一位论坛会员朋友关于痰涂片的解答

一位论坛会员朋友关于痰涂片的解答（by 巴斯德之徒）此帖转自微生物之家论坛，看到对从事微生物工作的朋友很有价值，转过来供医内网的朋友学习一下。

以下是一位来自郑州的微生物之家论坛的会员朋友给我的信件：我做出了如下的回答：希望有类似问题的朋友积极讨论。

目前我们开展痰涂片已经一段时间了，现将一些关于痰涂片的疑问请教巴老师。

1. 关于涂片和染色方法。

我们现在是不洗涤直接涂片染色。

实际工作中遇到的问题是：有时浓痰不好涂匀，染色时不好掌握脱色时间（有时脱色过度，有时脱色不足），有时片上残留有染料结晶，影响读片。

我需要关于不同标本具体涂片方式方面的资料，我只找到一篇四军大的过样豹老师的论文《原始标本涂片检查对微生物检验全过程的导航作用》文中只简单提到涂抹法、压片法等，没有具体阐述。

不知老师有这方面的资料或经验能与我分享吗？您们对于不同标本涂片方法尤其是痰涂片染色方法有什么技巧或经验吗？对于痰涂片最好洗涤后在涂，杂菌少些，便于读片；涂片采用压片法，我在上次的邮件中已经详细叙述，再仔细读读。

关于Gram染色的效果与染料和染色技术都有密切关系，我曾在论坛上发过我的改良染色液及相应的染色法，到论坛搜搜看。

染得好菌落涂片，不一定染得好痰片，后者最考验技术。

2. 关于直接涂片和培养不一致情况。

通过涂片和培养对照，发现有时不一致。

具体表现在：① 涂片不合格（上皮细胞＞25/lp，白细胞＞或＜10/lp），平板上见到大量革兰阴性杆菌（++到+++）和少量革兰阳性球菌或杆菌。

这时是否需要鉴定优势的革兰阴性杆菌？还是报正常菌群？② 痰液稀薄像口水，涂片上几乎未见细胞（白细胞和上皮细胞均＜10/lp）和细菌，平板上见少量阴杆（+）和阴球（多为奈瑟菌+到++）。

直接涂片上无细胞和细菌见于那些情况？如果是口水不是应该有大量上皮和杂菌吗？以上两种情况我们不会接种的，所以也就不存在不符合的说法——既然标本都不合格就没有必要做的，浪费资源，出的结果还等于垃圾。

③ 涂片合格但白细胞内未见细菌，平板上优势菌与涂片上优势菌不一致。

是否需要进一步鉴定？鉴定哪种菌？要在白细胞内找细菌，首先片子必须染好，细菌一般是在中性粒细胞中的，要看到胞浆中的细菌就必须要求染出的片子中的白细胞是被压扁的，这样显得体积大些，便于观察；其次，胞浆和胞核对比度强烈，胞浆着色浅，如果有细菌一目了然；其三，搜寻的部位是白细胞较密集，但互相不重叠挤压，旁边没有细菌球（团块状正常菌群集落）或者上皮细胞，否则粘附现象会很重，可能导致你的判断错误。

如果片子染色很好，胞外也很少有正常菌群，连续看上20~50个视野都没有发现脓细胞胞内有细菌的话，可能该标本是一个经过治疗后采集的痰液，细菌已经被抗生素抑制或杀灭了；抑或是象结核杆菌、肺炎支原体或嗜肺军团菌等导致的，采用Gram 染色是看不到病原体的，必须采用特殊染色法——对于这样的标本，次日培养物是不需要处理的，直接报告阴性即可。

如果你们还做了特殊染色，并发现问题，就可以向临床建议，让他们加做这些特殊病原体的培养，例如结核杆菌培养、肺炎支原体检测等。

④涂片合格并见到白细胞吞噬细菌（一般为G+球菌），可平板上白细胞内吞噬菌不占优势或根本见不到，而涂片上未见细菌（一般为G—杆菌）平板上却有生长（+）。

这种现象可能原因？该怎样报告结果？一定要以读片为准，不要去管它什么优势菌与否，我反复强调，关于优势菌的理论只能用在肠道菌群变化的解释上，不能用于痰培养病原菌的确证上，这个理论用于痰培养根本就是一个错误！你要学会将镜下形态和菌落形态以及菌落涂片形态联系起来的思维方法，要学会正确辨认痰涂片中的有意义细菌和该细菌在培养基的上可能会出现的菌落形态——如果一旦发现，不管量的多少，都要传代分纯。

而有些情况下，见到的细菌你不一定都能培养得出来，例如如果感染菌是一厌氧菌，你采用普通环境培养就肯定不会生长的。

再有就是苛养菌，目前很多医院都是使用的商品化血琼脂，几乎分离不出肺炎球菌的。

巧克力培养基质量也奇差。

看到细菌但分离不出来也就顺理成章了——即使自己做培养基也存在问题，动物血源就是个大问题，山羊血与人血都是不允许做培养基的，因为效果实在太差！对此你们只能加强首代分离培养基的质量控制（血琼脂必须用淋球菌、肺炎球菌、酿脓链球菌进行试验），选一家质量好的使用。

另外就是抗生素的经验性应用也是导致这种改变的原因。

涂片未见细菌而培养生长的情况一般分两种，其一是生长的细菌根本就是定植菌，且量少，涂片时由于受显微镜所见的范围的限制没有被注意到，而接种的量一般都比涂片的量大，长出细菌很正常。

这样的情况一般无需处理；其二就是由于抗生素的经验性应用使得细菌细胞壁缺陷，发生L型变异，形态随之改变，染色特性也发生改变，没有L型菌研究经验的实验人员是无法正确辨认痰片中的L型菌体的，这种情况必须要有相关经验老师的带教才能慢慢形成这种辨认能力。

3. 关于镜检筛选标准。

我们现在涂片镜检筛选标准主要参考下表根据上表在whonet中设置“标本质量”数据段，上表1-3类注明“标本污染可能性大，建议重留”，4-5类注明“标本合格”。

但实践中我们发现一些问题：①上表第6类不太清楚其含义，这样的痰到底算不合格还是合格？有时见到白细胞＜10或10-25，且上皮细胞＜10或10-25是否算第6类？②白细胞10-25，上皮细胞＜25标本算合格还是不合格？③有时白细胞＜10而上皮细胞0个，或白细胞10-25而上皮细胞0个是否也为不合格标本？④不知老师哪儿具体怎样报告痰涂片结果的？我基本不用上面这个表！经过这些年的观察，这个表其实根本没有实际意义！我是用更加苛刻的筛选条件进行的：白细胞>25 /HP（高倍镜）且上皮细胞<10/LP(低倍镜)为合格标本；而上皮细胞只要＞25/LP就为不合格！不管白细胞多少。

至于我们的痰涂片报告方式我在上海医院感染控制论坛上发过贴的，你去看看吧！4. 关于痰涂片报告。

对于痰标本，我们目前不管是否申请涂片都先直接涂片并发初步报告（报告细胞计数和细菌）。

实践中有些问题。

①若同时发现白细胞内外都有细菌,如白细胞内G+球菌而白细胞外见G-杆菌和G-球菌，是见到啥报啥（白细胞内外细菌都报），还是只报白细胞内吞噬细菌？只报胞内细菌，胞外细菌不管它。

②是否要报细菌油镜下比例？不要报比例，要知道这是痰培养，不是粪便培养，比例没有实际指导意义，报出去还会误导临床。

③若标本合格而白细胞内未见细菌，是否报细菌？没有看见细菌就直接报告“胞内未见细菌”即可，至于胞外有什么也不必报告——这也是为了避免误导临床。

④若标本筛选不合格而平板上某种细菌优势生长，是否需要鉴定（以前遇到过前几次送检标本不合格，平板上见优势G+球菌，最后一次送检标本合格，证实确实G+球菌为病原菌）。

标本不合格就什么也别做，等他们什么时候合格就什么时候再做，虽然如你所说很多时候下行感染菌其实就是上呼吸道中的某些定植菌，但给你一个上呼吸道标本你却没有办法猜测到底众多细菌中哪种会下行导致感染抑或哪种已经下行导致了感染，可能有时候你猜对了，但很多时候就猜错了，而我敢肯定，按经验进行判断，你一定是错的远远大于蒙对的——我们是搞实验工作的科学工作者，不是相命先生，做事必须要有证据。

⑤标本筛选不合格，是否可以报细菌。

我们现在不管标本是否合格都报细胞数量和细菌，标本不合格注明“标本污染可能性大，建议重留”。

我们这里liyil3老师对于不合格标本只报细胞不报细菌，培养报“正常菌群”。

但我怕不报细菌收费无依据（我们现在涂片是收费的），而且如④所述,是否有这种可能：标本被污染，但病原菌仍能优势生长（不管有没有白细胞吞噬现象）或镜检优势菌和平板上优势菌一致？不鉴定是否会漏掉真正病原菌。

按liyil3版主的办法进行，我认为比较妥当。

对于收费，你可能自己没有吃透收费标准里面的精神，并不一定非要查处细菌才能收细菌涂片的钱。

阴性就不能收费了？哪来的强盗逻辑？不合格标本坚决不能做，这是原则性问题，你不能让步，否则一旦口子一开，你以后的工作要想规范起来就会很困难。

至于你所说的可能其实并不是一种“可能”，这种情况原本就存在，有一部分感染病例属于这种情况，但这是没有使用抗生素的严重感染的“模型”式的感染类型，在缺医少药的过去和一些贫困的边远地区，是常见的，但在我国的住院病人（主要是一些二级以上医院才开设微生物室）中作为微生物室人员的我们绝对没有机会看到的，因为属于这些情况的病人大都是一些症状非常典型的由特殊典型病原体导致的感染，诊断和治疗都相对简单，细菌的耐药性也比较经典，多数病原体没有复杂的获得性耐药，只要不是致死性感染，都能在没有病原学诊断的基础上只通过经验性用药就能取得良好的疗效。

但临床终归是临床，是现实和复杂的，这些你是没有机会见到的，因为这样的感染他们是不会给微生物室送标本的。

其他的标本就都不是这样的情况，需要认真和细致的分析。

而你说的“不鉴定是否会漏掉真正病原菌”的担心其实真正多余的，因为你并不知道你鉴定的细菌是不是真正的病原菌，尤其是在有污染存在的情况下，除了象结核杆菌具有确定的临床意义，和很少的污染几率外，其他细菌存在两种可能，要么是感染，要么就是污染，而且由于定植菌/ 污染菌在种类上远远大于真正的病原菌（这好比在大海中捞针，病原菌就好比是针），不假思索的分离鉴定，可想而知，错误的几率比你碰到真正病原菌的几率是大得多的。

再则，不管是污染、定植还是感染菌，只要你给临床报回去，临床都会当成病原菌，这样的误导带来的负面影响，比起你偶尔碰对病原菌给临床到来的正面效应是大得多的——所以，你的想法给你到来的后果就是得不偿失！尽管我们的确可能会丢失一些遇到真正病原菌的样本，但我们保证了大多数报告的可靠性，这种牺牲是允许的，也是科学的。