氟喹诺酮类药物在牛奶中残留研究
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96.0 314.0
CE （v） 25.0 41.0 41.0 25.0 18.0 35.0 18.0 25.0 36.0 15.0 18.0 32.0 40.0 18.0 18.0 35.0 17.0 40.0 35.0 20.0 35.0 21.0 32.0 17.0 35.0 20.0
CEP (v)
结语
本方法制备了抗恩诺沙星单克隆抗体，为试剂 盒和IAC免疫亲和柱的开发建立了基础
本方法建立了13种FQs 在牛奶中的LC-MS/MS 确证方法。
子离子（m/z）
244.10 201.90 216.0 244.1 215.1 187.1 276.0 302.0 262.0 320.0 288.0 245.0 245.1 316.0 342.0 299.0 356.0 299.0 261.0 318.0 233.0 290.0 265.0 308.0
麻保沙星marbofloxacin* 环丙沙星ciprofloxacin 沙拉沙星sarafloxacin* 萘啶酸nalidixic acid 氧氟沙星ofloxacin 达氟沙星danofloxacin* 洛美沙星lomefloxacin
诺氟沙星norfloxacin 恩诺沙星enrofloxacin* 二氟沙星difloxacin* 氟甲喹flumequine* 培氟沙星pefloxacin 恶喹酸oxolinic acid* *表示畜禽专用
50、50、100、300
肉+皮
肌肉、脂肪、肝、肾 肌肉、皮、肝、肾
肌肉+皮
皮、肝
肉+皮
150
100、50、150、150 100、50、150、150
300
10、100
30
LC-MS/MS方法研究
仪器 高速分散器：IKA T18；氮气浓缩仪：Zymak TurboVap(r) LV；全 自动固相萃取仪：Gilson ASPEC XL4;Agilent 1100 高效液相色谱 仪；API 2000四极杆串联质谱仪。
LC-MS/MS条件
色谱条件
色谱柱：Nucleodur 100-3 c18
保护柱：zorbax xdb-c8 2.1×12.5mm
进样量：20μL。
流动相：0.1%甲酸（A）和0.1%甲酸乙睛（B）
梯度洗脱
Step
Total Time
Flow Rate A (%)
B (%)
(min)
(µl/min)
CV（%） 7.22 5.48 3.87 6.87
11.14 10.74
5.54 19.26 17.62
6.64 5.96 6.48 7.24
回收率(%) 74.24
116.82 210.18
87.85 104.23
89.49 102.36
66.57 91.67 82.32 81.25 76.57 91.25
25.0 25.0 25.0 25.0 20.0 20.0 22.0 22.0 28.0 28.0 24.0 24.0 25.0 25.0 25.0 25.0 24.0 35.0 27.0 27.0 22.0 22.0 23.0 26.0 28.0 30.0
样品加标回收率
标样 Mar nor cip dan enr sar dif oxo nal flu pef ofl lom
提取 吸取牛奶1.0 mL于2.0 mL聚丙烯离心管中，加入30%乙腈三氯乙
酸0.5 mL，涡旋混匀15 sec，15 000 g离心6 min；下层残余物中 加入蒸馏水1.0 mL及30%乙腈三氯乙酸0.5 mL，涡旋，离心，重复 提取一次，合并上清液为SPE净化样液。 SPE净化（GILSON全自动固相萃取）
XIC of +MRM (26 pairs): 262.0/244.1 amu from Sample 7 (liver0ppb) of Data0420.wiff 5500
Max. 740.0 cps.
5000
4500
4000
3500
3000
2500
2000
1500
1000 500 0
9.25
2.59 2.10
0
0.00
300
87.0
13.0
1
10.00
300
20.0
80.0
2
10.01
300
87.0
13.0
3
20.00
300
87.0
13.0
质谱条件
扫描方式：多级反应监测（MRM）；正离子；ESI源。
CUR： CAD： IS：
20.00 5.00 5500.00
GS2： GS1： TEM：
20.00 20.00 500.00
肌肉、脂肪、肝、肾
ADI：0-24
泌乳牛禁用
鸡
肌肉、皮、肝、肾
猪
肌肉、皮、肝、肾
MRL（ppb）
200、100、400、400
200、100、400、400 100、50、200、200
二氟沙星 Difloxacin ADI:0-10 恩诺沙星 Enrofloxacin ADI: 0-6.2
氟甲喹 Flumequine ADI: 0-8.25 恶喹酸 Oxolinic acid ADI：0-1.2 沙拉沙星 Sarafloxacin ADI:0-0.4
9.52
1
2
3
4
5
6
7
8
9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Time, min
加标 2ppb LC-MS/MS MRM谱图
In te n s ity , c p s
XIC of +MRM (26 pairs): 262.0/244.1 amu from Sample 10 (liver+2ppb) of Data0420.wiff
肌肉、皮、肝、肾
300、400、1900、600
肌肉、脂肪、肝、肾、奶 100、100、300、200、100
肌肉、脂肪、肝、肾
100、100、200、300
肌肉、皮、肝、肾
100、100、200、300
肌肉、皮、肝、肾
100、100、200、300
肌肉、脂肪、肝、肾
100、100、300、200
肌肉、脂肪、肝、肾
LC-MS/MS检测喹诺酮类药物在牛 奶中的残留确证方法
饶勇
raoyong23@126.com
一、概述
氟喹诺酮类 (fluoroquinolones, FQs) 药物是第三代喹诺酮类(quinolones,
QNs)药物，其主要作用机制是抑制细菌的DNA螺旋酶，因其抗菌谱广、 抗菌力强、组织穿透力强、不良反应少而且价格较低而被广泛的应 用于人类及动物感染性疾病的预防和治疗。
1800 1600
10.61
1400 1200
9.55
1000
800
600
400
200
3.96 4.97
Leabharlann Baidu7.68
11.84
14.61
17.17
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Time, min
空白牛奶LC-MS/MS MRM谱图
In te n s ity , c p s
水平 ppb 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00
SD 1.072 0.640 0.814 0.302 1.161 0.961 0.567 2.564 2.731 1.093 1.201 0.558 1.026
Max. 1260.0 cps.
1960 1900
1800
1700
1600
1500
1400
1300 1200
10.95
1100
1000 900
9.49
800
700
600
500
400
300
2.48
9.28
200 100 1.13
3.76
7.10 7.50 8.93
10.22 11.77
14.47 16.58 17.44
13种氟喹诺酮类药物MRM离子对、CE和CEP
测定物质 氟甲喹 恶喹酸 萘啶酸
诺氟沙星 麻保沙星 环丙沙星 恩诺沙星 沙拉沙星 二氟沙星 氧氟沙星 培氟沙星 洛美沙星 诺氟沙星
母离子 （m/z） 262.00
262.0 233.1 320.0 363.0 332.1 360.3 386.1 400.1 362.1 334.1 352.1 358.1
19.22
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Time, min
检测限和定量限
本方法对13种FQs药物的检测限（LOD）和定 量限（LOQ）分别为（ppb）：
麻保沙星0.5(2)；诺氟沙星0.5(2)；氧氟沙星 0.5(2)；培氟沙星0.5(2)；环丙沙星0.5(2)；洛 美沙星0.1(0.5)；达氟沙星0.2(1)；恩诺沙星 0.2(1)；沙拉沙星0.5(2)；二氟沙星0.5(2)；氟 甲喹0.5（2）；恶喹酸0.5(2)；萘啶酸0.1(0.4)。
标准品 盐酸环丙沙星、甲磺酸培氟沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、甲磺酸 达氟沙星和盐酸洛美沙星，为化学对照品，含量大于99.0%，均 由中国兽医药品监查所提供；氧氟沙星、诺氟沙星标准品，购于 Sigma；盐酸二氟沙星对照品，广州惠华动物保健品有限公司提 供；麻保沙星对照品，广东燕塘动物药业有限公司提供。
样品前处理过程
反相聚合物SPE柱（Strata-X或HLB）以3 mL甲醇活化和3 mL纯 净水平衡，上样，3 mL纯净水和3 mL 20%甲醇淋洗，负压抽干； 甲醇3 mL洗脱药物，收集洗脱液，负压抽干。 浓缩及定容
将洗脱液于60～70℃氮气流吹干，用1.0 mL流动相溶解残留物， 旋涡混匀，15 000 g离心6 min，取上清液测定。
残留危害
过敏反应 肝毒性和肾毒性 软骨损伤 潜在的致癌性 破坏消化道微生物的群落结构 耐药性
鸡源大肠杆菌的对9种氟喹诺酮类药物的耐药率
喹诺酮类药物 Gatifloxacin
沙拉沙星 恩诺沙星 环丙沙星 二氟沙星 达氟沙星 左氟沙星 奥比沙星
萘啶酸
耐药率 11% 69% 69% 55% 76% 69% 13% 76% 99%
我国动物性食品中氟喹诺酮的最高残留限 量（MRL，μg/kg）
美国：禁止该类药物用于食品动物 欧盟：计划到2006年全面禁止抗生素在食品动 物中的使用 中国：农牧发[1999]17号规定了最高残留限量
残留限量（农牧发[1999]17号）
药物
残留标示物 动物 组织
达氟沙星Danofloxacin Danofloxacin 牛
标样2ppb LC-MS/MS MRM谱图
In te n s ity , c p s
XIC of +MRM (26 pairs): 262.0/244.1 amu from Sample 1 (2ppb-st) of Data0420.wiff
Max. 1620.0 cps.
2300 2200
2000
Difloxacin 牛
猪
鸡/火鸡
Enrofloxacin 牛
+
兔
Ciprofloxacin 猪
禽
羊
Flumequine 牛/羊/猪
/鸡
鲑鱼
Oxolinic acid 牛
猪/鸡
养殖鱼
Sarafloxacin 鸡
鲑鱼
肌肉、皮、肝、肾
400、100、140、0800
肌肉、皮、肝、肾
400、100、800、800
CE （v） 25.0 41.0 41.0 25.0 18.0 35.0 18.0 25.0 36.0 15.0 18.0 32.0 40.0 18.0 18.0 35.0 17.0 40.0 35.0 20.0 35.0 21.0 32.0 17.0 35.0 20.0
CEP (v)
结语
本方法制备了抗恩诺沙星单克隆抗体，为试剂 盒和IAC免疫亲和柱的开发建立了基础
本方法建立了13种FQs 在牛奶中的LC-MS/MS 确证方法。
子离子（m/z）
244.10 201.90 216.0 244.1 215.1 187.1 276.0 302.0 262.0 320.0 288.0 245.0 245.1 316.0 342.0 299.0 356.0 299.0 261.0 318.0 233.0 290.0 265.0 308.0
麻保沙星marbofloxacin* 环丙沙星ciprofloxacin 沙拉沙星sarafloxacin* 萘啶酸nalidixic acid 氧氟沙星ofloxacin 达氟沙星danofloxacin* 洛美沙星lomefloxacin
诺氟沙星norfloxacin 恩诺沙星enrofloxacin* 二氟沙星difloxacin* 氟甲喹flumequine* 培氟沙星pefloxacin 恶喹酸oxolinic acid* *表示畜禽专用
50、50、100、300
肉+皮
肌肉、脂肪、肝、肾 肌肉、皮、肝、肾
肌肉+皮
皮、肝
肉+皮
150
100、50、150、150 100、50、150、150
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10、100
30
LC-MS/MS方法研究
仪器 高速分散器：IKA T18；氮气浓缩仪：Zymak TurboVap(r) LV；全 自动固相萃取仪：Gilson ASPEC XL4;Agilent 1100 高效液相色谱 仪；API 2000四极杆串联质谱仪。
LC-MS/MS条件
色谱条件
色谱柱：Nucleodur 100-3 c18
保护柱：zorbax xdb-c8 2.1×12.5mm
进样量：20μL。
流动相：0.1%甲酸（A）和0.1%甲酸乙睛（B）
梯度洗脱
Step
Total Time
Flow Rate A (%)
B (%)
(min)
(µl/min)
CV（%） 7.22 5.48 3.87 6.87
11.14 10.74
5.54 19.26 17.62
6.64 5.96 6.48 7.24
回收率(%) 74.24
116.82 210.18
87.85 104.23
89.49 102.36
66.57 91.67 82.32 81.25 76.57 91.25
25.0 25.0 25.0 25.0 20.0 20.0 22.0 22.0 28.0 28.0 24.0 24.0 25.0 25.0 25.0 25.0 24.0 35.0 27.0 27.0 22.0 22.0 23.0 26.0 28.0 30.0
样品加标回收率
标样 Mar nor cip dan enr sar dif oxo nal flu pef ofl lom
提取 吸取牛奶1.0 mL于2.0 mL聚丙烯离心管中，加入30%乙腈三氯乙
酸0.5 mL，涡旋混匀15 sec，15 000 g离心6 min；下层残余物中 加入蒸馏水1.0 mL及30%乙腈三氯乙酸0.5 mL，涡旋，离心，重复 提取一次，合并上清液为SPE净化样液。 SPE净化（GILSON全自动固相萃取）
XIC of +MRM (26 pairs): 262.0/244.1 amu from Sample 7 (liver0ppb) of Data0420.wiff 5500
Max. 740.0 cps.
5000
4500
4000
3500
3000
2500
2000
1500
1000 500 0
9.25
2.59 2.10
0
0.00
300
87.0
13.0
1
10.00
300
20.0
80.0
2
10.01
300
87.0
13.0
3
20.00
300
87.0
13.0
质谱条件
扫描方式：多级反应监测（MRM）；正离子；ESI源。
CUR： CAD： IS：
20.00 5.00 5500.00
GS2： GS1： TEM：
20.00 20.00 500.00
肌肉、脂肪、肝、肾
ADI：0-24
泌乳牛禁用
鸡
肌肉、皮、肝、肾
猪
肌肉、皮、肝、肾
MRL（ppb）
200、100、400、400
200、100、400、400 100、50、200、200
二氟沙星 Difloxacin ADI:0-10 恩诺沙星 Enrofloxacin ADI: 0-6.2
氟甲喹 Flumequine ADI: 0-8.25 恶喹酸 Oxolinic acid ADI：0-1.2 沙拉沙星 Sarafloxacin ADI:0-0.4
9.52
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9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Time, min
加标 2ppb LC-MS/MS MRM谱图
In te n s ity , c p s
XIC of +MRM (26 pairs): 262.0/244.1 amu from Sample 10 (liver+2ppb) of Data0420.wiff
肌肉、皮、肝、肾
300、400、1900、600
肌肉、脂肪、肝、肾、奶 100、100、300、200、100
肌肉、脂肪、肝、肾
100、100、200、300
肌肉、皮、肝、肾
100、100、200、300
肌肉、皮、肝、肾
100、100、200、300
肌肉、脂肪、肝、肾
100、100、300、200
肌肉、脂肪、肝、肾
LC-MS/MS检测喹诺酮类药物在牛 奶中的残留确证方法
饶勇
raoyong23@126.com
一、概述
氟喹诺酮类 (fluoroquinolones, FQs) 药物是第三代喹诺酮类(quinolones,
QNs)药物，其主要作用机制是抑制细菌的DNA螺旋酶，因其抗菌谱广、 抗菌力强、组织穿透力强、不良反应少而且价格较低而被广泛的应 用于人类及动物感染性疾病的预防和治疗。
1800 1600
10.61
1400 1200
9.55
1000
800
600
400
200
3.96 4.97
Leabharlann Baidu7.68
11.84
14.61
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空白牛奶LC-MS/MS MRM谱图
In te n s ity , c p s
水平 ppb 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00
SD 1.072 0.640 0.814 0.302 1.161 0.961 0.567 2.564 2.731 1.093 1.201 0.558 1.026
Max. 1260.0 cps.
1960 1900
1800
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10.95
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1000 900
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9.28
200 100 1.13
3.76
7.10 7.50 8.93
10.22 11.77
14.47 16.58 17.44
13种氟喹诺酮类药物MRM离子对、CE和CEP
测定物质 氟甲喹 恶喹酸 萘啶酸
诺氟沙星 麻保沙星 环丙沙星 恩诺沙星 沙拉沙星 二氟沙星 氧氟沙星 培氟沙星 洛美沙星 诺氟沙星
母离子 （m/z） 262.00
262.0 233.1 320.0 363.0 332.1 360.3 386.1 400.1 362.1 334.1 352.1 358.1
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Time, min
检测限和定量限
本方法对13种FQs药物的检测限（LOD）和定 量限（LOQ）分别为（ppb）：
麻保沙星0.5(2)；诺氟沙星0.5(2)；氧氟沙星 0.5(2)；培氟沙星0.5(2)；环丙沙星0.5(2)；洛 美沙星0.1(0.5)；达氟沙星0.2(1)；恩诺沙星 0.2(1)；沙拉沙星0.5(2)；二氟沙星0.5(2)；氟 甲喹0.5（2）；恶喹酸0.5(2)；萘啶酸0.1(0.4)。
标准品 盐酸环丙沙星、甲磺酸培氟沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、甲磺酸 达氟沙星和盐酸洛美沙星，为化学对照品，含量大于99.0%，均 由中国兽医药品监查所提供；氧氟沙星、诺氟沙星标准品，购于 Sigma；盐酸二氟沙星对照品，广州惠华动物保健品有限公司提 供；麻保沙星对照品，广东燕塘动物药业有限公司提供。
样品前处理过程
反相聚合物SPE柱（Strata-X或HLB）以3 mL甲醇活化和3 mL纯 净水平衡，上样，3 mL纯净水和3 mL 20%甲醇淋洗，负压抽干； 甲醇3 mL洗脱药物，收集洗脱液，负压抽干。 浓缩及定容
将洗脱液于60～70℃氮气流吹干，用1.0 mL流动相溶解残留物， 旋涡混匀，15 000 g离心6 min，取上清液测定。
残留危害
过敏反应 肝毒性和肾毒性 软骨损伤 潜在的致癌性 破坏消化道微生物的群落结构 耐药性
鸡源大肠杆菌的对9种氟喹诺酮类药物的耐药率
喹诺酮类药物 Gatifloxacin
沙拉沙星 恩诺沙星 环丙沙星 二氟沙星 达氟沙星 左氟沙星 奥比沙星
萘啶酸
耐药率 11% 69% 69% 55% 76% 69% 13% 76% 99%
我国动物性食品中氟喹诺酮的最高残留限 量（MRL，μg/kg）
美国：禁止该类药物用于食品动物 欧盟：计划到2006年全面禁止抗生素在食品动 物中的使用 中国：农牧发[1999]17号规定了最高残留限量
残留限量（农牧发[1999]17号）
药物
残留标示物 动物 组织
达氟沙星Danofloxacin Danofloxacin 牛
标样2ppb LC-MS/MS MRM谱图
In te n s ity , c p s
XIC of +MRM (26 pairs): 262.0/244.1 amu from Sample 1 (2ppb-st) of Data0420.wiff
Max. 1620.0 cps.
2300 2200
2000
Difloxacin 牛
猪
鸡/火鸡
Enrofloxacin 牛
+
兔
Ciprofloxacin 猪
禽
羊
Flumequine 牛/羊/猪
/鸡
鲑鱼
Oxolinic acid 牛
猪/鸡
养殖鱼
Sarafloxacin 鸡
鲑鱼
肌肉、皮、肝、肾
400、100、140、0800
肌肉、皮、肝、肾
400、100、800、800