第四章 外植体的选择和灭菌
2-2外植体
衰败型
NH4＋ 生长素
保守分裂型
NH4＋ 生长素
细胞分裂素 NO3-
亢进分裂型
成功案例：王海波（1989）通过调整培养基中 2，4-D的水平建立了小麦胚性愈伤组织无性系， 诱导了松脆愈伤组织，建立了悬浮系，游离原 生质体
六、愈伤组织的细胞分化
维管组织是最先分化的组织。
1 影响维管组织分化的因子 （1）生长素 （2）蔗糖（麦芽糖、海藻糖） （3）细胞分裂素 （4）温度、光照
栽培胡萝卜： 培养基中不含还原氮，只要氧化氮浓度相 当高，也能形成体细胞胚，但发生率低。 还原氮和氧化氮的最适合比是 10mmol/L : 40mmol/L
只以还原氮为氮源时，经常调节培养基的 PH值使其保持在5.4，胚胎发生率可与两种 氮比例适宜时相当。但当PH在4天内降到 4-3.5，对胚胎发生有抑制。 最低数量的内源还原氮量：5mmol/kg鲜组 织。
1%
2% 2.5－3.5% 4%
很少形成
形成 形成 很少或不形成
不形成
很少或不形成 形成 形成
但葡萄糖、果糖、其它单糖无作用。生长 素对维管组织分化所起的作用在很大程度 上取决于糖的存在。
第六节
愈伤组织中的形态发生
一、器官发生（organogenesis)（茎芽分化） 二、体细胞胚发生(somatic embryogenesis) 三 人工种子
禾谷类植物
外植体 诱导培养基（2，4-D） 愈伤组织
再生培养基（分化培养基）
（不含2,4-D或含IAA或NAA） 茎芽分化
苜蓿
外植体 诱导培养基（2，4-D，激动素） 愈伤组织
再生培养基（分化培养基）
外植体
2．外植体的灭菌
第三：在无菌蒸馏水中冲洗3次； 第四：将材料封闭在无菌的培养皿中过夜，保 持一定温度； 第五：次日将叶片用2.6%次氯酸钠灭菌30min ，然后，用蒸馏水洗3次。 对层积过的种子也可用多次灭菌法，在种 子吸胀前后都要灭菌，在层积贮藏的第一周还 应增加1次灭菌处理。
（2）多种药液交替浸泡法
常规的表面灭菌处理方法
①把材料放进70%的酒精中约30s。 ②用0.1%的升汞（HgCl2）中浸泡10min。 或用10%的漂白粉上清液中浸10min～ 15min。 ③无菌蒸馏水冲洗3～5次。 ④灭菌时进行搅动，使植物材料与灭菌剂有良好 的接触。 ⑤在灭菌剂里滴入数滴0.1%的Tween20（吐温） 或Tween80湿润剂，则灭菌效果更好。
第四章 外植体
第一节 外植体的选择 第二节 外植体的消毒 第三节 污染原因和预防措施
第四节 外植体的接种
第五节 外植体的褐变及其预防措施
第一节 外植体的选择
一、外植体的种类 二、外植体的来源 三、取材季节 四、外植体的的大小 五、外植体的生理状态和发育年龄
一、外植体的种类
无论是离体培养繁殖种苗，或者是进行 生物技术研究，培养材料的选择都要从主 要的植物入手，选取性状优良的种质，或 特殊的基因型。对材料的选择要有明确的 目的，具有一定的代表性，提高成功机率， 增加其实用价值。
严格的灭菌，然后接入新鲜的培养基中重新培养。 要处理的污染培养瓶最好在打开瓶盖前，先集中 进行高压灭菌，再清除污染物，然后洗净备用。 现就根据污染途径，阐述污染的几个预防措施。
1．防止材料带菌的措施
（1）用茎尖作外植体时，可在室内或无菌条件下对
枝条先进行预培养。
植物组织培养基本技术
—
Fe SO4 ·7 H 2 O N a - Fe - E D T A FeCl3 · 6 H 2 O Fe2 ( SO 4 ) 3 N a2 - ED T A
K2 H P O4
M nSO 4 · 4 H 2 O ZnSO 4 · 7 H2 O NiCl2 · 6 H 2 O Zn ( 螯合体 )
MS
选择合适的培养基是植物组织培养成功的基础 。 根据营养水平不同 , 培养基分为基本培养
组织 培 养 中 常 用 的 培 养 基 主 要 有 M S 、 W hite、 N6 、 B5 、 Heller 、 N it sch 、 M iller 和 SH
表3-1 几种常用培养基的配方 ( 1974 ) 2 830 463 — — — N6 ( 1968 ) 2 527 5 134 — — — B5 ( 1953) — — Heller ( 1972) 720 — 950 — Nitsc h 单位 : mg / L
中常用的氨基酸有丙氨酸 、 甘氨酸 、 谷氨酰胺 、 丝氨酸 、 酪氨酸 、 天冬酰胺 , 以及多种氨基酸
有机氮源 , 对植物外植体的芽 、 根 、 胚状体的生长 、 分化均有良好的促进作用 。 植物组织培养
3 1
培养基及其配制
29
丝氨酸和谷氨酰胺有利于花药胚状体或不定芽的分化 ; 半胱氨酸可作为抗氧化剂 , 防止培养材 料褐化 , 延缓酚氧化 。 另外 , 植物组织培养中还加入一些天然的 有机物 , 如椰 子乳 ( CM ) 、 酵母 提取液 ( YE ) 、
( 7) 铁
( 6) 硫
官发育和提高抗逆性 。 缺锌时 , 叶子变黄 , 或出现白斑 , 叶子小 。 ( 10) 铜 叶缘向上卷曲黄化 , 变厚变脆 ; 顶芽死亡 。 ( 12) 钼 ( 13) 钴 ( 二) 有机养分 ( 11) 硼
外植体及消毒
灭菌(STERILIZATION)
6、培养室灭菌
熏蒸灭菌： 2ml/m3甲醛 + 0.2g/m3 高锰酸钾
新建培养室用前一定要彻底熏蒸1次； 隔2-5天用洗衣粉水或来苏水拖地1次，用高锰
酸钾擦架1次； 喷洒75%酒精灭菌降尘。
消毒(SANITIZATION)
消毒(Sanitization)：杀死、消除或抑制部分微生 物，使之不发生作用。
因此，外植体选择需要具有明确的目的，选择具有一 定代表性的基因型，以提高成功率及实用性。
外植体取材部位
不同种类的植物以及同一植物的不同器官对诱导 条件反应是不一致的，有的部位诱导分化率高，有 的部位很难脱分化，或者再分化频率很低，甚至只 分化出芽不长根或只分化出根而不长芽。 如百合科不同属的植物:风信子、虎眼万年青易于 再生形成小植株、而郁金香较难；同种百合鳞茎的 鳞片外层比内层再生能力强，下段比中上段再生能 力强。 对大多数植物来讲，茎尖是较好的部位，其形态 已基本建成，生长速度快，遗传性稳定，但易受材 料来源的限制。因此，茎段、叶片、花粉、胚珠等 材料也是常用的取材部位。
抗生素（ANTIBIOTIC）
烟草、西番莲的组培中发现，植株下部组织产生营养 芽的比例高，而上部组织产生花器官的比例高；木本 植物幼龄树的春梢嫩枝段或基部的萌条做外植体效果 较好。
外植体大小
外植体的大小，应根据培养目的而定。
如果是胚胎培养或脱毒，则外植体宜小；如果是进行 快速繁殖，外植体宜大。
但外植体过大，杀菌不彻底，易于污染；过小 离体培养难于操作、成活。
一般外植体大小在0.5—1.0cm为宜。具体说叶片、花 瓣等约为5mm2，茎段则长约0.5mm，茎尖分生组织带 一两个叶原基0.2—0.3mm大小等。
植物细胞工程技术原理
▪ 太大，培养基过硬；太小，培养基不易凝固。
▪ 吸附剂：活性碳，适用于培养中容易形成不利于
生长的分泌物的培养物。
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pH 变动
▪ 高中化学：无机盐溶液酸碱性的判断依据是，该盐是否发生水 解。强酸强碱盐如NaCl中性；强酸弱碱盐如NH4Cl酸性；强 碱弱酸盐如Na2CO3碱性。
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4、培养
▪ 温度：24℃左右 一般材料20~30℃
▪ 光照：初期弱光，后期强光；光周期一般 12~16小时
▪ 气体调节（O2）：
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二、外植体的选取及接种培养
▪ 1、外植体（explant）的选取
▪ 外植体：是指用于离体培养的活的植物组织、器官等材 料。
▪ 用于外植体分离的母体植物材料一般有三种来源：
一是生长在自然环境下的植物；
二是有目的地培育在温室控制环境条件下生长的植物；
三是无菌环境下已经过离体培养的植物。
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2、培养基的分类
▪ 按性质分：
基本培养基 完全培养基：基本培养基加激素
▪ 按状态分
固体培养基
液体培养基
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2、培养基的分类
▪ 基本培养基按照组成成分又可分为很多种，常见的 如MS、Miller、B5、N6、T、LS、H、KM8P等。 根据其盐浓度大致可分为四类：
▪ 富盐平衡培养基： MS
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2、外 植 体 灭 菌
▪ 灭菌程序及筛选
外植体
清洗整理 准备室
杀菌剂灭菌 超净台上
第四章 外植体的选择、消毒和接种
接种材料预处理:
(1)接种材料预培养 (2)就地套袋 (3)接种材料修整 (4)冲洗
接种前准备:
1
2
3
456外植体 Nhomakorabea毒:外植体剪切:
1.叶片0.5cm×0.5cm 2.微茎尖0.2-0.5mm 3.带节茎段0.5-1.0cm 4.芽丛分离
六、外植体的褐变及其防止措施
褐变
• 褐变是指外植体在培养过程中体内的多 酚氧化酶被激后活，使细胞内的酚类物质 氧化成棕褐色醌类物质，这种致死性的褐 化物不但向外扩散致使培养基逐渐变成褐 色，而且还会抑制其他酶的活性，严重影 响外植体的脱分化和器官分化，最后变褐 而死亡的现象
影响褐变的因素
• 植物种类：一般木本植物，单宁、色素含量 高的植物易发生褐变 。
(6)接种时，接种员双手不能离开工作台，不能说话、走动和 咳嗽等；
(7)接种完毕后要清理干净工作台，可用紫外灯灭菌30min。 若连续接种，每5天要大强度灭菌一次。
接种前外植体消毒顺序:
第三节 培养条件
在植物组织培养中温度、光照、湿度等各种环境条 件，培养基组成、ＰＨ值、渗透压等各种化学环境条件 都会影响组培苗的生长和发育。
污染的原因及其预防措施
1、污染：植物组织培养 过程中培养基和培养材 料滋生杂菌，导致培养 失败的现象
2、污染的原因 • 一是病原菌污染（细菌、
真菌） • 二是外植体、培养基、
培养器皿带菌 • 三是操作人员未遵守操
作规程。
真菌污染
污染的预防措施
组织培养中降低污染率是工厂化生产中不可忽 视的技术环节。预防措施有： • 防止材料带菌------选择取材时间、材料与培养、 外植体灭菌等措施； • 防止用具带菌------器皿与金属器械灭菌； • 操作室要处于无菌状态------工作室、培养室灭菌 等； • 操作人员要按照操作程序进行。 • 在培养基中加入抗菌素 • 分散接种
羌活外植体的选择和消毒处理
⑴外植体的选择和消毒处理：以羌活的幼叶为外植体，经流水冲洗10~20 分钟，再用体积浓度为75% 的酒精浸泡灭菌15~30 秒，然后以无菌去离子水冲洗2~3 次，再将冲洗后的外植体置于质量浓度为0.1%~0.2% 的升汞中，浸泡灭菌5~8 分钟，并用无菌去离子水冲洗3~6次，即得消毒后的外植体；⑵外植体接种：将所述消毒后的外植体切成0.1~0.5cm2 的小块，接种在愈伤组织诱导培养基上，其中每25ml 所述愈伤组织诱导培养基中接种3 小块所述消毒后的外植体；在温度为20℃±2℃、光源为日光灯、光强为30~60 umol . m-2. s-1、光照时间为12 h .d-1 的条件下培养10~25 天，在幼叶切口处膨大形成愈伤组织；⑶愈伤组织增殖：将所述愈伤组织接种到愈伤组织增殖培养基上，其中每25ml 所述愈伤组织增殖培养基中接种2 块所述愈伤组织；在温度为20℃±2℃、光源为日光灯、光强为30~60 umol . m-2. s-1、光照时间为12 h .d-1 的条件下愈伤组织增殖20~35 天，长出乳白色、颗粒状致密性的愈伤组织；⑷愈伤组织的芽诱导：将所述步骤⑶所得到的愈伤组织接种到诱芽培养基上，其中每25ml 所述诱芽培养基中接种2 块所述愈伤组织；在温度为20℃±2℃、光源为日光灯、光强为30~60 umol . m-2. s-1、光照时间为12 h .d-1 的条件下培养30~35 天，形成丛生羌活苗；⑸生根诱导：将所述丛生羌活苗分株后转入生根培养基中，其中每25ml 所述生根培养基中接种1 棵所述丛生羌活苗；在温度为20℃±2℃、光源为日光灯、光强为30~60 umol .m-2. s-1、光照时间为12 h .d-1 的条件下培养20~30 天后，小苗基部出现白色、粗壮短根，并长出完整根系，即得完整再生小苗；⑹育苗基质消毒：将育苗基质在115~121℃温度下进行高温消毒，15~20min 后即得消毒后的育苗基质；所述育苗基质是指腐殖质与珍珠岩按2 ：1 重量比混合而成的混合基质；⑺植株移栽：将所述完整再生小苗直接移栽到所述消毒后的育苗基质中，炼苗后即长成正常羌活植株；所述一棵完整再生小苗种植在所述消毒后的育苗基质10cm2 的范围内。
组培苗生产技术—外植体的选择、处理与接种(植物组织培养课件)
3、蔬菜（龙牙百合） 龙牙百合特征:鳞茎，无皮，广卵形，外部鳞片长,将整个鳞茎 包裹，直径5~15厘米，白色，茎高90厘米左右，直立茎上叶 多而散生，披针形，叶色从浓绿，光滑。花单生茎顶。花朵 呈喇叭状长筒形，白色，有清香。
不能损伤组织材料，保持外植体的生活力，使外 植体在良好的培养条件下很快恢复生机，正常 生长和繁殖.
• 消毒剂的要求 • 要求：具有良好的消毒作用，既不会杀死植物的
组织细胞，又易被无菌水冲洗掉，不影响消毒后 外植体的生长和分化.
常用灭菌药剂的使用和效果
灭菌剂 使用浓度（%） 清除的难易 消毒时间 效 果
2、茎段（采用嫩茎的切段促进腋芽萌发，取材容易） 3、叶（幼嫩叶片组织通过愈伤组织或不定芽分化产生植株，
取材容易，操作方便，但易发生变异）； 4、花球和花蕾 5、种子、根、块根、块茎、花瓣等。
（二）实例分析 1、花卉（非洲菊） • 常用茎尖、嫩叶、花托进行非洲菊的组织培养，也有利用
种子进行组织培养的。 • 茎尖培养操作麻烦，但对于脱毒苗的生产是最有效的。 • 花托培养可直接成苗， 既可保持种性，又易行、 耗时短，是首选的外植体。
• 首先要选择花大、花色艳丽、市场流行的品种，然后再选 择无病虫害、植株生长健壮、花色纯正的优良品种单株进 行取材。
• 一旦选出优株后，应进行挂牌标记，并一直在其上采取花 蕾。作为外植体的花蕾要选取直径在1㎝左右，而且未露 心的小花蕾，太大或是太小的花蕾均不能获得满意的效果 。
2、水果（草莓）
（1）选择结果性优良的草莓母株上新抽出的匍匐茎作外植体，以每年6～7 月份最为适宜。
龙牙百合的许多器官、组织都可作为外植体， 如鳞片、花梗、叶片、茎尖、腋芽、花瓣、花托 、花丝、花药、胚、子房、根尖等，其中采用鳞 片作外植体的较多。
外植体采集,处理和灭菌的操作流程
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外植体的选择和灭菌ppt课件
资金是运动的价值，资金的价值是随 时间变 化而变 化的， 是时间 的函数 ，随时 间的推 移而增 值，其 增值的 这部分 资金就 是原有 资金的 时间价 值
吐温的使用：0.1%，表面活性剂，浸润作用 无菌水:在用灭菌剂之前和之后均需用无菌水冲 洗数遍.
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资金是运动的价值，资金的价值是随 时间变 化而变 化的， 是时间 的函数 ，随时 间的推 移而增 值，其 增值的 这部分 资金就 是原有 资金的 时间价 值
资金是运动的价值，资金的价值是随 时间变 化而变 化的， 是时间 的函数 ，随时 间的推 移而增 值，其 增值的 这部分 资金就 是原有 资金的 时间价 值
第一部分
组织培养技术
第四章 外植体的选择和灭菌
外植体（explant）：从植物体上分离的用于离体培养的植 物体部分。
第一节 外植体的选择
一、外植体的部位：根、茎、叶、花、果等 二、其它：如季节、生理状态和发育年龄等 三、外植体的大小
三、培养条件
温度：25±2℃； 光照：包括光照、光质和光周期； 培养基的pH:5.6-6.0;但若培养基中含有铁 离子， pH应在5.2以下. 湿度:培养容器的湿度常保持在100%; 培养 室的湿度70-80%. 气体:氧;二氧化碳;乙烯等.
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取材季节
一般取母株生长旺盛的季节的材料
外植体的大小
植物组织培养 组培苗生产技术外植体的选择处理与接种护理课件
ห้องสมุดไป่ตู้湿度
保持培养环境湿度适宜， 以防止培养基干燥和外植 体失水。
培养过程中的观察与记录
定期观察外植体的生长状 况，包括颜色、质地、生 长速度等，并记录观察结 果。
观察外植体是否有异常表 现，如病变、死亡或生长 异常等，及时采取相应措 施。
记录外植体的生长曲线， 以便了解其生长动态和规 律。
培养过程中的问题处理
污染问题
如发现外植体受到微生物污染， 应及时采取措施，如更换培养基、
增加消毒频率等。
褐化问题
外植体褐化是常见的现象，可以通 过添加抗氧化剂、调整培养基成分 等方法减轻褐化程度。
玻璃化现象
玻璃化是指培养中的植物组织出现 半透明状的现象，可以通过降低激 素浓度、增加培养基湿度等方法进 行改善。
外植体的繁殖与移栽
生根过程
无根苗在生根培养基上生长，经过细胞分裂和分 化形成根原基，进而发育成完整的根系。
移栽前的准备
在生根培养过程中，需要对外植体进行适当的炼 苗处理，以适应外界环境，提高移栽成活率。
移栽与驯化
移栽是将培养好的组培苗从培养 容器中取出，移植到自然环境中 的过程。
移栽后的管理：保持适宜的光照、 温度、湿度和水分条件，及时除 草、防治病虫害，促进组培苗健 康生长。
外植体的接种
无菌操作技 术
操作前准备
在操作前，需要对外植体进行彻底清洗，去除表面的污垢 和微生物。同时，操作人员需要对手部进行消毒，确保无 菌操作。
灭菌处理 外植体需要进行严格的灭菌处理，以消除附着在表面上的 微生物。常用的灭菌方法包括使用酒精、次氯酸钠或氯化 汞等消毒剂。
接种环境
接种环境需要保持无菌状态，通常在超净工作台或无菌室 内进行。同时，接种工具也需要进行消毒处理，避免交叉 污染。
第四章 无性系的快速繁殖
第四章无性系的快速繁殖许多栽培植物都是靠无性系来繁殖的，例如果树（柑橘、苹果）花卉等。
这些植物的基因是高度杂合的，为了在栽培过程中保持住品种的原有品质，只有通过无性繁殖才能达到目的。
其次，有些栽培植物在长期进化和人工选择的过程也形成了无性繁殖的能力，但无性繁殖的倍数较低，为了满足生产需要，我们要大量地繁殖优良种苗。
有些优良新品种为了在生产中迅速推广，也需要尽快扩大群体，所以，就有了以组织培养为手段的植物无性系的快速繁殖技术。
快速繁殖的高速度是由以下3种因素构成的：1较高的繁殖倍数，2较短的繁殖周期，3周年生产。
4-6周一个继代周期，3-4倍的增殖倍数，由一个个体可以繁殖出6000-6000万个个体，生产潜力巨大。
第一节无菌培养的建立一、外植体的选择根据培养目的和所涉及的植物种类进行选择，一般确定原则为：1、较大的草本或木本植物：茎段。
2、较小的或丛生的草本植物：叶片、花梗、花瓣等。
二、外植体的采样和灭菌采样即从原始植株上采取相应的器官作为接种的外植体。
采样的部位、地点和采样时的气候对外植体的灭菌都会产生影响；外植体本身的发育状况也会对灭菌产生影响。
三、首次接种污染率的估算和对策为了保持外植体的生命力，外植体的灭菌时间是有限制的，这就不可避免地带来首次接种的污染问题，有时污染率还会很高，限制无菌系的建立。
灭菌效果为50%时，若每瓶接种3个外植体，则无污染的概率为0.53=0.125,有污染的概率为0.875。
最有效最经济的办法就是采用小容器单瓶单个接种，这可以最大限度地获得无菌系。
第二节诱导外植体生长和分化再生力强的材料，获得了无菌材料就等于建立了无菌培养系，而对于再生能力差的材料来说，获得了无菌材料还不等于建立起了无菌培养系，必须诱导外植体生长和分化。
一、顶芽和腋芽的发育（茎尖培养）植物再生的第一种方式（一）、小茎尖的培养外植体为茎顶0.2-0.3mm的区域，包含茎尖生长点和1~2对叶原基，外植体需要在解剖镜下切割。
第四章灭菌接种与培养
第二步是对材料的表面浸润灭菌。要在超净台或接种箱 内完成，准备好消毒的烧杯、玻璃棒、70%酒精、消毒液、 无菌水、手表等。用70%酒精浸10-30s。处理完的材料在无 菌条件下，待酒精蒸发后再剥除外层，取用内部材料。
第三步是用灭菌剂处理。表面灭菌剂的种类较多，可根
❖ 化学消毒剂能使微生物的蛋白质变性，或竞争其酶系统， 或降低其表面张力，增加菌体细胞浆膜的通透性，使细 胞破裂或溶解。
❖ 一般说来，温度越高，作用时间越长，杀菌效果越 好。消毒剂的浓度一般是浓度越大，杀菌能力越强， 但石炭酸和酒精例外。
❖ 常用熏蒸剂是甲醛。熏蒸时，房间关闭紧密，按 6～8ml/m3用量，将甲醛置于广口容器中，加５g高 锰酸钾促进挥发。冰醋酸也可进行加热熏蒸，但效 果不如甲醛。
(3) 体细胞胚状体的发生与发育：体细胞胚状体类似于合 子胚但又有所不同，它也通过球形，心形，鱼雷形和子 叶形的胚胎发育时期，最终发育成小苗。但它是由体细 胞发生的。胚状体可以从愈伤组织表面发生，也可从外 植体表面已分化的细胞产生，或从悬浮培养的细胞产生。
初代培养外植体的褐变：
❖ 外植体褐变是指在接种后，其表面开始变褐，有时甚 至会使整个培养基变褐的现象。
4、接种完毕后将培养瓶封口，贴上标签，注明姓名，接种时 间和材料名称。整理好超净工作台台面，搞好清洁卫生。
【实验结果与分析】 （50分）
❖ 接种后7天观察污染情况 ❖ 污染率(％)=(污染的材料数/接种材料总数)×100％ ❖ 对实验结果进行分析：（1）若无污染，请总结成功的经验；
（2）若有污染，请说明导致污染的可能原因。
4、操作规程过程禁止不必要的谈话和咳嗽。还要尽量减 少工作人员在接种室内的走动。
植物组织培养实务--外植体的选择与消毒
植物组织培养实务--外植体的选择与消毒1、外植体的选择外植体是指植物组织培养中的各种接种材料。
从理论上讲，植物细胞都具有全能性，能够再生新植株，任何器官、任何组织、单个细胞和原生质体都可以作为外植体。
但实际上，不同品种、不同器官之间的分化能力有巨大差异，培养的难易程度不同。
为保证植物组织培养获得成功，选择合适的外植体是非常重要的。
（1）选择优良的种质及母株无论是离体培养繁殖种苗，还是进行生物技术研究，培养材料的选择都要从主要的植物入手，选取性状优良的种质、特殊的基因型和生长健壮的无病虫害植株。
尤其是进行离体快繁，只有选取优良的种质和基因型，离体快繁出来的种苗才有意义，才能转化成商品；生长健壮无病虫害的植株及器官或组织代谢旺盛，再生能力强，培养后容易成功。
（2）选择适当的时期组织培养选择材料时，要注意植物的生长季节和生长发育阶段，对大多数植物而言，应在其开始生长或生长旺季采样，此时材料内源激素含量高，容易分化，不仅成活率高，而且生长速度快，增殖率高。
若在生长末期或已进入休眠期时采样，则外植体可能对诱导反应迟钝或无反应。
花药培养应在花粉发育到单核靠边期取材，这时比较容易形成愈伤组织。
百合在春夏季采集的鳞茎、片，在不加生长素的培养基中，可自由地生长、分化；而其他季节则不能。
叶子花的腋芽培养，如果在1月至翌年2月间采集，则腋芽萌发非常迟缓；而在3-8月间采集，萌发的数目多，萌发速度快。
（3）选取适宜的大小培养材料的大小根据植物种类、器官和目的来确定。
通常情况下，快速繁殖时叶片、花瓣等面积为5mm2，其他培养材料的大小为0.5~1.0cm。
如果是胚胎培养或脱毒培养的材料，则应更小。
材料太大，不易彻底消毒，污染率高；材料太小，多形成愈伤组织，甚至难以成活。
（4）外植体来源要丰富为了建立一个高效而稳定的植物组织离体培养体系，往往需要反复实验，并要求实验结果具有可重复性。
因此，就需要外植体材料丰富并容易获得。
（5）外植体要易于消毒在选择外植体时，应尽量选择带杂菌少的器官或组织，降低初代培养时的污染率。
植物组织培养的基本技术与设施
（三）几种外植体的灭菌方法
1、茎尖、茎段及叶片等的消毒 ➢消毒前要经自来水较长时间的冲洗。 ➢消毒时要用70%的酒精浸泡数秒，无菌水冲洗2～3次，然后用2%～ 10%的次氯酸钠溶液浸泡10～25min，若材料有茸毛最好在消毒液中 加入几滴吐温-80，或者用0.1％～0.2％升汞浸泡消毒5～10分钟消毒 后，用无菌水冲洗3次后方可接种。
➢入无菌室前，要洗手。l%新洁尔灭溶液内5分钟 ➢入室时要穿上经过消毒的工作服、帽子、口罩和鞋子等。 ➢操作前要用70%酒精擦洗手，操作中要经常用酒精擦洗手。不准 讲话，以免微生物污染材料、培养基和用具。每次重新操作都要把 工具在火焰上消毒。 ➢必须在酒精灯火焰处进行操作，如打开瓶口，转接材料。盖瓶盖 前应将瓶口在火焰上烧一下，再将盖子也在火焰上烧一下，然后盖 上。
（二） 外植体灭菌的一般步骤
1．预处理，先对植物组织进行修整，去掉不需要的部分，将 准备使用的植物材料在流水中冲洗干净。经过预处理的植物材 料，其表面仍有很多细菌和真菌。
2．将植物组织块置于一个有丝盖的玻璃瓶中，注入75%的酒 精溶液埋没材料，浸泡10S左右。倒出酒精，用无菌水冲洗一次。
3. 将适当浓度的消毒液(0.1%升汞或2%次氯酸钠)(含有几滴活 化剂Tween20或Tween 80)，使材料完全浸没在消毒液中，盖 上盖，把玻璃瓶置入超净工作台灭菌一定时间。在灭菌期间须 把玻璃瓶摇动2～3次。 4．消毒处理后，将瓶盖打开，将消毒液倒出，注入适量的无 菌蒸馏水，再盖上盖，摇动数次，将水倒掉，重复3～4次。
行灭菌？ 5．离体培养的植物材料对光、温、湿度有何要求？
如何调控？ 6. 何谓玻璃化？何谓褐化？如何克服？
第二节 实验室的设计与设备
一、实验室设计
准备间、缓冲室、接种室、培养间 驯化室、温室
第四章——组培外植体的选择及无菌操作
三，组培污染原因和预防措施
1、污染原因 污染是指在组织培养过程中培养基和培养材料滋生
杂菌，导致培养失败的现象。 病原菌：细菌及真菌两大类。
⑴细菌污染特点-菌斑呈黏液状，接种后1-2天发现。 污染途径： 外植体带菌
培养基及器皿灭菌不彻底 操作人员未遵守操作规程
⑵真菌污染的特点-污染部分长有不同颜色的霉菌，接种后3-10天发现。 污染途径： 周围环境不清洁 超净工作台过滤装置失效 培养瓶的口径过大
• 在母株生长旺盛的季节取材，不仅成活率高，而且增殖 率也大。
1.1 外植体的选择对组培成功的影响
3，器官的生理状态和发育年龄
作为外植体的器官，其生理状态和发育年龄直接影响形态发生。一般 情况下，幼年组织比老年组织具有较高的形态发生能力，生理年龄越老的 组织或器官，越接近发育上的成熟，其再生能力逐渐减弱甚至完全失去再 生能力。
括号内为该类型植物使用该种外植体做组织培养的频率
1.1 外植体的选择对组培成功的影响
1，外植体的部位
1.1 外植体的选择对组培成功的影响
1，外植体的部位
对于大多数植物来讲，茎尖是最好的部位，由于其形态已基 本建成，生长速度快，遗传性稳定，也是获得无病毒苗的重 要途径，但茎尖往往受到材料来源的限制，而采用茎段可解 决培养材料不足的困难。
1.1 外植体的选择对组培成功的影响
4，外植体的来源
• 生长在自然环境下的植物 • 有目的地培育在温室控制条件下生长的植物 • 无菌环境下已经过离体培养的植物
自然环境中生长的植株，一般带有微生物，甚至与某些微 生物具有寄生关系，使植株具有内生菌。取自这些植物的外植 体，在培养过程中会有微生物滋生，从而影响培养效果。
已离体培养植株
多数情况下，应尽量使用温室或人工气候室控制培养的植物 材料作为外植体来源，减少培养过程中的微生物感染概率。同时， 生长在控制条件下的植物可以保持培养料间的一致性，提高实验 的可重复性，也便于培养技术的规范。
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根及地下器官的灭菌
自来水洗涤+纯酒精漂洗 +0.1%~0.2HgCl2 浸泡5~10min(或 2%NaClO浸泡10~15min) +无真菌两大类。培养基 的污染可能的来源有培养容器、培养基本身、 外植体、接种室的环境、再接种和继代时用 以转接植物材料的器械、培养室的环境以及 操作者本人。
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茎尖、茎段及叶片等材料的灭菌
自来水较长时间冲洗+70%酒精浸泡植 物种+无菌水冲洗2~3次 +2%~10%NaClO（0.1%HgCl2）12min+ 无菌水冲洗3次。
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果实及种子的灭菌
自来水冲洗10~20min + 70%酒精迅速漂洗一下（或 用2%NaClO溶液浸泡10min ）+无菌水冲洗2~3次
自 来 水 冲 洗 1 0 ~ 2 0 min+10%Ca（ClO）2 浸 泡 20~30min+70%酒精+2%NaClO溶液浸泡10min+无菌 水2~3次
种子则先要用10%Ca（ClO）2溶液浸泡20~30min 甚至几小时，依种皮硬度而定。
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花药的灭菌
70%酒精浸泡数秒钟+无菌水冲洗2~3次+ 漂白粉溶液中浸泡10min+无菌水冲洗2~3 次
※生长开始的季节采样：较幼嫩的材料 ※器官的生理状态和发肓年龄 ※外植体的大小为0.5－1.0cm
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外植体的灭菌方法
常用的灭菌剂有漂白粉（1%~10%的滤液），次 氯酸钠溶液（0.5%~10%），氯化汞 （0.1%~1%），酒精（70%~75%），过氧化氢 （3%~10%），新洁尔灭等。 灭菌程序： 第一步是刷洗，冲洗材料 第二步是洗后的材料用滤纸吸干水分，浸泡于灭 菌药剂。
第四章 外植体的选择和灭菌
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主要内容及其要求： 1. 理解外植体的选择方法 2. 掌握外植体的表面灭菌方法 3. 掌握培养物的污染原因和预防措施
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外植体的选择
※植物体的各个部位(从低等的藻类到苔藓、
蕨类、种子植物等高等植物的各类、各部分都可采 用作为组织培养的材料，一般裸子植物多采用幼苗、 芽、韧皮部细胞，被子植物采用胚、胚乳、子叶、 幼苗、茎尖、根、茎、叶、花药、花粉、子房和胚 珠等各个部分。)
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作业题 1、简述植物各种组织的表面消毒方法。 2、如何防止外植体的细菌污染和真菌污 染？
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细菌污染
1、 现象 在培养中，在培养材料附近出现黏液状物体或混浊的水迹状痕 或出现泡沫的发酵状情况，或在材料附近的培养基中出现浑浊 和云雾状痕迹，这大多是细菌污染到造成的现象。细菌污染的 特点是菌斑呈黏液状物，一般在接种1~2天即可发现。 2、 原因 材料带进菌或培养基灭菌不彻底以及操作人员的不慎等都是造 成细菌污染的重要原因。 3、 防治方法 为了减少或消除由操作人员带来的污染，接种前，工作人员必 须很好地洗手，还要用70%酒精擦拭双手。接种用的镊子或解 剖刀或接种针也要经常在酒精灯的火焰上烧灼灭菌。材料接种 好以后，将瓶口置于火焰上转动，使瓶上各部分都烧到，目的 是固定或杀死留在瓶口上的细菌及避免灰尘污染瓶口。
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真菌污染
1、现象 真菌污染就是培养基上长霉，一般接种后3~5天就可发现 霉的颜色有黑、白、黄等。 2、原因
一般多以周围环境不清洁和空气污染造成。如：接种室 的空气本身不洁净，灰尘较多；超净工作台的过滤装置失 效；培养用器皿的口径过大，操作不慎等原因引起。 3、 防治措施 在接种前要求无菌室内做到用空气循环过滤装置使空气过 滤灭菌或通过紫外线照射灭菌外，再利用超净工作台接种 前，应开机15min以达到空气的充分过滤灭菌。而且接种 时严格操作，如在接种前去掉橡皮筋，打开棉塞时动作要 轻及去掉瓶塞后瓶子应拿成斜角，最好瓶口放在酒精火焰 的前方等等。