chapter 3 外植体选择和灭菌
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2-2外植体
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衰败型
NH4＋ 生长素
保守分裂型
NH4＋ 生长素
细胞分裂素 NO3-
亢进分裂型
成功案例：王海波（1989）通过调整培养基中 2，4-D的水平建立了小麦胚性愈伤组织无性系， 诱导了松脆愈伤组织，建立了悬浮系，游离原 生质体
六、愈伤组织的细胞分化
维管组织是最先分化的组织。
1 影响维管组织分化的因子 （1）生长素 （2）蔗糖（麦芽糖、海藻糖） （3）细胞分裂素 （4）温度、光照
栽培胡萝卜： 培养基中不含还原氮，只要氧化氮浓度相 当高，也能形成体细胞胚，但发生率低。 还原氮和氧化氮的最适合比是 10mmol/L : 40mmol/L
只以还原氮为氮源时，经常调节培养基的 PH值使其保持在5.4，胚胎发生率可与两种 氮比例适宜时相当。但当PH在4天内降到 4-3.5，对胚胎发生有抑制。 最低数量的内源还原氮量：5mmol/kg鲜组 织。
1%
2% 2.5－3.5% 4%
很少形成
形成 形成 很少或不形成
不形成
很少或不形成 形成 形成
但葡萄糖、果糖、其它单糖无作用。生长 素对维管组织分化所起的作用在很大程度 上取决于糖的存在。
第六节
愈伤组织中的形态发生
一、器官发生（organogenesis)（茎芽分化） 二、体细胞胚发生(somatic embryogenesis) 三 人工种子
禾谷类植物
外植体 诱导培养基（2，4-D） 愈伤组织
再生培养基（分化培养基）
（不含2,4-D或含IAA或NAA） 茎芽分化
苜蓿
外植体 诱导培养基（2，4-D，激动素） 愈伤组织
再生培养基（分化培养基）
衰败型
NH4＋ 生长素
保守分裂型
NH4＋ 生长素
细胞分裂素 NO3-
亢进分裂型
成功案例：王海波（1989）通过调整培养基中 2，4-D的水平建立了小麦胚性愈伤组织无性系， 诱导了松脆愈伤组织，建立了悬浮系，游离原 生质体
六、愈伤组织的细胞分化
维管组织是最先分化的组织。
1 影响维管组织分化的因子 （1）生长素 （2）蔗糖（麦芽糖、海藻糖） （3）细胞分裂素 （4）温度、光照
栽培胡萝卜： 培养基中不含还原氮，只要氧化氮浓度相 当高，也能形成体细胞胚，但发生率低。 还原氮和氧化氮的最适合比是 10mmol/L : 40mmol/L
只以还原氮为氮源时，经常调节培养基的 PH值使其保持在5.4，胚胎发生率可与两种 氮比例适宜时相当。但当PH在4天内降到 4-3.5，对胚胎发生有抑制。 最低数量的内源还原氮量：5mmol/kg鲜组 织。
1%
2% 2.5－3.5% 4%
很少形成
形成 形成 很少或不形成
不形成
很少或不形成 形成 形成
但葡萄糖、果糖、其它单糖无作用。生长 素对维管组织分化所起的作用在很大程度 上取决于糖的存在。
第六节
愈伤组织中的形态发生
一、器官发生（organogenesis)（茎芽分化） 二、体细胞胚发生(somatic embryogenesis) 三 人工种子
禾谷类植物
外植体 诱导培养基（2，4-D） 愈伤组织
再生培养基（分化培养基）
（不含2,4-D或含IAA或NAA） 茎芽分化
苜蓿
外植体 诱导培养基（2，4-D，激动素） 愈伤组织
再生培养基（分化培养基）
任务三：外植体的选择和处理
子情境二、外植体的选择
1、确定取材部位 一方面要考虑材料的来源 是否有保证，另一方面也要考虑到经过脱分产 生大愈伤组织是否会引起不良变异，丧失了原 品种的优良性状，从而做到保质保量。 2、器官的生理状态和发育年龄 依据植物生 理学的基本观点，同一植株上的器官具有不同 的生理年龄，同种器的不同部位也具有不同的 生理年龄。 3、取材的季节 大多数植物应在其生长的季 节采样，处于生长末期或者已经进入休眠期的 外植体对诱导反映迟钝或无反应。
（3)不定芽的发育 在培养中由外植体产生不定芽，通常首 先要经脱分化过程，形成愈伤组织的细 胞。然后，经再分化 。 （4)体细胞胚状体的发生与发育 体细胞胚状体类似于合子胚但又有所不 同，它也通过球形，心形，鱼雷形和子 叶形的胚胎发育时期，最终发育成小苗 。
外植体的接种和培养
4、接种 （1）将初步洗涤及切割的材料放人烧杯，带入 超净台上，用消毒剂灭菌 。再用无菌水冲洗， 最后沥去水分，取出放置在灭过菌的4层纱布 上或滤纸上。 （2）材料吸干后，一手拿镊子，一手拿剪子或 解剖刀，对材料进行适当的切割。如叶片切成 0．5cm见方的小块；茎切成含有一个节的小 段。微茎尖要剥成只含1-2片幼叶的茎尖大小 等。在接种过程中要经常灼烧接种器械，防止 交叉污染。 (3)用灼烧消毒过的器械将切割好的外植体插植或 放置到培养基上。
园艺植物快繁与脱毒技术
任务三、外植体的选择和处理
学习目标：学习外植体的取材方法及外 植体褐变和玻璃化的处理方法 任务要求: 能够对外植体进行选择及处理 ，能够对掌握试管苗的驯化基本步骤， 能够对外植体的褐变及玻璃化采取相应 的处理方案。
学习内容：
外植体的选择与培养精选PPT
(1) 常用的培养基：①MS培养基；
无菌培养基上，这一过程叫做接种。 第三节 外植体的选择与培养
(6)接种工具随时蘸95%酒精灼烧，避免交叉污染； (1)在接种前1-2周用甲醛熏蒸接种室； 5、控制好移栽前10天的光、温、湿环境因子 (2)先解开包口纸，将试管等拿成斜角，使试管口在酒精火焰上方转动，灼烧数秒钟； 1、试管苗的生理状况：移栽壮苗 ②合适的培养条件： 第三节 外植体的选择与培养
（一）接种—无菌操作 (4)布质制品的灭菌
(5)无菌室的消毒 (6)操作人员一定要严格按照无菌操作的程序进行接种。
定义:把经表面灭菌处理后植物材料，切碎或分 第三节 外植体的选择与培养
2、植物生长调节物质：适当加入生长素，去除细胞分裂素，有利生根，提高成活率
离出器官、组织、细胞，再经无菌操作转接到 第三节 外植体的选择与培养
第三节 外植体的选择与培养
3、减轻褐变现象发生的措施
①选择合适的外植体： ②合适的培养条件： ③连续转移 ④加抗氧化剂： ⑤加活性炭
第三节 外植体的选择与培养
（三）玻璃化现象
1、定义：在长期的离体培养繁殖时，有些 试管苗的嫩茎、叶片呈现半透明水渍状， 这种现象称为玻璃化。
第三节 外植体的选择与培养
第三节 外植体的选择与培养
外植体成苗途径：
①植物品种
(1)在接种前1-2周用甲醛熏蒸接种室； (1)对接种材料进行消毒； 三、外植体的接种与培养
愈伤组织
根、芽
培 细养胞基分中 裂无 素机 浓离 度子 较种 高类 时及；比例不A当时。
芽根
第四节、试管苗驯化与移栽
(5)先用酒精棉球擦拭接种工具，再将镊子和剪子蘸95%酒精在酒精灯火焰上灼烧，放置冷却。
第三节 外植体的选择与培养
无菌培养基上，这一过程叫做接种。 第三节 外植体的选择与培养
(6)接种工具随时蘸95%酒精灼烧，避免交叉污染； (1)在接种前1-2周用甲醛熏蒸接种室； 5、控制好移栽前10天的光、温、湿环境因子 (2)先解开包口纸，将试管等拿成斜角，使试管口在酒精火焰上方转动，灼烧数秒钟； 1、试管苗的生理状况：移栽壮苗 ②合适的培养条件： 第三节 外植体的选择与培养
（一）接种—无菌操作 (4)布质制品的灭菌
(5)无菌室的消毒 (6)操作人员一定要严格按照无菌操作的程序进行接种。
定义:把经表面灭菌处理后植物材料，切碎或分 第三节 外植体的选择与培养
2、植物生长调节物质：适当加入生长素，去除细胞分裂素，有利生根，提高成活率
离出器官、组织、细胞，再经无菌操作转接到 第三节 外植体的选择与培养
第三节 外植体的选择与培养
3、减轻褐变现象发生的措施
①选择合适的外植体： ②合适的培养条件： ③连续转移 ④加抗氧化剂： ⑤加活性炭
第三节 外植体的选择与培养
（三）玻璃化现象
1、定义：在长期的离体培养繁殖时，有些 试管苗的嫩茎、叶片呈现半透明水渍状， 这种现象称为玻璃化。
第三节 外植体的选择与培养
第三节 外植体的选择与培养
外植体成苗途径：
①植物品种
(1)在接种前1-2周用甲醛熏蒸接种室； (1)对接种材料进行消毒； 三、外植体的接种与培养
愈伤组织
根、芽
培 细养胞基分中 裂无 素机 浓离 度子 较种 高类 时及；比例不A当时。
芽根
第四节、试管苗驯化与移栽
(5)先用酒精棉球擦拭接种工具，再将镊子和剪子蘸95%酒精在酒精灯火焰上灼烧，放置冷却。
第三节 外植体的选择与培养
外植体的选择与培养
2、玻璃化现象产生的原因
细胞分裂素浓度较高时； 琼脂浓度低时； 温度低、光照时间长时； 气体交换不良时； 培养基中无机离子种类及比例不当时。
第三节 外植体的选择与培养
3、预防措施：
①适当控制培养基中无机营养成分； ②适当提高培养基中蔗糖和琼脂浓度； ③适当降低细胞分裂素和赤霉素浓度，增加生
长素量； ④增加自然光照，控制光照时间； ⑤降低培养温度，进行变温培养； ⑥增加容器通风，最好进行CO2施肥。
第三节 外植体的选择与培养
表面灭菌剂的种类较多，可选取1—2种使用。
常用灭菌剂使用浓度及效果比较表
灭菌剂 次氯酸钙 次氯酸钠
氯化汞 抗菌素
使用浓度(%)
9~10 2
0.1~1 4~50mg/L
持续时间 （min）
5~30 5~30 2~10 30~60
去除的难易
易 易 较难 中
效果
很好 很好 最好 较好
第1章 植物组织培养实验室 构建及操作技术
第三节 外植体的选择与培养
一、外植体的选择： 种质优良
选材
取材的最适时期
植株健壮 适宜的大小
第三节 外植体的选择与培养
二、外植体灭菌
1：对材料进行预处理 2：材料表面灭菌： 1）水洗,滤纸吸干; 2)70%酒精浸30～60s; 3）用灭菌剂处理; 4）用无菌水冲洗.
小麦试管苗
第四节、试管苗驯化与移栽
二、炼苗（驯化）
驯化的目的： 通过减肥、增光、降温、控水等措施，提高
试管苗对外界环境条件的适应性，提高光合 作用的能力，提高试管苗的移栽成活率。
第四节、试管苗驯化与移栽
三、试管苗的移栽
（一）移栽方法： 1、直接移栽法 2、常规移栽法 3、嫁接移栽法
细胞分裂素浓度较高时； 琼脂浓度低时； 温度低、光照时间长时； 气体交换不良时； 培养基中无机离子种类及比例不当时。
第三节 外植体的选择与培养
3、预防措施：
①适当控制培养基中无机营养成分； ②适当提高培养基中蔗糖和琼脂浓度； ③适当降低细胞分裂素和赤霉素浓度，增加生
长素量； ④增加自然光照，控制光照时间； ⑤降低培养温度，进行变温培养； ⑥增加容器通风，最好进行CO2施肥。
第三节 外植体的选择与培养
表面灭菌剂的种类较多，可选取1—2种使用。
常用灭菌剂使用浓度及效果比较表
灭菌剂 次氯酸钙 次氯酸钠
氯化汞 抗菌素
使用浓度(%)
9~10 2
0.1~1 4~50mg/L
持续时间 （min）
5~30 5~30 2~10 30~60
去除的难易
易 易 较难 中
效果
很好 很好 最好 较好
第1章 植物组织培养实验室 构建及操作技术
第三节 外植体的选择与培养
一、外植体的选择： 种质优良
选材
取材的最适时期
植株健壮 适宜的大小
第三节 外植体的选择与培养
二、外植体灭菌
1：对材料进行预处理 2：材料表面灭菌： 1）水洗,滤纸吸干; 2)70%酒精浸30～60s; 3）用灭菌剂处理; 4）用无菌水冲洗.
小麦试管苗
第四节、试管苗驯化与移栽
二、炼苗（驯化）
驯化的目的： 通过减肥、增光、降温、控水等措施，提高
试管苗对外界环境条件的适应性，提高光合 作用的能力，提高试管苗的移栽成活率。
第四节、试管苗驯化与移栽
三、试管苗的移栽
（一）移栽方法： 1、直接移栽法 2、常规移栽法 3、嫁接移栽法
(优选)外植体的选择与培养
第三节 外植体的选择与培养
外植体成苗途径：
愈伤组织
根、芽
A
外植体 B
C
胚状体 芽、根
芽根
试
根芽
管
苗
第三节 外植体的选择与培养
胚状体的产生途径：
(1)、直接从器官上发生 (2)、从愈伤组织发生 (3)、从游离的单细胞发生 (4)、从小孢子发生
诱导胚状体比诱导芽的优点：
(1)数量多 (2)速度快 (3)结构完整
本章小结：
(1) 常用的培养基：①MS培养基；②B5培养基；③ W基。
灭菌剂 次氯酸钙 次氯酸钠
氯化汞 抗菌素
使用浓度(%)
9~10 2
0.1~1 4~50mg/L
持续时间 （min）
5~30 5~30 2~10 30~60
去除的难易
易 易 较难 中
效果
很好 很好 最好 较好
第三节 外植体的选择与培养
三、外植体的接种与培养
（一）接种—无菌操作 定义:把经表面灭菌处理后植物材料，切碎或分
第三节 外植体的选择与培养
培养的环境条件:
温度
光照
培养室 培养条件
氧气
湿度
第三节 外植体的选择与培养
定义：培养物在培养基上生长一段时间以后，由 于营养物质枯竭，水分散失，以及代谢产物 的积累，必须转移到新鲜培养基上培养,这个 过程叫做继代培养。
第三节 外植体的选择与培养
四、外植体成苗途径
1、外植体→愈伤组织→根、芽→试管苗 ①同时长芽和根 ②先长芽，再长根 ③先长根，再长芽 2、外植体→胚状体→试管苗（胚状体途径） 3、外植体→根、芽→试管苗（器官发生途径）
四、提高试管苗移栽成活率的途径
外植体的选择和灭菌ppt课件
6
资金是运动的价值，资金的价值是随 时间变 化而变 化的， 是时间 的函数 ，随时 间的推 移而增 值，其 增值的 这部分 资金就 是原有 资金的 时间价 值
吐温的使用：0.1%，表面活性剂，浸润作用 无菌水:在用灭菌剂之前和之后均需用无菌水冲 洗数遍.
7
资金是运动的价值，资金的价值是随 时间变 化而变 化的， 是时间 的函数 ，随时 间的推 移而增 值，其 增值的 这部分 资金就 是原有 资金的 时间价 值
资金是运动的价值，资金的价值是随 时间变 化而变 化的， 是时间 的函数 ，随时 间的推 移而增 值，其 增值的 这部分 资金就 是原有 资金的 时间价 值
第一部分
组织培养技术
第四章 外植体的选择和灭菌
外植体（explant）：从植物体上分离的用于离体培养的植 物体部分。
第一节 外植体的选择
一、外植体的部位：根、茎、叶、花、果等 二、其它：如季节、生理状态和发育年龄等 三、外植体的大小
三、培养条件
温度：25±2℃； 光照：包括光照、光质和光周期； 培养基的pH:5.6-6.0;但若培养基中含有铁 离子， pH应在5.2以下. 湿度:培养容器的湿度常保持在100%; 培养 室的湿度70-80%. 气体:氧;二氧化碳;乙烯等.
10
资金是运动的价值，资金的价值是随 时间变 化而变 化的， 是时间 的函数 ，随时 间的推 移而增 值，其 增值的 这部分 资金就 是原有 资金的 时间价 值
3
资金是运动的价值，资金的价值是随 时间变 化而变 化的， 是时间 的函数 ，随时 间的推 移而增 值，其 增值的 这部分 资金就 是原有 资金的 时间价 值
取材季节
一般取母株生长旺盛的季节的材料
外植体的大小
资金是运动的价值，资金的价值是随 时间变 化而变 化的， 是时间 的函数 ，随时 间的推 移而增 值，其 增值的 这部分 资金就 是原有 资金的 时间价 值
吐温的使用：0.1%，表面活性剂，浸润作用 无菌水:在用灭菌剂之前和之后均需用无菌水冲 洗数遍.
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资金是运动的价值，资金的价值是随 时间变 化而变 化的， 是时间 的函数 ，随时 间的推 移而增 值，其 增值的 这部分 资金就 是原有 资金的 时间价 值
资金是运动的价值，资金的价值是随 时间变 化而变 化的， 是时间 的函数 ，随时 间的推 移而增 值，其 增值的 这部分 资金就 是原有 资金的 时间价 值
第一部分
组织培养技术
第四章 外植体的选择和灭菌
外植体（explant）：从植物体上分离的用于离体培养的植 物体部分。
第一节 外植体的选择
一、外植体的部位：根、茎、叶、花、果等 二、其它：如季节、生理状态和发育年龄等 三、外植体的大小
三、培养条件
温度：25±2℃； 光照：包括光照、光质和光周期； 培养基的pH:5.6-6.0;但若培养基中含有铁 离子， pH应在5.2以下. 湿度:培养容器的湿度常保持在100%; 培养 室的湿度70-80%. 气体:氧;二氧化碳;乙烯等.
10
资金是运动的价值，资金的价值是随 时间变 化而变 化的， 是时间 的函数 ，随时 间的推 移而增 值，其 增值的 这部分 资金就 是原有 资金的 时间价 值
3
资金是运动的价值，资金的价值是随 时间变 化而变 化的， 是时间 的函数 ，随时 间的推 移而增 值，其 增值的 这部分 资金就 是原有 资金的 时间价 值
取材季节
一般取母株生长旺盛的季节的材料
外植体的大小
第三章_外植体的选择和灭菌
对一些特别宝贵的材料，可以取出再次进行更严格 的灭菌，然后接入新鲜的培养基中重新培养。
要处理的污染培养瓶最好在打开瓶盖前，先集中进 行高压灭菌，再清除污染物，然后洗净备用。
精品课件
2 污染的防治措施
2.1 防止材料带菌的措施 2.2 外植体的灭菌 2.3 玻璃器皿的灭菌 2.4 金属器械的灭菌 2.5 布质制品的灭菌 2.6 无菌操作室的灭菌 2.7 操作
小结
第一节 外植体的选择 ：优良种质、健壮植株 、最适 的时期、适宜的大小。
第二节 外植体的灭菌方法：常用灭菌药剂的使用及其 效果 、外植体的灭菌方法。
第三节 污染原因和预防措施：污染的原因、污染的预
防措施（防止材料带菌、外植体的灭菌、器皿与金属
器械的灭菌、布质制品的灭菌、无菌操作室的灭菌、
操作人员在接种时一定要严格按照无菌操作的程序进
第一节 外植体的选择 第二节 外植体的灭菌方法 第三节 污染原因和预防措施
精品课件Βιβλιοθήκη 1 外植体的灭菌方法➢预处理：先对植物组织修整，去掉不需要的部分，流水 中冲洗干净。 ➢预处理的植物材料的灭菌： ➢ 原则： 充分灭菌，但不伤外植体 不同的外植体，灭菌的要求也不一样
精品课件
2 常用灭菌药剂的使用和效果
精品课件
2.4 金属器械的灭菌
火焰灭菌法：即把金属器械放在95%的酒精中浸一下， 然后放在火焰上燃烧灭菌。 这一步骤应当在无菌操作过程中反复进行。
干热灭菌法：即将拭净或烘干的金属器械用纸包好， 盛在金属盒内，放在烘箱中灭菌。
精品课件
2.5 布质制品的灭菌
湿热灭菌法：工作服、口罩、帽子等布 质品均用湿热灭菌法，即将洗净晾干的 的布质品，放入高压锅中，用1.1公斤/ 厘米2 （即15磅/英寸2），121 ℃的温 度，灭菌20 min～30min。
要处理的污染培养瓶最好在打开瓶盖前，先集中进 行高压灭菌，再清除污染物，然后洗净备用。
精品课件
2 污染的防治措施
2.1 防止材料带菌的措施 2.2 外植体的灭菌 2.3 玻璃器皿的灭菌 2.4 金属器械的灭菌 2.5 布质制品的灭菌 2.6 无菌操作室的灭菌 2.7 操作
小结
第一节 外植体的选择 ：优良种质、健壮植株 、最适 的时期、适宜的大小。
第二节 外植体的灭菌方法：常用灭菌药剂的使用及其 效果 、外植体的灭菌方法。
第三节 污染原因和预防措施：污染的原因、污染的预
防措施（防止材料带菌、外植体的灭菌、器皿与金属
器械的灭菌、布质制品的灭菌、无菌操作室的灭菌、
操作人员在接种时一定要严格按照无菌操作的程序进
第一节 外植体的选择 第二节 外植体的灭菌方法 第三节 污染原因和预防措施
精品课件Βιβλιοθήκη 1 外植体的灭菌方法➢预处理：先对植物组织修整，去掉不需要的部分，流水 中冲洗干净。 ➢预处理的植物材料的灭菌： ➢ 原则： 充分灭菌，但不伤外植体 不同的外植体，灭菌的要求也不一样
精品课件
2 常用灭菌药剂的使用和效果
精品课件
2.4 金属器械的灭菌
火焰灭菌法：即把金属器械放在95%的酒精中浸一下， 然后放在火焰上燃烧灭菌。 这一步骤应当在无菌操作过程中反复进行。
干热灭菌法：即将拭净或烘干的金属器械用纸包好， 盛在金属盒内，放在烘箱中灭菌。
精品课件
2.5 布质制品的灭菌
湿热灭菌法：工作服、口罩、帽子等布 质品均用湿热灭菌法，即将洗净晾干的 的布质品，放入高压锅中，用1.1公斤/ 厘米2 （即15磅/英寸2），121 ℃的温 度，灭菌20 min～30min。
第二章、第三章外植体选择和消毒
类植物花药和花粉培养；
4)B5培养基 特点：铵盐含量低，硝酸盐含量高，适合于
双子叶植物特别是木本植物的生长； 5)KM-8P培养基 1974年,原生质体培养而设计的。 特点:有机成分复杂，包括所有单糖和维生
素，适合原生质融合的培养。
1、湿热灭菌
原理： 注意事项：完全排除锅内空气 常用方法是：关闭放气阀，通电后，待压力上升到
O．05MPa时，打开放气阀，放出空气，待压力 表指针归零后，再关闭放气阀。关阀再通电后，压 力表上升达到0．1MPa时压力0．1-0．15MPa， 20min。
步骤： ⑴ 放水至平把架； ⑵ 把包扎好的培养基装入高压锅； ⑶ 盖上内锅盖,上紧螺帽，关上气阀和安全阀； ⑷ 然后接通电源、设置温度和时间； ⑸ 排冷空气（自动）； ⑹ 记时（自动） ⑺ 到时，关电源，降压至0，打开放气阀； ⑻ 开盖拿培养基 注意：经过灭菌的营养培养基不宜放置太长，应尽早使
二、母液的配制与保存
1.母液的配制方法 单配法：用a:b表示 混配法：用amg/L表示
2.母液的配制过程（MS）
1）大量元素母液
母 化合物名称 培 养 基 扩大 称 取 量 母 液 1 L 培 养 基
液
用 量 倍数 (mg) 体 积 吸 取 母 液
(mg/L)
(mL) 量（mL）
大 KNO3
用，但为了在使用前能检查培养基有无微生物污染， 可将培养基置于25℃下保存4天，如果培养基需要贮 存较长时间，可在4℃低温下保存。
第三节 常用培养基的配方及特点
一、常用培养基的配方 二、常用培养基的种类及其特点
二、培养基的种类及其特点
1）MS 培养基 产生：1962年，Murashige和Skoog； 特点：无机盐的浓度高，是稳定的平衡溶液； 2）White培养基 产生：1943年，White，1963年改良； 特点：无机盐浓度较低，适于生根培养； 3）N6培养基 特点：KNO3和（NH4）2SO4含量高，不含钼，适于禾谷
4)B5培养基 特点：铵盐含量低，硝酸盐含量高，适合于
双子叶植物特别是木本植物的生长； 5)KM-8P培养基 1974年,原生质体培养而设计的。 特点:有机成分复杂，包括所有单糖和维生
素，适合原生质融合的培养。
1、湿热灭菌
原理： 注意事项：完全排除锅内空气 常用方法是：关闭放气阀，通电后，待压力上升到
O．05MPa时，打开放气阀，放出空气，待压力 表指针归零后，再关闭放气阀。关阀再通电后，压 力表上升达到0．1MPa时压力0．1-0．15MPa， 20min。
步骤： ⑴ 放水至平把架； ⑵ 把包扎好的培养基装入高压锅； ⑶ 盖上内锅盖,上紧螺帽，关上气阀和安全阀； ⑷ 然后接通电源、设置温度和时间； ⑸ 排冷空气（自动）； ⑹ 记时（自动） ⑺ 到时，关电源，降压至0，打开放气阀； ⑻ 开盖拿培养基 注意：经过灭菌的营养培养基不宜放置太长，应尽早使
二、母液的配制与保存
1.母液的配制方法 单配法：用a:b表示 混配法：用amg/L表示
2.母液的配制过程（MS）
1）大量元素母液
母 化合物名称 培 养 基 扩大 称 取 量 母 液 1 L 培 养 基
液
用 量 倍数 (mg) 体 积 吸 取 母 液
(mg/L)
(mL) 量（mL）
大 KNO3
用，但为了在使用前能检查培养基有无微生物污染， 可将培养基置于25℃下保存4天，如果培养基需要贮 存较长时间，可在4℃低温下保存。
第三节 常用培养基的配方及特点
一、常用培养基的配方 二、常用培养基的种类及其特点
二、培养基的种类及其特点
1）MS 培养基 产生：1962年，Murashige和Skoog； 特点：无机盐的浓度高，是稳定的平衡溶液； 2）White培养基 产生：1943年，White，1963年改良； 特点：无机盐浓度较低，适于生根培养； 3）N6培养基 特点：KNO3和（NH4）2SO4含量高，不含钼，适于禾谷
外植体的选择与表面灭菌考核标准
5
4、倾净后立即倒入无菌水，轻轻摇动3min左右/次，一般无菌水冲洗3—10次
10
接种
左手拿培养基(灭过菌的)，打开瓶盖，将培养瓶几乎水平拿着，用右手拿镊子夹一块外植体（灭过菌的）送进入瓶内，轻轻插入培养基上，再轻轻盖瓶盖
20
2、刷洗材料上面的灰尘
3、按培养要求剪成大小合适的材料
4、置于流水下冲洗30min以上
20
灭菌前准备工作
将外植体材料、灭菌剂如70％酒精或0.1%升示、无菌水、培养基、接种工具、无菌杯等，置于超净工作台上
10
外植体的表面灭菌
1、沥干水转移到无菌瓶中
5
2、看好时间，倒入灭菌剂，轻轻摇动无菌瓶
5
3、在预定时间之内1—2min，把灭菌剂倒入废液缸中
外植体的选择与表面灭菌考核标准
项目
操作
赋分
空间灭菌
地面、墙壁和工作台的灭菌5来自无菌室和培养室的灭菌5
准备实验用具
70％酒精、0.1％升汞、无菌水．、接种工具、无菌杯、烧杯、外植体材料、剪刀、培养皿、培养基、无菌纱布、记号笔
5
选择外植佳
春夏季节，选择健壮、无病、大小合适的外植体。
10
预处理
1、去除外植体不用部位
4、倾净后立即倒入无菌水，轻轻摇动3min左右/次，一般无菌水冲洗3—10次
10
接种
左手拿培养基(灭过菌的)，打开瓶盖，将培养瓶几乎水平拿着，用右手拿镊子夹一块外植体（灭过菌的）送进入瓶内，轻轻插入培养基上，再轻轻盖瓶盖
20
2、刷洗材料上面的灰尘
3、按培养要求剪成大小合适的材料
4、置于流水下冲洗30min以上
20
灭菌前准备工作
将外植体材料、灭菌剂如70％酒精或0.1%升示、无菌水、培养基、接种工具、无菌杯等，置于超净工作台上
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外植体的表面灭菌
1、沥干水转移到无菌瓶中
5
2、看好时间，倒入灭菌剂，轻轻摇动无菌瓶
5
3、在预定时间之内1—2min，把灭菌剂倒入废液缸中
外植体的选择与表面灭菌考核标准
项目
操作
赋分
空间灭菌
地面、墙壁和工作台的灭菌5来自无菌室和培养室的灭菌5
准备实验用具
70％酒精、0.1％升汞、无菌水．、接种工具、无菌杯、烧杯、外植体材料、剪刀、培养皿、培养基、无菌纱布、记号笔
5
选择外植佳
春夏季节，选择健壮、无病、大小合适的外植体。
10
预处理
1、去除外植体不用部位
第三章 外植体的选择和灭菌
第三节 污染原因和预防措施
培养物污染的原因 污染的预防措施
一．培养物污染的原因
1.培养物污染的原因主要有：外植体带菌；培养 基及器皿灭菌不彻底；操作不规范等。在组织 培养实验中，污染的病原分为细菌及真菌两类。 2. 细菌污染的特点是菌斑呈粘液状物，且在接 种1-2天即可发现，除材料或培养基灭菌不彻 底外，工作人员的不慎也是造成细菌污染的原 因；真菌污染的部分长有不同颜色的霉菌，在 接种3-10天后才能发现，真菌污染的原因多为 周围环境的不清洁，超净台的过滤装置失效， 培养器皿的口径过大等。
四．外植体大小
目前许多植物的茎尖培养表明，外植体 （茎尖）越小成活率越低。因此除非用 去除病毒，否则不宜将外植体切的太小。 但不是说外植体越大越好，外植体过大， 不易彻底灭菌。
第二节 外植体的灭菌方法
常用灭菌药剂 外植体的灭菌方法
一．常用灭菌药剂及灭菌效果
消毒剂 次氯酸钠 次氯酸钙 漂白粉 升汞 酒精 过氧化氢 溴水 硝酸银 抗菌素 浓度/% 2 9-10 饱和溶液 0.1-1难易 易 易 易 较难 易 最易 易 较难 中 消毒分钟 5-30 5-30 5-30 2-10 0.2-2 5-15 2-10 5-30 30-60 灭菌效果 很好 很好 很好 最好 好 好 很好 好 较好
1．70%-75%酒精
70%-75%酒精---具有较强的穿透力和杀 菌力，通常外植体浸入15-30秒即可。常 作为表面灭菌的第一步，它具有浸润和 灭菌的双重作用，但不能达到彻底灭菌 的作用，必须结合其它药剂灭菌。有时 为了提高乙醇的杀菌效果，可在乙醇溶 液中加入0.1%的酸或碱，提高乙醇的杀 菌效果。
2．果实和种子的消毒
视果实和种子的清洁程度，先用自来水 冲洗10-20分钟，甚至更长时间。再用 70%酒精迅速漂洗一次。果实用2%次氯 酸钠溶液浸10分钟，后用无菌水冲洗2-3 次后，就可取出果实内的种子或组织进 行培养。种子则先用10%次氯酸钠溶液 浸泡20-30分钟，对难以消毒的还可用 0.1%升汞或1%-2%溴水消毒5分钟。
植物组织培养实务--外植体的选择与消毒
植物组织培养实务--外植体的选择与消毒1、外植体的选择外植体是指植物组织培养中的各种接种材料。
从理论上讲，植物细胞都具有全能性，能够再生新植株，任何器官、任何组织、单个细胞和原生质体都可以作为外植体。
但实际上，不同品种、不同器官之间的分化能力有巨大差异，培养的难易程度不同。
为保证植物组织培养获得成功，选择合适的外植体是非常重要的。
（1）选择优良的种质及母株无论是离体培养繁殖种苗，还是进行生物技术研究，培养材料的选择都要从主要的植物入手，选取性状优良的种质、特殊的基因型和生长健壮的无病虫害植株。
尤其是进行离体快繁，只有选取优良的种质和基因型，离体快繁出来的种苗才有意义，才能转化成商品；生长健壮无病虫害的植株及器官或组织代谢旺盛，再生能力强，培养后容易成功。
（2）选择适当的时期组织培养选择材料时，要注意植物的生长季节和生长发育阶段，对大多数植物而言，应在其开始生长或生长旺季采样，此时材料内源激素含量高，容易分化，不仅成活率高，而且生长速度快，增殖率高。
若在生长末期或已进入休眠期时采样，则外植体可能对诱导反应迟钝或无反应。
花药培养应在花粉发育到单核靠边期取材，这时比较容易形成愈伤组织。
百合在春夏季采集的鳞茎、片，在不加生长素的培养基中，可自由地生长、分化；而其他季节则不能。
叶子花的腋芽培养，如果在1月至翌年2月间采集，则腋芽萌发非常迟缓；而在3-8月间采集，萌发的数目多，萌发速度快。
（3）选取适宜的大小培养材料的大小根据植物种类、器官和目的来确定。
通常情况下，快速繁殖时叶片、花瓣等面积为5mm2，其他培养材料的大小为0.5~1.0cm。
如果是胚胎培养或脱毒培养的材料，则应更小。
材料太大，不易彻底消毒，污染率高；材料太小，多形成愈伤组织，甚至难以成活。
（4）外植体来源要丰富为了建立一个高效而稳定的植物组织离体培养体系，往往需要反复实验，并要求实验结果具有可重复性。
因此，就需要外植体材料丰富并容易获得。
（5）外植体要易于消毒在选择外植体时，应尽量选择带杂菌少的器官或组织，降低初代培养时的污染率。
外植体的选择与培养
6
(7)接种完毕后要清理干净并用70%酒精擦工作台。
b
第三节 外植体的选择与培养
（二） 外植体培养
外植体培养：指把培养材料放在培养室里，使之 生长，分裂和分化形成愈伤组织或进一步分化 成再生植株的过程。
7
b
第三节 外植体的选择与培养
培养的环境条件:
温度
8
光照
培养室 培养条件
氧气
湿度
b
第三节 外植体的选择与培养
(3)接种员先洗净双手，在缓冲间换好专用实验服，及拖 鞋等；
(4)上工作台后，用酒精棉球擦拭双手。然后70%酒精喷 雾降尘，并擦拭工作台面；
(5)先用酒精棉球擦拭接种工具，再将镊子和剪子蘸95% 酒精在酒精灯火焰上灼烧，放置冷却。
5
b
第三节 外植体的选择与培养
接种时的无菌操作技术：
(1)对接种材料进行消毒；
2、玻璃化现象产生的原因
细胞分裂素浓度较高时； 琼脂浓度低时； 温度低、光照时间长时； 气体交换不良时； 培养基中无机离子种类及比例不当时。
20
b
第三节 外植体的选择与培养
3、预防措施：
①适当控制培养基中无机营养成分； ②适当提高培养基中蔗糖和琼脂浓度； ③适当降低细胞分裂素和赤霉素浓度，增加生
长素量； ④增加自然光照，控制光照时间； ⑤降低培养温度，进行变温培养； ⑥增加容器通风，最好进行CO2施肥。
第1章 植物组织培养实验室 构建及操作技术
第三节 外植体的选择与培养
一、外植体的选择： 种质优良
选材
取材的最适时期
1
植株健壮
适宜的大小
b
第三节 外植体的选择与培养
二、外植体灭菌
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湿热灭菌:高压灭菌锅，压力达0.5kg/cm2时放气， 压力达1.1 kg /cm2,121度,16-30’
射线灭菌:紫外灯 过滤灭菌:细菌过滤器（孔径0.45um ） 熏蒸灭菌:每立方米体积2-8mL甲醛 ＋甲醛一半量的高锰酸钾 火烧灭菌：酒精灯 药剂灭菌：外植体
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(一 )外植体的灭菌 原则：杀菌又不伤害活细胞。（选择消毒剂，浓度、时间） 药剂：能自动分解成低毒性或容易除去的药剂，如次氯酸 钠能分解成杀菌的氯气，并易散失，是常用的，低浓度氯化 汞效果好但难除；多次无菌水冲洗，用镊子翻动使药液均匀。
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1、预处理 先对植物材料进行修剪整理，去掉不需要 部分，将准备使用的植物材料（外植体）在 流水中冲洗20-60分钟，备用。如特别不洁 的外植体，可先用加有洗涤剂的水清洗1015分钟，再用流水冲洗干净。
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a. 单子叶植物不易诱导器官发生。 b. b. 木本植物较难诱导。 c. c. 存在基因型差异（如番茄29%~63%） d. d. 开始生长季节取材容易诱导。
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外植体种类及基因型
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(二)外植体的部位
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对于大多数植物来讲，茎尖是最好的部位，由于其形态已 基本建成，生长速度快，遗传性稳定，也是获得无病毒苗 的重要途径，但茎尖往往受到材料来源的限制，而采用茎 段可解决培养材料不足的困难。
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选取适宜的外植体；常用外植体有茎尖、茎 段、节间、叶片、叶柄等。
C、流水冲洗外植体； D、外植体切割、分离及灭菌处理； E、外植体接种于诱导培养基。 F、环境条件控制促进外植体的生长。
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(三)取材季节
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取材的季节以早春为好
• 不同植物的取材季节要求各有不同。对大多数 植物而言，应在其生长开始的季节采样Hale Waihona Puke 。实用文档3、材料取材
⑴材料选择
培养材料应选择有代表性的主要植 物、选择性状优良的种质或特殊的基因 型。
快速繁殖时应在植株生长的最适时 期取材，花药培养应在花粉发育到单核 期取材。
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(五)外植体大小
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外植体大小： 外植体越小成苗能力越弱，较大的外植
体增殖较快。
外植体极性： 当外植体以形态学的基部接种于培养基上
实用文档
某些多年生植物或特殊材料，必须取自 自然生长的植物，就需要尽可能避免使用那 些生长过于潮湿和不洁净环境中的植物。对 于培养过程中可能出现内生菌污染的材料， 应尽量取生长旺盛期的生长点部位作为起始 培养的材料。
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3、供体植株的管理 取自室外的外植体材料，供体植株的管
理十分重要，这与外植体培养时的污染率密 切相关。植株管理中应注意：
时，从远离基部的表面诱导出芽、苗数目较 多。
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选 取 材 料 的 大 小 一 般 在 0.5-1.0cm 之 间 。 胚胎培养或脱毒在0.5cm以下。材料太大易 污染，材料太小难于成活。
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外植体取材方法--确定大小
取大小适中的茎段、芽体进行清洗实、用灭文菌档 ，大了容易污染，小了不易成活。
• 在生长末期或已进入休眠期时取样，则外植体 可能对诱导反应迟钝或无反应，较难成活。
• 在母株生长旺盛的季节取材，不仅成活率高， 而且增殖率也大。
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(四)器官的生理状态和发育年龄
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1幼年组织具有较高的形态发生能力
作为外植体的器官，其生理状态和发育年龄直接影响 形态发生。一般情况下，幼年组织比老年组织具有较 高的形态发生能力，生理年龄越老的组织或器官，越 接近发育上的成熟，其再生能力逐渐减弱甚至完全失 去再生能力。
外植体的大小 0.5-1cm， 过大的外植体容易污染， 过小存活率很低。
实用文档
实用文档
外植体的选择有什么要求?
外植体的大小
选材
生理学上的年龄
外植体的来源 取材的季节
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二、外植体的灭菌
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灭菌：是指用物理或化学方法将所有致病和非致病的微生物全部杀灭。 • 常用灭菌方法:
干热灭菌: 150度，40’ 1２0度， 120 ’
常用的外植体种类： ①茎尖（园艺植物组织培养中应用最多，繁殖率高，不易发
生遗传变异，但取材有限） ②茎段（采用嫩茎的切段促进腋芽萌发，取材容易） ③叶（幼嫩叶片组织通过愈伤组织或不定芽分化产生植株，
取材容易，操作方便，但易发生变异）； ④花球和花蕾 ⑤种子、根、块根、块茎、花瓣、胚等。
实用文档
• 在选择植物外植体进行组织培养时，还要 求考虑待培养材料的来源是否有保证，是 否容易成苗；同时要考虑到该外植体，特 别是经过脱分化产生的愈伤组织，是否会 引起不良变异，丧失原品种的优良性状。
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外植体状态：
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2 外植体的来源 -生长在自然环境下的植物 -有目的地培育在温室控制条件下生长的植
物 -无菌环境下已经过离体培养的植物 自然环境中生长的植株，一般带有微生物，
甚至与某些微生物具有寄生关系，使植株具有内生 菌。取自这些植物的外植体，在培养过程中会有微 生物滋生，从而影响培养效果。
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自 然 环 境 生 长 植 株
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温室控制条件下生长植株
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已离体培养植株
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多数情况下，应尽量使用温室或人工气候 室控制培养的植物材料作为外植体来源， 减少培养过程中的微生物感染概率。同时， 生长在控制条件下的植物可以保持培养料 间的一致性，提高实验的可重复性，也便 于培养技术的规范。
第三章 外植体选择和灭菌
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一般来说，无论何种类型的细胞工程技术， 起始阶段均涉及外植体取材、灭菌、接种 与培养等基本过程。
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§1、外植体的选择和灭菌
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一 外植体的选择 (一) 外植体的基因型 • 不同种类的植物 • 同一植物的不同器官
对诱导条件反应是不一致的，有的部位诱导分化的成功 率高，有的部位却很难脱分化，或者再分化频率很低
⑴避免昆虫危害 许多昆虫如蚜虫、螨类 和飞虱是许多植物病虫害的传播媒介，会引 起植物组织的潜在感染。
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⑵注意防病 尤其是真菌和细菌病害的侵 染，取自感病植株的外植体，在培养中的 污染率远远高于来自健康植株的外植体， 必要时需使用化学药剂防治病害。 ⑶控制湿度 给供体植株浇水时应从根部 给水，避免从上部浇水，以免上部形成易 于病原侵染的湿度环境；尽可能降低温室 湿度；取材前尽可能保持植株干爽。
射线灭菌:紫外灯 过滤灭菌:细菌过滤器（孔径0.45um ） 熏蒸灭菌:每立方米体积2-8mL甲醛 ＋甲醛一半量的高锰酸钾 火烧灭菌：酒精灯 药剂灭菌：外植体
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(一 )外植体的灭菌 原则：杀菌又不伤害活细胞。（选择消毒剂，浓度、时间） 药剂：能自动分解成低毒性或容易除去的药剂，如次氯酸 钠能分解成杀菌的氯气，并易散失，是常用的，低浓度氯化 汞效果好但难除；多次无菌水冲洗，用镊子翻动使药液均匀。
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1、预处理 先对植物材料进行修剪整理，去掉不需要 部分，将准备使用的植物材料（外植体）在 流水中冲洗20-60分钟，备用。如特别不洁 的外植体，可先用加有洗涤剂的水清洗1015分钟，再用流水冲洗干净。
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a. 单子叶植物不易诱导器官发生。 b. b. 木本植物较难诱导。 c. c. 存在基因型差异（如番茄29%~63%） d. d. 开始生长季节取材容易诱导。
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外植体种类及基因型
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(二)外植体的部位
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对于大多数植物来讲，茎尖是最好的部位，由于其形态已 基本建成，生长速度快，遗传性稳定，也是获得无病毒苗 的重要途径，但茎尖往往受到材料来源的限制，而采用茎 段可解决培养材料不足的困难。
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选取适宜的外植体；常用外植体有茎尖、茎 段、节间、叶片、叶柄等。
C、流水冲洗外植体； D、外植体切割、分离及灭菌处理； E、外植体接种于诱导培养基。 F、环境条件控制促进外植体的生长。
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(三)取材季节
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取材的季节以早春为好
• 不同植物的取材季节要求各有不同。对大多数 植物而言，应在其生长开始的季节采样Hale Waihona Puke 。实用文档3、材料取材
⑴材料选择
培养材料应选择有代表性的主要植 物、选择性状优良的种质或特殊的基因 型。
快速繁殖时应在植株生长的最适时 期取材，花药培养应在花粉发育到单核 期取材。
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(五)外植体大小
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外植体大小： 外植体越小成苗能力越弱，较大的外植
体增殖较快。
外植体极性： 当外植体以形态学的基部接种于培养基上
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某些多年生植物或特殊材料，必须取自 自然生长的植物，就需要尽可能避免使用那 些生长过于潮湿和不洁净环境中的植物。对 于培养过程中可能出现内生菌污染的材料， 应尽量取生长旺盛期的生长点部位作为起始 培养的材料。
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3、供体植株的管理 取自室外的外植体材料，供体植株的管
理十分重要，这与外植体培养时的污染率密 切相关。植株管理中应注意：
时，从远离基部的表面诱导出芽、苗数目较 多。
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选 取 材 料 的 大 小 一 般 在 0.5-1.0cm 之 间 。 胚胎培养或脱毒在0.5cm以下。材料太大易 污染，材料太小难于成活。
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外植体取材方法--确定大小
取大小适中的茎段、芽体进行清洗实、用灭文菌档 ，大了容易污染，小了不易成活。
• 在生长末期或已进入休眠期时取样，则外植体 可能对诱导反应迟钝或无反应，较难成活。
• 在母株生长旺盛的季节取材，不仅成活率高， 而且增殖率也大。
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(四)器官的生理状态和发育年龄
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1幼年组织具有较高的形态发生能力
作为外植体的器官，其生理状态和发育年龄直接影响 形态发生。一般情况下，幼年组织比老年组织具有较 高的形态发生能力，生理年龄越老的组织或器官，越 接近发育上的成熟，其再生能力逐渐减弱甚至完全失 去再生能力。
外植体的大小 0.5-1cm， 过大的外植体容易污染， 过小存活率很低。
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外植体的选择有什么要求?
外植体的大小
选材
生理学上的年龄
外植体的来源 取材的季节
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二、外植体的灭菌
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灭菌：是指用物理或化学方法将所有致病和非致病的微生物全部杀灭。 • 常用灭菌方法:
干热灭菌: 150度，40’ 1２0度， 120 ’
常用的外植体种类： ①茎尖（园艺植物组织培养中应用最多，繁殖率高，不易发
生遗传变异，但取材有限） ②茎段（采用嫩茎的切段促进腋芽萌发，取材容易） ③叶（幼嫩叶片组织通过愈伤组织或不定芽分化产生植株，
取材容易，操作方便，但易发生变异）； ④花球和花蕾 ⑤种子、根、块根、块茎、花瓣、胚等。
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• 在选择植物外植体进行组织培养时，还要 求考虑待培养材料的来源是否有保证，是 否容易成苗；同时要考虑到该外植体，特 别是经过脱分化产生的愈伤组织，是否会 引起不良变异，丧失原品种的优良性状。
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外植体状态：
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2 外植体的来源 -生长在自然环境下的植物 -有目的地培育在温室控制条件下生长的植
物 -无菌环境下已经过离体培养的植物 自然环境中生长的植株，一般带有微生物，
甚至与某些微生物具有寄生关系，使植株具有内生 菌。取自这些植物的外植体，在培养过程中会有微 生物滋生，从而影响培养效果。
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自 然 环 境 生 长 植 株
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温室控制条件下生长植株
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已离体培养植株
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多数情况下，应尽量使用温室或人工气候 室控制培养的植物材料作为外植体来源， 减少培养过程中的微生物感染概率。同时， 生长在控制条件下的植物可以保持培养料 间的一致性，提高实验的可重复性，也便 于培养技术的规范。
第三章 外植体选择和灭菌
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一般来说，无论何种类型的细胞工程技术， 起始阶段均涉及外植体取材、灭菌、接种 与培养等基本过程。
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§1、外植体的选择和灭菌
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一 外植体的选择 (一) 外植体的基因型 • 不同种类的植物 • 同一植物的不同器官
对诱导条件反应是不一致的，有的部位诱导分化的成功 率高，有的部位却很难脱分化，或者再分化频率很低
⑴避免昆虫危害 许多昆虫如蚜虫、螨类 和飞虱是许多植物病虫害的传播媒介，会引 起植物组织的潜在感染。
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⑵注意防病 尤其是真菌和细菌病害的侵 染，取自感病植株的外植体，在培养中的 污染率远远高于来自健康植株的外植体， 必要时需使用化学药剂防治病害。 ⑶控制湿度 给供体植株浇水时应从根部 给水，避免从上部浇水，以免上部形成易 于病原侵染的湿度环境；尽可能降低温室 湿度；取材前尽可能保持植株干爽。