细胞培养入门技术PPT课件

原代培养(primary culture)，或
称为初代培养，就是从供体取下组
织细胞后在体外进行的首次培养，
中途不分割培养物。常用的原代培
养方法有组织块培养法和消化培养
法。
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细胞培养的基本概念
传代培养 （Secondly Culture）
传代培养(secondly culture)，在 原代培养物铺展为单细胞层后，将 原代培养细胞分开接种到两个或多 个新的培养瓶中继续培养增殖。
准备室
仪 器
台
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无菌操作室
下风口
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上风口
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超净工作台和CO2培养箱
nCO2培养箱设定的条件为37 ℃ ，5％CO2 n使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题：
①用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以 保证通气。
②保持培养箱内空气干净。定期消毒
③内湿箱度内2.，蒸细避馏胞免水培培槽养中养液预的蒸留主发灭要。菌蒸实馏验水设，备以保持箱
的天然培养基（如血清）。
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• 血清中含有：
• ①多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等） • ②多种金属离子 ； ③激素；
④促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等。 • ⑤各种生长因子 • ⑥转移蛋白 • ⑦不明成分
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•
•
胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细
胞。
•
胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液配
制常用的胰蛋白酶液浓度是0.25％ 。用滤器过滤除菌。
• 胰蛋白酶液消化时间：2-10分钟。
• 用含血清培养液终止其对细胞的消化作用
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培养基
• 培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培养基 和合成培养基。
细胞培养基本技术
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• 目的：了解哺乳动物细胞培养的一般步骤， 学习细胞培养基本技术
• 原理：无菌操作 细胞休眠
20ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ1
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细胞培养前的实验准备 1.细胞培养室设置
实
离心机
橱柜
实验台
显 微
验
镜
台
超
缓冲间
衣 柜
无菌操作室
冰箱 递物窗
培养箱
净 工 作 台
试剂柜
冰
实
箱
实实
实实
验
水 池
验验 台台
验验 台台
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• 细胞培养：使用单个细胞悬液
• 组织培养：使用组织块（O.5～1立方毫米）或薄 片（厚0.2 毫米）
• 器官培养：使用器官原基或器官的一部分或整个 器宫
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细胞培养的基本概念
培养细胞的类型
v 贴附型
§成纤维样细胞型 §上皮样细胞型
v 悬浮型
培养培人养真的皮骨成髓纤瘤维细细胞胞
0
24
48
72
96
120 小时
正常培养细胞的生长曲线
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培养细胞生长的条件
• 1 细胞的营养需要
• 2 细胞的生存环境
• 温度: 37 ℃
• O2
• CO2: 5%
CO2 +H2O ← →H2CO3 ← →H+ + HCO3-
• pH: 7.2-7.4
• 渗透压
• 3 无污染
• 4 无毒
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n 血清的消毒：过滤除菌
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n 血清的使用浓度为5％～20％
细胞培养用器皿的清洗和消毒
一般玻璃器皿的清洗分为四个步骤：
1、自来水浸泡 2、洗涤剂刷洗(如有必要进行超声处理） 3、泡酸（浓硫酸、重铬酸钾及蒸馏水） 4、流水冲洗过夜，依次用蒸馏水、三蒸水漂洗，最
后烘干备用
ÿ 常用消毒方法：
1、湿热灭菌法（高压蒸汽灭菌），15磅，15～20min 2、过滤除菌(如：血清的除菌）
n超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱 动空气通过高效滤器除去空气中的尘埃颗
2粒021，使空气得到净化。净化空气徐徐5通过 工作台面，使工作台内构成无菌环境。
解剖显微镜
倒置显微镜
2.细胞培养的20主21 要实验设备
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细胞培养的主要试剂（培养基）
基础培养基（人工合成）：干粉培养基DMEM 、α-MEM、RPMI1640 血清（天然成分）： 水：高纯度的去离子水 抗菌素：通常是青霉素和链霉素联合使用，使用浓度为100U/ml
许多种培养基，如TC199、MEM、RPMI-1640、
DMEM等。
•
合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳
水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。
•
优点：标准化生产，组分和含量相对固定。
•
成本低
•
缺点： 缺少某些成分，不能完全满足体外细
胞生长需要。
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•
人工合成培养基只能维持细胞生存，
要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量
• 天然培养基：
• 天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。
• 优点：营养成分丰富，培养效果好
• 缺点：来源受限。
•
成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析。
•
易发生支原体污染
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合成培养基
•
合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类
和数量，用人工方法模拟合成的。目前已设计出
消化液：常用0.25％胰蛋白酶，使细胞脱离组织或容器壁， 用含血清培养液中止其活性
n 血清质量好坏是实验成败的关键。
n 常用血清有胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清、马血清等， 其中以胎牛血清质量最好。
n 优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体病毒污 染。
n 血清的灭活（消除补体活性）：56 ℃ ，30 分钟
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培养人口腔上皮细胞
细胞培养的基本概念
贴附型细胞的生长特性
v 细胞的贴壁生长 v 接触抑制 v 细胞的生长曲线
细胞细贴胞壁的延接展触过抑程制(现模象式图)
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指数生长期是最佳实验期 !
细胞指数生 长极限点
细 胞 数 量
潜伏期
指数生长期
细胞数增大极限点， 出现接触抑制
平台期
退化死亡
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细胞培养用液的配制
水：新鲜配置的三蒸水或去离子水
平衡盐溶液：无Ca2+、Mg2+的缓冲液
PBS：NaCl
8.0 g
KCl
0.2 g
Na2HPO4.H2O KH2PO4 加水至1000 ml
1.56 g 0.20
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• 消化液：
•
胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细胞
间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离。
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细胞培养的基本概念
细胞培养 （Cell Culture）
细胞培养(cell culture)是指细胞的离 体培养，是在无菌条件下，把动物或植 物的细胞从机体中分离出来，置于培养 皿中，并在一个合适的环境中，给以营 养物质，使之继续生存和繁殖的方法。
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细胞培养的基本概念
原代培养
（Primary Culture）