维生素的测定

步骤：
（1）预处理：皂化、提取、洗涤、浓缩 （2）制备标准曲线：用VA标准液绘制，用CHCl3调零。注 意在移入光路前，迅速加入三氯化锑，6秒内测定 (3)样品测定：用样品溶液代替标准液溶液。

说明
(1)萃取时,不要用力过猛,避免发生乳化。 （2）氯仿中必须无水，因三氯化锑遇水会出现沉淀，干 扰比色测定。 （3）由于三氯化锑与VA所产生的兰色物质不稳定，注意 在移入光路前，迅速加入三氯化锑，6秒内测定。 （4）三氯化锑腐蚀性强，且遇水生成白色沉淀，实验用 过的仪器要先用稀盐酸浸泡后再清洗。
标准 视黄醇 γ-生育酚 δ-生育酚 a-生育酚 比吸光系数E (1%,cm) 测定波长（nm） 1835 325 71 294 92.8 91.2 298 298
（1）.维生素A和维生素E标准溶液的标定：取上
标准溶液浓度计算：
A 10 F E
p-某维生素浓度，mg／mL； A-维生素的平均紫外吸光值； E-某种维生素l％比吸光系数; F-稀释倍数。

（3）浓缩：
将乙醚提取液经无水硫酸钠（约5g）滤入150 mL旋转 蒸发瓶内，用约15mL乙醚冲洗分液漏斗及无水硫酸钠 2次，并入蒸发瓶内，于55℃水浴中减压蒸馏并回收乙 醚，醚剩下约2mL时，取下蒸发瓶，用氮气吹干乙醚， 随即加人2mL乙醇，充分混合，溶解提取物。将乙醇 液移人塑料离心管中，于离心机上离心5min（5000r／ min），上清液供色谱分析用。


液相色谱推荐条件：
分析柱：C18反相柱 5µm，4.6mmX25Cm； 流动相：甲醇：水=98：2，混匀，临用前 脱气； 紫外检测器波长：300nm; 进样量：20 µL； 流速：1.70mL/min。

标准曲线的制备
述配制的维生素A、E的标准溶液按一定的倍数进行 稀释，在下表要求的条件下测定其吸光度，根据其 吸光系数计算其准确浓度。
原理：硫胺素（VB1）在碱性铁化钾溶液中被氧化 为嘧噻色素，在紫外线照射下，嘧噻色素发出荧 光。在给定条件下，以及没有其他荧光物质干扰 时，荧光强度与嘧噻色素成正比，即与溶液中硫 胺素量成正比。 试样在硫酸作用下,加热提取VB1.冷却后用淀粉酶在 pH=4.5时处理使VB1分离如果样品中含杂质过多， 应经离子交换剂处理，使硫胺素与杂质分离，然 后以所得溶液做测定。 测定步骤：提取→净化→氧化→测定 加入淀粉酶的作用:使结合态VB1变为游离态VB1.

讨论：P202 思考题：1、3、4
5.7.7 维生素C（抗坏血酸）的测定


维生素C的生理功能及性质
维生素C是一种己糖醛基酸，有抗坏血病的作 用，所以又称作抗坏血酸。维生素C具有较强 的还原性，对光敏感，氧化后的产物称为脱 氢抗坏血酸，仍然具有生理活性。进一步水 解则生成2，3-二酮古乐糖酸，失去生理作用。 在食品中，这三种形式均有存在，但主要是 前两者，故许多国家的食品成分表均以抗坏 血酸和脱氢抗坏血酸的总量表示。
5.7 维生素的测定

概述 脂溶性维生素A、E的测定 水溶性维生素 B、C的测定
5.7.1 概述
（1）维生素的分类及生理功能 （2）测定的目的和意义 （3）维生素的测定方法
1、维生素的分类及生理功能

功能： 维生素是维持人体正常生命活动所必需的一类 小分子有机化合物。它的结构复杂，种类多， 目前已经确认的有30多种，其中有20种被认为 与维持人体健康和促进生长发育是至关重要的。 维生素的主要功能是通过作为辅酶的成分调节 代谢过程，人体对它的需要量极少，但作用非 常大。它一般在体内不能合成或合成量不能满 足生理需要，必须经常从食物中摄取；长期缺 乏任何一种维生素都会导致相关新陈代谢的紊 乱，出现各种特有的症状。

VE的性质：又称生育酚，目前已经确认的有
8种异构体，最常见的有α、β、γ、δ-生育酚。 溶于脂溶性溶剂，对热稳定，酸性环境中比碱 性环境中稳定，无氧条件下，对热、光及碱性 环境中也相对稳定。VE广泛分布在各种粮食的 胚和植物油中。


测定原理： （1）液相色谱的原理：液相色谱是采用液体为流动
相的一种色谱法。高效液相色谱仪由高压泵、进样 装臵、色谱柱、检测器、记录和数据处理装臵等部 分组成。高压泵以恒定的流量，从贮液容器吸取作 为流动相的溶剂输送到色谱柱，试样由进样装臵导 入，随流动相在色谱柱内进行分离。分离后的组分 进入检测器检测，并用记录仪绘出色谱图，或与其 他数据处理装臵相连，由数据处理系统进行数据处 理 色谱图：某一波长下各个不同时刻的吸光度值描点作 图。
5.7.4、β-胡萝卜素的测定（HPLC法）


源自文库
试样中的β-胡萝卜素，用石油醚+丙酮混 合液提取，经三氧化铝柱纯化，然后以高 效液相色谱法测定，以保留时间定性，以 峰高或峰面积定量。 注意：浓缩提取液时，防止蒸干，避免胡 萝卜素在空气中氧化或因高温、紫外线直 射等破坏。
5.7.5、维生素B1的测定——荧光法
（5）维生素的含量可用国际单位（IU）表示：
1国际单位（IU）=0.3 ug维生素A
=1mg维生素E =0.025 ug维生素D


5.7.3 维生素A的测定（三氯化锑比色法）
原理：
VA+三氯化锑→蓝色物质，于620nm测吸光度，与 标准比较定量。

试剂：
无水Na2SO4、乙酸酐：吸水 乙醚：抽提 乙醇、KOH：皂化反应 三氯甲烷：溶剂 三氯化锑-三氯甲烷：反应试剂 酚酞：用于鉴别洗涤液中有无碱
分类： 按维生素溶解性能可将它们分成两大类：

一类是能溶在脂肪或脂溶性溶剂中的， 叫脂溶性维生素（如A、D、E、K等）； 另一类是能溶解在水中的，叫水溶性维 生素（如B1、B2、B6、C、 B12等）。
2、测定的目的和意义
多数维生素的性质是不稳定的，对光、氧、 热、PH等非常敏感，食物在加工、储存、运输、 销售等一系列环节都可能造成维生素的损失。 为了弥补这种损失，维生素常常作为强化剂在 食品工业的某些产品中使用。
意义：
（1）可评价食品的营养价值； （2）开发利用富含维生素的食品； （3）可以研究食品在不同的加工、储存条件 下的稳定性，进而指导人们制定合理的工艺 条件，减少维生素的损失； （4）起到监督维生素强化食品的剂量，以防 摄入过多的维生素而引起中毒。



3、维生素的测定方法 微生物法：基于某种微生物生长需要特定的维 生素，方法特异性强、灵敏度高、不需要特殊 仪器，样品不需经特殊处理，但只能测定水溶 性维生素。 化学法：比色法、滴定法 仪器法：色谱法、荧光法、酶法、免疫法等。 特别是HPLC可用于大多数维生素的测定，并 且在某些条件下可同时分析几种维生素，但分 析费用较高。 应根据不同的食品基质和条件选择不同的分析 方法

5.7.6、维生素B2的测定——荧光法


原理：试样在稀盐酸中水解、酶解，调整 PH值， 过滤除去蛋白质等物质；试样溶液经高锰酸钾氧 化，除去干扰物，再经硅镁吸附剂的柱层析，提 纯的核黄素在波长525nm下发生黄绿色荧光，在稀 溶液中其荧光强度与核黄素的浓度成正比。再加 入低亚硫酸钠，将VB2还原成无荧光的物质，然后 再测定试液中残余荧光杂质的荧光，两者相差即 为食品中核黄素所产生的荧光强度。 测定核黄素的方法还有：微生物法和HPLC法。
重点讲解的方法： 高效液相色谱法（HPLC法）同时测 定脂溶性维生素A和维生素E 比色法测定维生素A HPLC法测定胡萝卜素 荧光法测定 B1、B2 滴定法和比色法测定维生素C
5.7.2 维生素A、E的测定（HPLC法） VA的性质：
维生素A是β-紫罗酮环与一元醇所组成的一类 化合物及其衍生物的总称。通常所说的维生素 A是指视黄醇或视黄醇醋酸酯。 ⑴ 因有许多不饱和链，故见光易分解； ⑵ 在缺氧情况下，对热较稳定，对光特别敏感。 如测强化奶粉时，速度要快，一般要求测定时 间长短，因为时间长，见光时间长，见光分解， 故测出的比出厂的含量要少； ⑶ 不溶于水，溶于有机溶剂，对碱稳定；


样品分析：
取样品处理液20 µL，用标准溶液同样的条件进行色谱 分析，绘制色谱图。 定性：根据保留时间定性 定量：根据色谱图求出某种维生素的峰面积与内标物 峰面积的比值，以此比值在标准曲线上查得待测维生 素的含量。

计算：

V
100 m 1000
式中： X—某种维生素的含量，mg／100g； p—由标准曲线上查到的某种维生素含量， µg/mL； V—样品浓缩后定容体积，mL； m—样品质量，g。
（2）标准曲线的制备:
本方法采用内标法定量。把高、低两个浓度的维生素 A、γ-生育酚、a-生育酚、 δ-生育酚及内标苯并芘液混 合，（其内标苯并芘的浓度值相同）将二种浓度的混 合标准进行色谱分析，结果见色谱图。以维生素峰面 积与内标物峰面积之比为纵坐标，维生素的浓度 (ug/mL）为横坐标绘制标准曲线。

仪器和设备
（1）高效液相色谱仪带紫外分光检测器。 （2）旋转蒸发器。 （3）高速离心机（带小塑料离心管） （4）高纯氮气。 （5）紫外分光光度计。


样品处理
（1）皂化：
称取适量样品（含维生素A约3μg，维生素E各异构体 约40 μg ）于三角瓶中，加30mL无水乙醇，振摇使样品 分散。加入 5mL100g／L抗坏血酸溶液和 2.0mL苯并芘 内标液，混匀，加 10mL氢氧化钾溶液（50％浓度）， 混匀，于沸水回流30min，使皂化完全，皂化后立即放 入冰水中冷却。
思考： 1、皂化时加入Vc的作用是什么？

（2）提取： 将皂化后的样品移入分液漏斗中，用50mL水 分2-3次洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗中。用 100mL无水乙醚分2次洗皂化瓶及残渣，乙醚 液并入分液漏斗中。轻轻振摇2min，静臵分 层，弃去水层。然后每次用约50mL水将乙醚 液洗至中性，需洗4~5次

（2）高效液相色谱检测样品中的维生 素A、E的原理：样品中的维生素E及维
生素A经皂化提取处理后，将其从不皂 化部分提取至有机溶剂中。用高效液相 色谱法C18反相柱将维生E和维生素A分 离，经紫外检测器检测，并用内标法定 量
（3）什么是内标法？
取标准被测成分，按依次增加或减少的已知阶段量， 各自分别加入各单体所规定的定量内标准物质中，调 制成标准溶液。分别取此标准液的一定量注入色谱柱， 根据色谱图取标准被测成分的峰面积或峰高和内标物 质的峰面积或峰高的比例为纵坐标，取标准被测成分 量和内标物质量之比或标准被测成分量为横坐标，制 成标准曲线。 然后按单体中所规定的方法调制试样液，调制试样液 时，预先加入与调制标准溶液等量的内标物质，然后 按制作标准曲线时的同样条件下得出色谱图，求出被 测成分的峰面积或峰高和内标物质的峰面积或峰高之 比，再按标准曲线来求出被测成分的含量。 内标物的选取原则：能与被测成分完全分离，但其保 留时间又尽可能接近被测成分的稳定的物质。

标准溶液的配制
（1）维生素 A标准液：视黄醇（纯度85％）或视黄醇乙 酸酯（纯度90％）经皂化处理后使用。用脱醛乙醇溶 解维生素A标准品，使其浓度大约为lmg/mL。临用前 用紫外分光光度法标定其准确浓度。 （2）维生素E标准液：a-生育酚（纯度95％），γ-生育酚 （纯纯95％）， δ-生育酚（纯度95％）。用脱醛乙醇 分别溶解以上三种维生素E标准品，使其浓度大约为 lmg/mL,临用前用紫外分光光度法分别标定此三种维生 素E的准确浓度。 （3）内标溶液：称取苯并芘（纯度98％），用脱醛乙醇 配制成10ug/mL 的内标溶液。

说明及讨论
（1）维生素极易被光破坏，实验操作应在微弱光线下 进行，或使用棕色玻璃仪器。 （2）乙醚为溶剂的萃取体系，易发生乳化现象。在提 取、洗涤操作中，不要用力过猛，若发生乳化，可 加几滴乙醇破乳。 （3）本法是国家标准检验方法，适用于各种食物和饲 料中维生素A和维生素E的同时测定。 （4）本法不能将β-生育酚γ-生育酚分开，所以γ-生育酚 的色谱峰中含有β-生育酚。

试剂
（1）无水乙醚：不含有过氧化物。 （2）无水乙醇：不得含有醛类物质。 （3）无水硫酸钠。 （4）甲醇：重蒸后使用。 （5）重蒸水：水中加少量高锰酸钾，临用前蒸馏。 （6）抗坏血酸溶液（100g／L）：临用前进行配制。 （7）氢氧化钾溶液（50g／100g）：取50g氢氧化钾,溶 于50g水中，混匀