 再乘以相应的稀释倍数，修约保留两位有效 数字，之后的数字，采用10的指数表示。参 照GB/T 4789.2规定。每克（或毫升）食品 中所含有的乳酸菌数以CFU/g（mL）表示。
结果的表述
7.4.1 若只有一个稀释度平板上的菌落数在 适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平 均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为 每g（mL）中菌落总数结果。 7.4.2 若有两个连续稀释度的平板菌落数在 适宜计数范围内时，按公式（1）计算：
7.4.3 若所有稀释度的平板上菌落数均大于300 CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平 板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以 最高稀释倍数计算。 7.4.4 若所有稀释度的平板菌落数均小于30 CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释 倍数计算。 7.4.5 若所有稀释度（包括液体样品原液）平 板均无菌落生长，则以小于1 乘以最低稀释倍 数计算。 7.4.6 若所有稀释度的平板菌落数均不在30 CFU～300 CFU 之间，其中一部分小于30 CFU 或大于300CFU 时，则以最接近30 CFU 或300 CFU 的平均菌落数乘以稀释倍数计算。
双歧杆菌的分类学原理
双歧杆菌的分类学原理双歧杆菌（Lactobacillus）是一类革兰氏阳性、非芽胞形成的革兰氏阳性菌，它们属于杆菌科（Lactobacillaceae），乳杆菌属（Lactobacillus）。
双歧杆菌是广泛存在于自然环境中的一类细菌，它们常见于人体的口腔、肠道、生殖道以及一些发酵食品中。
双歧杆菌的分类学原理主要基于菌株的形态学特征、生理生化特性、基因序列以及DNA杂交实验等多种指标。
以下是双歧杆菌分类学的主要原理和方法：1. 形态学特征：通过观察菌落形态、菌株形态、胞形、大小和运动性等特征来判断菌株的分类位置。
例如，双歧乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）的菌落为凹陷的黄白色，乳白色粘液状菌株，且细胞形态为长条形，有运动性。
2. 生理生化特性：通过菌株对各种营养物质的利用和产物的生成来判断其代谢特性。
例如，双歧乳杆菌能利用葡萄糖发酵产生乳酸和醋酸等有机酸。
3. 基因序列：通过对菌株的16S rRNA序列进行比较和分析，可以揭示菌株的进化关系和分类位置。
这是目前最常用的分类学方法之一。
例如，通过分析16S rRNA序列，可以将乳双歧杆菌（Lactobacillus casei）和益生菌（Lactobacillus rhamnosus）等置于同一物种下。
4. DNA杂交实验：将目标菌株的DNA与已知标准菌株的DNA进行杂交实验，根据两者的同源性，评估菌株的亲缘关系和分类位置。
例如，通过DNA杂交实验证实了酸乳酸菌（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）和酸双歧乳杆菌（Lactobacillus helveticus）属于同一物种。
双歧杆菌的分类学原理和方法主要基于菌株的形态学、生理生化、基因序列和DNA杂交等多个方面的综合分析。
利用这些分类学原理和方法，可以对双歧杆菌进行准确的分类和鉴定，为人们深入研究和应用双歧杆菌提供了科学依据。
食品安全国家标准
食品安全国家标准
食品用菌种
（行业内征求意见稿）
发布实施
食品安全国家标准
食品用菌种
1 范围
本标准适用于预包装的食品用菌种产品。
2 术语和定义
2.1 食品用菌种
可用于食品中的一种或多种活的微生物（包括细菌、真菌和酵母），经发酵培养、分离、干燥或不干燥等工序制成的产品。
按照用途，分为可直接食用菌种和食品发酵用菌种。
2.1.1 可直接食用菌种
可直接食用的活的微生物菌种。
2.1.2 食品发酵用菌种
食品发酵生产过程中用于发酵的微生物菌种。
3 技术要求
原料要求
3.1.1 菌种
应使用经安全性评价后确认安全的菌种，确保其对人体健康不造成任何急性、亚急性、慢性或者其他潜在性危害。
可用于食品的菌种名单见附录及相关公告。
3.1.2 其他原料
培养过程中使用的,以及为保证菌种存活、储存、标准化添加的原料应符合相应的食品标准和有关规定。
3.2 感官要求：
感官要求应符合表的规定。
3.3 活菌总数
活菌总数应符合表的规定。
3.4 微生物限量
微生物限量应符合表的规定。
3.5 食品添加剂
食品添加剂的使用应符合的规定。
4 标签
应符合的要求，标示食品用菌种的种（株），可直接食用的产品还应标示活菌总数。
附录
可用于食品的菌种名单
附录
可用于婴幼儿食品的菌种名单。
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食品中双歧杆菌检验方法
环凯针对目前乳制品行业及质量监测单位检验双歧杆菌的需求及情况，对双歧杆菌检验相应的培养基进行了改进，使得双歧杆菌检出率较之前有很大的改进。
扩充并完善了相关的微生物检测试剂，使得技术操作人员能更准确、快捷的检测出目标菌。
环凯依据GB 4789.34-2012食品卫生微生物学检验双歧杆菌检验，推出成套的双歧杆菌检验解决方案，为生产企业及检验单位提供方便。
图1：GB 4789.34-2012双歧杆菌检验流程图
表1：实验操作所用培养基及生化试剂
功能阶段实
验
序
产品序
号
产品名称规格类别
号
稀释液1 CP0630 生理盐水
225mL×
10袋
盒（袋装）
平板分离2 027330
双歧杆菌琼脂培养基（BBL
琼脂培养基）
250g 瓶（干粉）
生理生化
3 029010 革兰氏染色液
10mL×4
支
盒
4 029161 过氧化氢酶试剂
2mL×10
支
盒（西林
瓶）
5
027340 PYG液体培养基基础250g 瓶（干粉）SR0300
PYG液体培养基配套试剂
（A、B各一支添加于100 ml
基础培养基中）
2种×5支
/盒
盒（西林
瓶）
6 027350 TPY液体培养基250g 瓶（干粉）
7 029010 革兰氏染色液
10mL×4
支
盒
8 029080 甘油
2mL×10
支
盒（西林
瓶）
9 075060 D-阿拉伯糖20支
盒（西林
瓶）
10 075400 D-核糖20支
盒（西林
瓶）
11 075070 D-木糖20支
盒（西林
瓶）
12 075080 D-半乳糖20支
盒（西林
瓶）
13 075010 D-葡萄糖20支
盒（西林
瓶）
14 075550 D-果糖20支
盒（西林
瓶）
15 075380 D-甘露糖20支
盒（西林
瓶）
16 075110 L-鼠李糖20支
盒（西林
瓶）
17 075100 卫矛醇20支
盒（西林
瓶）
18 075120 肌醇20支
盒（西林
瓶）
19 075040 甘露醇 20支 盒（西林瓶） 20 075090 山梨醇
20支 盒（西林瓶） 21 075160 七叶灵（七叶苷）
20支
盒（西林瓶） 22 075140 水杨甙（水杨苷，水杨素） 20支 盒（西林瓶） 23 075570 D-纤维二塘 20支 盒（西林瓶） 24 075030 D-麦芽糖 20支 盒（西林瓶） 25 075020 D-乳糖 20支 盒（西林瓶） 26 075560 D-蜜二糖 20支 盒（西林瓶） 27 075050 D-蔗糖
20支 盒（西林瓶） 28 075530 D-海藻糖（覃糖） 20支 盒（西林瓶） 29 075540 菊糖（菊根粉） 20支 盒（西林瓶） 30 075430 D-松三糖 20支 盒（西林瓶） 31 075230 D-棉籽糖 20支 盒（西林瓶） 32 075480 淀粉 20支 盒（西林瓶） 33 075420
D-松二糖
20支
盒（西林瓶）。