第四章 外植体的选择和灭菌
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※生长开始的季节采样：较幼嫩的材料 ※器官的生理状态和发肓年龄 ※外植体的大小为0.5－1.0cm
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外植体的灭菌方法
常用的灭菌剂有漂白粉（1%~10%的滤液），次 氯酸钠溶液（0.5%~10%），氯化汞 （0.1%~1%），酒精（70%~75%），过氧化氢 （3%~10%），新洁尔灭等。 灭菌程序： 第一步是刷洗，冲洗材料 第二步是洗后的材料用滤纸吸干水分，浸泡于灭 菌药剂。
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细菌污染
1、 现象 在培养中，在培养材料附近出现黏液状物体或混浊的水迹状痕 或出现泡沫的发酵状情况，或在材料附近的培养基中出现浑浊 和云雾状痕迹，这大多是细菌污染到造成的现象。细菌污染的 特点是菌斑呈黏液状物，一般在接种1~2天即可发现。 2、 原因 材料带进菌或培养基灭菌不彻底以及操作人员的不慎等都是造 成细菌污染的重要原因。 3、 防治方法 为了减少或消除由操作人员带来的污染，接种前，工作人员必 须很好地洗手，还要用70%酒精擦拭双手。接种用的镊子或解 剖刀或接种针也要经常在酒精灯的火焰上烧灼灭菌。材料接种 好以后，将瓶口置于火焰上转动，使瓶上各部分都烧到，目的 是固定或杀死留在瓶口上的细菌及避免灰尘污染瓶口。
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根及地下器官的灭菌
自来水洗涤+纯酒精漂洗 +0.1%~0.2HgCl2 浸泡5~10min(或 2%NaClO浸泡10~15min) +无菌水 冲洗3次
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污染原因和预防措施
污染的病原分为细菌和真菌两大类。培养基 的污染可能的来源有培养容器、培养基本身、 外植体、接种室的环境、再接种和继代时用 以转接植物材料的器械、培养室的环境以及 操作者本人。
自 来 水 冲 洗 1 0 ~ 2 0 min+10%Ca（ClO）2 浸 泡 20~30min+70%酒精+2%NaClO溶液浸泡10min+无菌 水2~3次
种子则先要用10%Ca（ClO）2溶液浸泡20~30min 甚至几小时，依种皮硬度而定。
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wk.baidu.com
花药的灭菌
70%酒精浸泡数秒钟+无菌水冲洗2~3次+ 漂白粉溶液中浸泡10min+无菌水冲洗2~3 次
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作业题 1、简述植物各种组织的表面消毒方法。 2、如何防止外植体的细菌污染和真菌污 染？
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茎尖、茎段及叶片等材料的灭菌
自来水较长时间冲洗+70%酒精浸泡植 物种+无菌水冲洗2~3次 +2%~10%NaClO（0.1%HgCl2）12min+ 无菌水冲洗3次。
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果实及种子的灭菌
自来水冲洗10~20min + 70%酒精迅速漂洗一下（或 用2%NaClO溶液浸泡10min ）+无菌水冲洗2~3次
第四章 外植体的选择和灭菌
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主要内容及其要求： 1. 理解外植体的选择方法 2. 掌握外植体的表面灭菌方法 3. 掌握培养物的污染原因和预防措施
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外植体的选择
※植物体的各个部位(从低等的藻类到苔藓、
蕨类、种子植物等高等植物的各类、各部分都可采 用作为组织培养的材料，一般裸子植物多采用幼苗、 芽、韧皮部细胞，被子植物采用胚、胚乳、子叶、 幼苗、茎尖、根、茎、叶、花药、花粉、子房和胚 珠等各个部分。)
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真菌污染
1、现象 真菌污染就是培养基上长霉，一般接种后3~5天就可发现 霉的颜色有黑、白、黄等。 2、原因
一般多以周围环境不清洁和空气污染造成。如：接种室 的空气本身不洁净，灰尘较多；超净工作台的过滤装置失 效；培养用器皿的口径过大，操作不慎等原因引起。 3、 防治措施 在接种前要求无菌室内做到用空气循环过滤装置使空气过 滤灭菌或通过紫外线照射灭菌外，再利用超净工作台接种 前，应开机15min以达到空气的充分过滤灭菌。而且接种 时严格操作，如在接种前去掉橡皮筋，打开棉塞时动作要 轻及去掉瓶塞后瓶子应拿成斜角，最好瓶口放在酒精火焰 的前方等等。
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外植体的灭菌方法
常用的灭菌剂有漂白粉（1%~10%的滤液），次 氯酸钠溶液（0.5%~10%），氯化汞 （0.1%~1%），酒精（70%~75%），过氧化氢 （3%~10%），新洁尔灭等。 灭菌程序： 第一步是刷洗，冲洗材料 第二步是洗后的材料用滤纸吸干水分，浸泡于灭 菌药剂。
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细菌污染
1、 现象 在培养中，在培养材料附近出现黏液状物体或混浊的水迹状痕 或出现泡沫的发酵状情况，或在材料附近的培养基中出现浑浊 和云雾状痕迹，这大多是细菌污染到造成的现象。细菌污染的 特点是菌斑呈黏液状物，一般在接种1~2天即可发现。 2、 原因 材料带进菌或培养基灭菌不彻底以及操作人员的不慎等都是造 成细菌污染的重要原因。 3、 防治方法 为了减少或消除由操作人员带来的污染，接种前，工作人员必 须很好地洗手，还要用70%酒精擦拭双手。接种用的镊子或解 剖刀或接种针也要经常在酒精灯的火焰上烧灼灭菌。材料接种 好以后，将瓶口置于火焰上转动，使瓶上各部分都烧到，目的 是固定或杀死留在瓶口上的细菌及避免灰尘污染瓶口。
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根及地下器官的灭菌
自来水洗涤+纯酒精漂洗 +0.1%~0.2HgCl2 浸泡5~10min(或 2%NaClO浸泡10~15min) +无菌水 冲洗3次
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污染原因和预防措施
污染的病原分为细菌和真菌两大类。培养基 的污染可能的来源有培养容器、培养基本身、 外植体、接种室的环境、再接种和继代时用 以转接植物材料的器械、培养室的环境以及 操作者本人。
自 来 水 冲 洗 1 0 ~ 2 0 min+10%Ca（ClO）2 浸 泡 20~30min+70%酒精+2%NaClO溶液浸泡10min+无菌 水2~3次
种子则先要用10%Ca（ClO）2溶液浸泡20~30min 甚至几小时，依种皮硬度而定。
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花药的灭菌
70%酒精浸泡数秒钟+无菌水冲洗2~3次+ 漂白粉溶液中浸泡10min+无菌水冲洗2~3 次
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作业题 1、简述植物各种组织的表面消毒方法。 2、如何防止外植体的细菌污染和真菌污 染？
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茎尖、茎段及叶片等材料的灭菌
自来水较长时间冲洗+70%酒精浸泡植 物种+无菌水冲洗2~3次 +2%~10%NaClO（0.1%HgCl2）12min+ 无菌水冲洗3次。
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果实及种子的灭菌
自来水冲洗10~20min + 70%酒精迅速漂洗一下（或 用2%NaClO溶液浸泡10min ）+无菌水冲洗2~3次
第四章 外植体的选择和灭菌
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主要内容及其要求： 1. 理解外植体的选择方法 2. 掌握外植体的表面灭菌方法 3. 掌握培养物的污染原因和预防措施
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外植体的选择
※植物体的各个部位(从低等的藻类到苔藓、
蕨类、种子植物等高等植物的各类、各部分都可采 用作为组织培养的材料，一般裸子植物多采用幼苗、 芽、韧皮部细胞，被子植物采用胚、胚乳、子叶、 幼苗、茎尖、根、茎、叶、花药、花粉、子房和胚 珠等各个部分。)
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真菌污染
1、现象 真菌污染就是培养基上长霉，一般接种后3~5天就可发现 霉的颜色有黑、白、黄等。 2、原因
一般多以周围环境不清洁和空气污染造成。如：接种室 的空气本身不洁净，灰尘较多；超净工作台的过滤装置失 效；培养用器皿的口径过大，操作不慎等原因引起。 3、 防治措施 在接种前要求无菌室内做到用空气循环过滤装置使空气过 滤灭菌或通过紫外线照射灭菌外，再利用超净工作台接种 前，应开机15min以达到空气的充分过滤灭菌。而且接种 时严格操作，如在接种前去掉橡皮筋，打开棉塞时动作要 轻及去掉瓶塞后瓶子应拿成斜角，最好瓶口放在酒精火焰 的前方等等。