DNA酶切及凝胶电泳
酶切注意事项
酶切DNA酶切一般分为质粒直接酶切和PCR产物酶切。
DNA酶切及凝胶电泳一.DNA的限制性内切酶酶切分析限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。
它可分为三类:Ⅰ类和Ⅲ类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化)作用且依赖于ATP的存在。
Ⅰ类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA，而Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA分子,然后从底物上解离。
Ⅱ类由两种酶组成: 一种为限制性内切核酸酶(限制酶),它切割某一特异的核苷酸序列; 另一种为独立的甲基化酶,它修饰同一识别序列。
Ⅱ类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组DNA的基础。
绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为4至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列(如EcoRⅠ识别六个核苷酸序列:5'- G↓AATTC-3'),有少数酶识别更长的序列或简并序列。
Ⅱ类酶切割位点在识别序列中,有的在对称轴处切割,产生平末端的DNA片段(如SmaⅠ:5'-CCC ↓GGG-3');有的切割位点在对称轴一侧,产生带有单链突出末端的DNA片段称粘性未端, 如EcoRⅠ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。
5'…G↓AATTC…3' →5'… G AATTC…3'3'…CTTAA↑G …5' →3'… CTTAA G…5'DNA纯度、缓冲液、温度条件及限制性内切酶本身都会影响限制性内切酶的活性。
大部分限制性内切酶不受RNA或单链DNA 的影响。
当微量的污染物进入限制性内切酶贮存液中时,会影响其进一步使用,因此在吸取限制性内切酶时,每次都要用新的吸管头。
如果采用两种限制性内切酶,必须要注意分别提供各自的最适盐浓度。
若两者可用同一缓冲液,则可同时水解。
若需要不同的盐浓度,则低盐浓度的限制性内切酶必须首先使用,随后调节盐浓度,再用高盐浓度的限制性内切酶水解。
质粒DNA的酶切鉴定原理
质粒DNA的酶切鉴定原理质粒DNA的酶切鉴定是一种常用的实验方法，用于确定质粒DNA的大小和纯度。
酶切鉴定是通过用特定的限制性内切酶切割质粒DNA，然后利用琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，并通过染色或脱染观察分离结果。
限制性内切酶是一类特殊的酶，它们能够识别DNA的特定序列，并在该序列上切割DNA分子，产生特定的DNA片段。
酶切鉴定的原理主要包括限制性内切酶的选择、质粒DNA酶切、琼脂糖凝胶电泳和染色观察。
首先，选择适当的限制性内切酶。
限制性内切酶是依据其能够识别的特定DNA 序列而命名的。
在酶切鉴定中，通常使用两个不同的限制性内切酶，因为单个限制性内切酶的选择性有限。
选择限制性内切酶时需考虑酶切位点的位置和数量，以及酶切位点的特异性和完整性。
其次，进行质粒酶切。
通常将质粒DNA与适当的缓冲液和限制性内切酶混合，反应一段时间。
反应结束后，通过热灭活限制性内切酶，停止酶切反应。
酶切反应完成后，会得到经限制性内切酶切割的DNA片段。
然后，进行琼脂糖凝胶电泳分离。
琼脂糖凝胶电泳是一种常用的DNA分子量测定方法。
它通过将DNA样品加入琼脂糖凝胶槽中，在电场作用下，DNA片段按照大小被分离。
较小的DNA片段在电场中移动更快，较大的DNA片段移动较慢。
通过检测琼脂糖凝胶上的DNA迁移距离，可以获得质粒DNA的分子量信息。
最后，通过染色观察和图像分析来确定质粒DNA的大小和纯度。
琼脂糖凝胶电泳结束后，通常需要染色来显示DNA片段。
常见的染色剂有溴化乙锭和SYBR Green等。
经过染色的琼脂糖凝胶可以进行观察和记录，并通过分析软件对分离的DNA片段进行测量和分析，得到质粒DNA的大小和纯度信息。
总之，质粒DNA酶切鉴定是通过限制性内切酶切割质粒DNA，然后通过琼脂糖凝胶电泳分离和染色观察来确定质粒DNA的大小和纯度。
这种方法简便易行，可用于快速鉴定质粒DNA的酶切效果和测定其分子量。
DNA酶切电泳
DNA酶切及电泳陈瑞州 201110424108一、实验目的1.掌握DNA酶切的基本原理和方法；2.学习和掌握琼脂糖点样的基本方法；3.学习判断DNA大小的方法。
二、实验原理限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性内切酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上，并切割双链DNA。
通过将酶切后的DNA片段和标准的已知酶切后片段长度的Maker一起跑电泳后，即可得到条带清晰的电泳图谱，从而推测出各DNA片段的大小。
三、实验材料λDNA；EcoR I酶；HindIII酶；BamHI酶；酶切缓冲液；琼脂糖凝胶；ddH2O；buffer四、实验步骤1.DNA酶切反应HindIII酶 2ul EcoR I酶 2ul BamHI酶 2ul ○1 10Xbuffer 2ul（M）○2 10Xbuffer 2ul（H）○310Xbuffer 2ul（H）λDNA 6ul λDNA 6ul λDNA 6ulddH2O 10ul ddH2O 10ul ddH2O 10ulEcoR I酶 1.5ulBamHI酶 1.5ul○4 10Xbuffer 2ul（H）λDNA 6ulddH2O 9ul将灭菌好的离心管编号，用微量移液枪分别加入上述四种反应体系中的试剂，用微量离心机甩一下，使液体集中在管底。
混匀反应体系后，将离心管置于试管架中，于37℃下酶切2-3小时。
2、琼脂糖凝胶电泳用微量移液枪向酶切完全后的上述四个体系的管中各加入2ul loading buffer ，吸取15ul的上述四样液点样，另外两边各用λDNA Marker点样。
于100V下跑电泳30-60分钟，使DNA片段大概跑过凝胶一半左右即可。
于紫外灯下拍照记录。
五、结果分析。
质粒DNA酶切及琼脂糖凝胶电泳分离鉴定
质粒DNA酶切及琼脂糖凝胶电泳分离鉴定组员：孙慜、孙苏、谢拓燕、郑倩倩、王佳玲【实验目的】1、了解DNA的限制性内切酶酶切的基本原理2、学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术【实验原理】①DNA的限制性内切酶酶切原理（1）限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA，但不能切单链DNA。
它可分为三类:I类和III类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化)作用且依赖于ATP的存在。
III类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA，而Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA分子,然后从底物上解离。
Ⅱ类由两种酶组成: 一种为限制性内切核酸酶(限制酶),它切割某一特异的核苷酸序列; 另一种为独立的甲基化酶,它修饰同一识别序列。
Ⅱ类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组DNA的基础。
绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为4至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列(如EcoRⅠ识别六个核苷酸序列:5‘- G↓AATTC-3‘), 有少数酶识别更长的序列或简并序列。
Ⅱ类酶切割位点在识别序列中, 有的在对称轴处切割, 产生平末端的DNA片段(如SmaⅠ:5‘-CCC↓GGG-3‘); 有的切割位点在对称轴一侧, 产生带有单链突出末端的DNA片段称粘性未端, 如EcoRⅠ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。
5‘…G↓AATTC…3‘→5‘… G AATTC…3‘3‘…CTTAA↑G …5‘→3‘… CTTAA G…5‘DNA限制性内切酶酶切图谱又称DNA的物理图谱，它由一系列位置确定的多种限制性内切酶酶切位点组成，以直线或环状图式表示。
在DNA序列分析、基因组的功能图谱绘制、DNA的无性繁殖、基因文库的构建等工作中，建立限制性内切酶图谱都是不可缺少的环节，近年来发展起来的RFLP(限制性片段长度多态性)技术更是建立在它的基础上。
②琼脂糖凝胶电泳条带的观察：（2）通过观察示踪染料的迁移距离可以判断DNA的迁移距离。
DNA限制性酶切及凝胶电泳实验原理及方法
DNA限制性酶切及凝胶电泳实验原理及方法一、电泳前准备准备内容作用 1.刷干净电泳制胶的梳子，板子，槽子，蒸馏水洗净防止不必要的重复污染，减少外来的污染。
梳子干净晾干有利于梳孔的形成。
2.检查电泳槽，根据情况更换buffer 排除电泳槽的电极接触不良，确保buffer的缓冲能力，减少污染。
3.根据DNA的分离范围选择合适的胶浓度并记录达到较好的分离效果，防止样过快跑出胶或者是过慢浪费时间。
4.计算agarose的用量和制胶 buffer的用量记录，胶实验记录备查最终越薄越好。
二、制胶步骤注意事项1.称量agarose和buffer Buffer不要用成H2O，称量相对准确2.融胶，加热到胶产生大量的气泡时，拿出摇匀，继非常热，小心烫手，另外注意不要加热过度使胶冲出续加热到完全溶解，拿出摇匀，再加热到沸腾。
瓶子。
因此注意选择起码为胶体积2倍以上的瓶子。
保证胶混匀和完全溶解，减少可能因此引起的胶中孔径不均匀影响分离效果。
3.倒胶，可用水浴的办法使胶冷却到60度左右，即手制胶的桌面相对水平。
倒胶时尽量减少气泡的产生。
可以握住瓶子的温度，沿着制胶板的一侧，缓缓地一EB如果在制胶时加入，在60度左右时加入，使终浓次性倒入。
梳子最好是预先放好并固定的，注意梳孔度为0.5ug/ml。
不宜过低，染色成像不明显；不宜过的体积能点的下所有的样。
用枪头赶掉气泡。
高，导致背景太深。
摇匀要沿着瓶壁摇动，尽量减少气泡产生的可能性。
高浓度胶例如2%以上的EB很难摇匀，而且凝的速度也相对快，强烈建议跑完胶之后再用EB染色。
4.室温凝胶30分钟过程中不要碰到梳子，尽量保持胶的位置不移动。
时间不宜过久，导致胶干燥变形；不宜过短，影响胶内部孔径形成。
5.拔梳子，放入电泳槽。
缓缓地将梳子垂直从梳孔拔出，尽可能使梳子是同时从各个胶孔拔出的。
暂时不用的胶最好放入电泳槽电泳液中浸泡。
电泳液要浸没胶1mm。
三、上样电泳步骤注意事项 1.样品中加入loading buffer使其终浓度为1 X，混匀Loading buffer浓度不宜过低，点样时样品不能很好的沉在胶孔里；不宜过高，电泳时容易形成带形的变形。
DNA的酶切和琼脂糖凝胶电泳实验原理及步骤
实验6 DNA的酶切和琼脂糖凝胶电泳目的要求（1）掌握琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理和方法。
（2）学习利用琼脂糖凝胶电泳方法测定DNA片段大小。
（3）学习有关建立DNA限制性内切酶图谱的基本技术。
原理DNA分子在碱性环境中（pH8.3缓冲液）带负电荷，外加电场作用下，向正极泳动。
不同的DNA片段由于其电荷、分子量大小及构型的不同，在电脉时的泳动速率就不同，从而可以区分出不同的区带，电泳后经溴乙锭（菲啶溴红）染色，在波长254nm紫外光照射下，DNA显橙红色荧光。
琼脂糖凝胶电泳所需DNA样品量仅为0.5—1μg，超薄型平板琼脂糖凝胶电泳所需DNA 可低于0.5μg。
溴乙锭检测DNA，灵敏度很高，10ng（10-9g）或更少的DNA即可检出。
DNA在凝胶中的迁移距离（迁移率）与它的大小（分子量）的对数成反比。
将未知DNA 的迁移距离与已知分子大小的DNA标准物的电泳迁移距离进行比较，即可计算出未知DNA 片段的大小。
质粒DNA分子量一般在106—107范围内，如质粒pBR322的分子量为2.8×106。
质粒DNA在细胞内存在可以有3种形式；共价闭环(ccc DNA)、线形DNA和开环的双链环状（opDNA）。
电泳时，同一质粒超螺旋DNA的泳动速度比开环和线形DNA的泳动速度为快。
提取制备的质粒DNA中，常存在超螺旋和开环DNA，在凝胶板上即可显示出2条迁移位置不同的荧光条带（见图34.1）。
本实验采用限制性内切酶Hind Ⅲ或EcoR Ⅰ酶解λDNA的片段为标准物，建立其酶切图谱，同时以酶解各片段的分子量为纵坐标，它们的迁移距离为横坐标，在半对数坐标纸上，连接各点绘帛出测定DNA分子量的标准曲线。
共价闭环质粒pBR322 DNA只有一个EcoR Ⅰ酶切位点，酶解后成为一条完整线状DNA，通过琼脂糖凝胶电泳，测量酶解后线型DNA的迁移距离，可以直接在分子量标准曲线上得出其分子大小。
同时通过与标准pBR322 EcoR Ⅰ酶切图谱的比较分析，可以对提取质粒DNA进行鉴定。
dna酶切实验报告
dna酶切实验报告DNA 酶切实验报告一、实验目的本次 DNA 酶切实验的目的在于掌握 DNA 酶切的基本原理和操作方法，了解限制性内切酶的特性和作用，通过对特定 DNA 片段的酶切，为后续的分子生物学实验如 DNA 连接、克隆和基因分析等提供基础。
二、实验原理DNA 酶切是一种分子生物学技术，基于限制性内切酶对特定 DNA序列的识别和切割作用。
限制性内切酶能够识别双链 DNA 分子中特定的碱基序列（通常为 4 8 个碱基对），并在特定的位点进行切割，产生具有粘性末端或平末端的 DNA 片段。
不同的限制性内切酶具有不同的识别序列和切割方式。
在本实验中，我们使用了具体限制性内切酶名称，其识别序列为具体序列，切割后产生粘性末端/平末端。
三、实验材料与设备1、实验材料待酶切的 DNA 样品（如质粒 DNA 或基因组 DNA）限制性内切酶酶的名称及来源酶切缓冲液琼脂糖上样缓冲液DNA 分子量标准2、实验设备移液器恒温培养箱电泳仪凝胶成像系统四、实验步骤1、准备酶切反应体系按照实验要求，在无菌的离心管中依次加入适量的 DNA 样品、限制性内切酶、酶切缓冲液和无菌去离子水，使总体积达到具体体积。
轻轻混匀反应体系，短暂离心使液体集中在管底。
2、酶切反应将离心管放入恒温培养箱中，在设定温度下孵育反应时间。
3、终止酶切反应取出离心管，加入适量的上样缓冲液终止反应。
4、琼脂糖凝胶电泳制备浓度的琼脂糖凝胶，在电泳槽中加入电泳缓冲液。
将酶切产物与 DNA 分子量标准分别加入凝胶的加样孔中。
接通电源，以电压进行电泳，直至溴酚蓝指示剂迁移到适当位置。
5、凝胶成像观察电泳结束后，将凝胶放入凝胶成像系统中观察并拍照，记录酶切结果。
五、实验结果与分析1、电泳结果通过凝胶成像系统观察到清晰的 DNA 条带。
DNA 分子量标准呈现出预期的条带分布，用于估计酶切产物的大小。
酶切后的 DNA 样品显示出与预期相符的片段大小，表明酶切反应成功。
《基因工程与细胞工程》质粒DNA的限制性酶切及琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切图谱实验
《基因工程与细胞工程》质粒DNA的限制性酶切及琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切图谱实验【实验目的】1、掌握实用的分子生物学基本操作技术；2、提高处理DNA样品的操作技能；3、学会使用限制性内切酶对DNA样品进行酶切；4、学会配制琼脂糖凝胶；5、学会使用电泳技术分析和鉴定DNA分子。
【实验原理】1、质粒DNA的限制性酶切DNA的酶法操作是DNA重组技术中一项最常用的工具。
特别是一系列限制性内切核酸酶的使用，能够在特异性位点切割DNA，对从分子水平上认识基因的结构与功能和进行重组DNA技术研究是非常有用的。
限制性内切酶来源于细菌，能够在特异性的目标序列中（即限制性酶切位点）切割双链DNA，从而产生特定的DNA片段（即限制性酶切片段）。
内切酶是细菌限制与修饰体系中的一员，能够使细菌细胞免受外源性DNA的侵害，即通过切割噬菌体DNA中的特异性位点来限制细菌噬菌体的繁殖，从而抑制噬菌体对细菌细胞内的入侵。
细菌通过修饰限制酶的识别位点来防止限制酶破坏其自身的DNA，通常是利用对识别位点中1个碱基的甲基化修饰来实现的。
历年来，从细菌细胞内分离纯化的限制性内切酶的种类在不断增加，并越来越多的被分子生物学家应用到DNA的体外操作中。
每种限制酶都能识别1段特异的DNA序列，其中最常见的是长度为4-6 bp的回文序列（反向重复序列）。
同时，不同种类的限制酶在识别的切割位点是不同的，有些可能是在识别位点的中间切开，产生平末端（钝末端）；而另一些限制酶可能是将识别位点错位切开，生成5’或3’突出末端（黏性末端）。
表2列举了本实验中所使用的2种限制酶的识别位点和切割位点。
表2 2种限制酶的识别位点和切割位点注：↓或↑：表示酶切位点。
2、DNA限制性内切酶酶切图谱（1）图谱简介DNA限制性内切酶酶切图谱，又称DNA的物理图谱，它由一系列位置确定的多种限制性内切酶酶切位点组成，以直线或环状图式表示。
在DNA序列分析、基因组的功能图谱绘制、DNA的无性繁殖、基因文库的构建等工作中，建立限制性内切酶图谱都是不可缺少的环节，近年来发展起来的RFLP（限制性片段长度多态性）技术更是建立在它的基础上。
质粒DNA的限制性内切酶酶切及琼脂糖凝胶电泳分析
质粒DNA的限制性内切酶酶切及琼脂糖凝胶电泳分析摘要限制性内切酶发现于某些大肠杆菌体内，能够“限制”噬菌体对其感染并帮助将已殖入的噬菌体序列移除，可以识别双链DNA上特异序列（限制性位点）并酶切。
限制酶极大地促进了分子生物学、基因工程与遗传工程领域的进展。
[1]本实验通过对大肠杆菌质粒DNA的酶切处理，经琼脂糖凝胶电泳分离酶切片段，与未酶切的质粒DNA比较，分析酶切结果。
同时，本次电泳还鉴定了提取纯化的大肠杆菌基因组DNA的纯度，以及大肠杆菌HSP70基因的PCR产物。
关键词限制性内切酶；琼脂糖凝胶电泳引言自从从嗜血杆菌(Haemophilus influenza)中分离到第一种限制性内切酶---HindⅢ,[2]人们开始意识到限制性内切酶的巨大应用前景。
Daniel Nathans,Werner Arber和Hamilton O. Smith在1978年即因限制性内切酶的发现和在分子遗传学的应用被授予诺贝尔生理与医学奖。
人们将限制性内切酶应用到DNA重组技术中，在用基因重组型大肠杆菌大规模生产人胰岛素获得巨大的成功。
现在限制性酶切与PCR一样成为分子生物学中最常用的实验手段之一。
限制性内切酶被分成四种：Types I,II,III和IV。
Types I酶切位点距离识别位点较远，是具有限制性内切和甲基化修饰的多功能酶，作用时需要ATP和硫代腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl-L-methionine），如EcoB,EcoK。
Types II酶切位点位于识别位点之中会较近距离，只具有限制性内切的单功能酶，作用时需要Mg2+，如EcoRI,HindIII。
Types III酶切位点距离识别位点较近，具有限制性内切活性，也被发现是修饰性甲基化酶复合物的一部分。
作用时需要ATP（但不水解ATP）和硫代腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl-L-methionine）刺激反应，如EcoPI, HinfIII。
质粒的酶切琼脂糖凝胶电泳分离DNA
6. 室温下约30-45分钟后，琼脂糖溶液完全凝固，小心 垂直拔出梳子和挡板，清除碎胶，将凝胶放入电泳槽 中。
实验步骤
酶切体系
调制酶切体系如下: (共 20μL)
无菌水 6μL，
质粒
10 μL
Buffer K 2μL,
EcoR I 1μL,
BamH I 1 μL
37℃酶切1.5小时。
琼脂糖凝胶制备
1. 洗净电泳槽、制胶槽、梳子、挡板，晾干。 2. 插好挡板、梳子。 3. 根据实验所需称取0.4克琼脂糖，放入制胶
11. 等溴酚蓝泳动至凝胶前沿后，将电压（或电 流）回零，关闭电源，停止电泳。
12. 取出凝胶，在紫外观测仪上观察电泳结果。
13.. 根据需要切下DNA条带，放入1.5ml Ep管中， 放于4℃保存，以中一般为三条带，最前面 的条带为超螺旋构型，中间为线型，最后为单链 有缺刻的构型。
pBC SK map
它的原理是溴化乙锭在紫外光照射下能发射 荧光，当DNA样品在琼脂糖凝胶中从负极向 正极泳动时，溴化乙锭从正极向负极移动， 这样溴化乙锭分子就会嵌入DNA分子中形成 络合物，使DNA在紫外光下发射很强的荧光。 在溴化乙锭足够的情况下，荧光的强度正比 于DNA的含量，这样就可以检测DNA的浓度。
如提取过程中有机械损伤，可能在胶上出现弥散。 影响RE(限制性内切酶)活性的主要因素：DNA的
纯度；DNA的甲基化程度；温度；缓冲液成分 （DDT，BSA）等。
使用3 mg的DNA Marker DL 2,000（500 ng/条带）进行1% 的琼脂糖凝胶电泳后，各DNA条带自上至下分别为2kb，1Kb， 750bp，500bp，250bp，100bp。
生化实验五 DNA限制性酶切和琼脂糖凝胶电泳
加样缓冲液
0.25%溴酚蓝（深蓝色，300bp) 0.25% xylene cyanlo FF （天蓝色，2000bp） 40%蔗糖
EB（溴化乙锭）染色液（有毒）
0.5ug /ml，用水配制
溴化乙锭(ethidium bromide，EB)
每一种限制性内切酶都有特定的反应条件 pH范围：7.5~8.0
缓冲液组份: Tris(三羟甲基氨基甲烷） NaCl、MgCl2、 巯基乙醇
温度：37℃
琼脂糖凝胶电泳
是一种简便、快速的分离纯化 和鉴定核酸的方法。
琼脂糖是一种线性多糖聚合 物。琼脂糖粉末加热到熔点后冷 却凝固,会形成良好的电泳介质。
是一种扁平分子荧光染料，可嵌入核酸 的碱基对之间，在紫外线激发下，发出 桔红色荧光。
电泳结束后，将凝胶浸入 0.5ug/ml的EB 溶液中染色10min。在紫外光照射下可见 核酸电泳带，DNA量一般>5ng。
操作步骤
酶切反应
反应体系
λ－DNA 10 x Buffer Hind III H2O
电泳
在电场的作用下，在某种支持介 质上，将一个混合物分离成若干条 区
琼脂糖浓度(%)
0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 12.0
线型DNA分离范围(Kb)
5～60 1～20 0.8～10 0.5～7 0.9～6 0.2～3 0.1～2
试剂
TBE电泳缓冲液
Sample 1自提DNA 5ul+2ul Loading Dye Sample 2自提DNA酶切液20ul+4ul Loading Dye Sample 3λ-DNA 5ul+2ul Loading Dye Sample 4λ-DNA 酶切液20ul+4ul Loading Dye
实验一二重组质粒DNA提取双酶切鉴定凝胶电泳紫外分光法
高酸 中和 至中 性 纯化
变性的染色体DNA与变性的蛋白质以及细胞碎片凝聚 成网络状大分子不溶性沉淀物
质粒DNA又恢复天然构型，溶解在上清液中 RNA酶消化除去RNA，并用酚抽提法除去残留的蛋白质
3.2 主要试剂及作用
溶液Ⅰ：由葡萄糖、EDTA、Tris•HCl组成.(保护、缓冲)
①
葡萄糖的作用是增加溶液的粘度,减少抽提过程中的 机械
34
1.1 影响DNA在凝胶中迁移速率的因素
1 DNA分子的大小 2 构象 3 凝胶浓度 4 电压 5 缓冲液
1.2 不同浓度琼脂糖的凝胶分离范围
琼脂糖浓度（％，W/ V )
DNA分子的有效分离范围（kb)
0.7 0.9 1.2 1.5 2.0
0.8-10 0.5-7 0.4-6 0.2-3 0.1-2
4.室温凝胶30分钟
5.拔梳子，放入电泳槽。
缓缓地将梳子垂直从梳孔拔出，尽可能使梳子是 同时从各个胶孔拔出的。暂时不用的胶最好放入 电泳槽电泳液中浸泡。电泳液要浸没胶1mm。
三、上样电泳
注意事项 步骤 1.样品中加入loading buffer使其终浓度为 Loading buffer浓度不宜过低，点样时样 1 X，混匀 品不能很好的沉在胶孔里；不宜过高， 电泳时容易形成带形的变形。注意混匀。 2.点样 沿着胶孔的边缘匀速加入。尽量避免碰 坏胶孔。枪头不要吸过多的气泡，拔起 时不要过猛带出样品。每点一个样完， 吸取buffer洗枪头，避免样品混杂。如果 是有特殊要求，例如回收，强烈建议每 点一个样换一次枪头。加样的速度当然 是越快越好，注意保证质量。点样的量 不要太大，一方面是体积不要太大，溢 出污染邻位样品；一方面两不要太大， 容易导致脱尾和模糊不清。 胶孔与电极成水平状态，防止样品跑歪。 跑胶期间不时回来看看，防止样品跑出 胶等意外发生。
dna凝胶电泳技术
dna凝胶电泳技术
DNA凝胶电泳技术是一种基于分子大小和电荷对大分子（如DNA、RNA和蛋白质）及其片段进行分离和分析的方法。
以下是关于DNA凝胶电泳技术的详细解释：
1原理：DNA凝胶电泳利用电场使带负电荷的DNA分子通过凝胶基质移动。
DNA分子的大小和形状影响其迁移速率，因此不同大小的DNA片段在凝胶中会以不同的速度移动，从而实现分离。
2类型：
•聚丙烯酰胺凝胶电泳：适合分离1kb以下的片段，最高分辨率可达1bp。
常用于引物的纯化，也称PAGE纯化。
•琼脂糖凝胶电泳：可分离的DNA片段大小因胶浓度的不同而异，例如，胶浓度为0.5~0.6%的凝胶可以分离的DNA片段范围为20bp~50kb。
该方法操作简便、快速，因此在基因工程中常用。
3应用：
•DNA制备及浓度测定：通过凝胶电泳可以评估DNA样品的纯度和浓度。
•目的DNA片段的分离：凝胶电泳可用于从混合物中分离出特定的DNA片段。
•重组子的酶切鉴定：凝胶电泳可用于验证重组DNA分子的大小和结构。
•细胞DNA损伤检测：通过凝胶电泳可以检测细胞DNA在特定条件下的损伤程度，如碱性电泳液中的DNA双链解螺旋和断裂。
总之，DNA凝胶电泳技术在分子生物学、遗传学、生物技术等领域具有广泛的应用价值。
如需了解更多信息，建议查阅相关文献或咨询专业人士。
质粒DNA的酶切和琼脂糖凝胶电泳鉴定
质粒DNA的酶切和琼脂糖凝胶电泳鉴定[实验原理]限制性内切酶识别短的DNA序列并在识别序列内或旁侧特异性切割双链DNA。
对环状DNA有多少切口，就能产生多少个酶解片段，因此鉴定酶切后的片段在电泳凝胶中的区带数，就可以推断酶切口的数目，从片段的迁移率可以大致判断酶切片段大小的差别。
DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。
DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。
由于糖—磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。
在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。
具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。
DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。
凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子。
如上次实验提取的质粒，有3种构型：超螺旋的共价闭合环状质粒DNA(covalently closed circular DNA，简称CCCDNA)，开环质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNA 1条链断裂，(open circular DNA，简称OCDNA)，线状质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNA 2条链发生断裂(linear DNA，简称L DNA)。
这3种构型的质粒DNA分子在凝胶电泳中的迁移率不同。
因此电泳后呈3条带，超螺旋质粒DNA泳动最快，其次为线状DNA，最慢的为开环质粒DNA。
[仪器、材料与试剂]（一）仪器与材料恒温水浴槽、电泳仪、电泳槽、紫外线透射仪、移液枪、质粒、HindI II酶、EcoRI酶(二) 试剂1 000 mL 5xTBE：Tris 54 g硼酸27.5 g 0.5 mol／L EDTA 20 mL（pH 8.0）凝胶加样缓冲液(6x)：溴酚蓝0.25％蔗糖40％琼脂糖溴化乙锭溶液(EB) 0.5ug／mL[实验步骤](一) 酶切取5uLDNA溶液，加1uL酶切缓冲液，EcoRI酶1uL(2U)，无菌水补至总体积10uL，37保温3h，加凝胶上样缓冲液(6X)2uL，准备下个实验进行电泳，分析质粒DNA的限制性酶切图谱。
DNA的酶切及电泳检测
DNA的酶切及电泳检测酶切体系：酶切应使用0.5ml灭菌炮弹和灭菌枪头（一般为10ul，也可以适当增加体系量）10ul体系：①DNA含量在0.5ug；②一般酶用0.25ul（理论上1ug DNA~1U ase，实际上，为了便于完全切割，常用1ugDNA~2-4U ase；一般1ul ase为10U, 按此计算）；③buffer 1×用1ul，0.5×用0.5ul（有时会用到1×BSA）；④最后用水补齐。
在配置相同的酶切体系时，可以先总配再分装。
不同的酶有不同的特性，我们平常使用的酶一般为37℃，1h。
双酶切体系：①若两个酶用同一种buffer（须为同一家公司），可一起酶切，至少1h。
②若两个酶不同buffer，最好分开切。
注意：●酶程太大，>100ug/ng DNA或PH>8.0，会导致星活性。
●BSA，牛血清白蛋白。
●Pr, EDTA, 酚，氯仿，SDS, 乙醇都会影响酶活。
可以通过纯化，增加酶量，增加酶切的时间等克服。
配胶：一般配置1%，20ml的琼脂糖凝胶。
0.2g琼脂糖+20ml TAE/TBE→min火（比小火还小两个点）加热2-3min液体至透明→晾至55℃（不烫手即可）→加入0.5ul EB（小分子插入DNA中，紫外显红色，积累性致癌物）→倒入叉好梳子的板内→待胶冷却凝固电泳：每个体系加入10%（1ul）的溴酚兰，混合后点入点样孔中→每块胶中点入合适的marker 以确定每个样品DNA的大小（一般10ul的marker亮度即为0.5ug DNA亮度）→80V 20min 左右溴酚兰跑到全胶的4/5左右。
（溴酚兰所处位置约为400bp）。
PCR产物的酶切及琼脂糖凝胶电泳回收
PCR产物的酶切及琼脂糖凝胶电泳回收限制性内切核酸酶消化DNA限制性内切核酸酶（restriction enzyme) 是一类识别DNA上3-8个特定核苷酸序列并产生切割反应的内切核酸酶(endonuclease)的总称。
在基因操作中，这些酶作为“剪刀”对DNA起剪切作用，是分子生物学研究中不可缺少的酶之一。
限制内切酶切出的三种断口在酶切实验中：如果用同一种酶切割载体和插入DNA两者能正确连接，但不能确定方向。
如果用同的限制酶切割，所得的单链突起能互补，则两者能正确连接。
但也不能确定其方向。
若限制酶切割所得的片段是平末端，虽能连接，但效率低，而且不能确定其方向。
用两种不同的限制酶共同切割载体和插入片断，而且所得两末端结构不同，连接后就能确定其方向。
因此，运用两种不同的限制酶的模式被广泛应用。
在我们今天的实验中，用到两种限制性酶分别是BamH I和Hind III，这两种酶切割后产生的片段都具有粘性末端，可以保证酶切产物与载体正确的连接。
酶切体系PCR产物0.5μg Buffer K（10X）5μlddH2O加至48μlBamHⅠ（20U/ul）1μlHind III（20U/ul）1μl 总体积50μl将酶切体系按顺序加好后柔和混匀，放入已预热的37℃的水浴锅（或37℃培养箱）中，使反应体系在这个温度下进行酶切。
在酶切实验中需要注意的事项1 反应Buffer2 酶切位点的保护碱基3 酶切反应温度4 酶切体系的体积每一种酶都具有相应的反应缓冲液，反应缓冲液可能相同也可能不同。
一般同一公司的酶的缓冲液可以通用，不同公司的一般不相同。
若不同酶使用相同的缓冲液，则可同时加入，若使用不同的缓冲液，则只能在第一个酶切完成后，进行酚抽提，乙醇沉淀，再进行另一个酶的消化。
保护碱基限制性内切酶的酶切位点两侧的保护碱基是在设计PCR的引物时加入的。
BamHⅠ的保护碱基ATT GGATCCATGGCGAATTCCGGCGAAGA Hind III的保护碱基ACC AAGCTTGATGGTGGAAGAAGGAGC酶切反应温度３７°C对于大多数酶来说是最佳反应温度。
实验二质粒的酶切和琼脂糖凝胶电泳检测
评估酶切效率，判断酶切是否完全，以及酶切片段的产量是否符 合预期。
酶切产物纯度检测
通过电泳图谱分析，判断酶切产物是否纯净，是否存在其他杂质 或非特异性产物。
琼脂糖凝胶电泳检测结果分析
跑胶效果评估
评估凝胶的均匀性和完整性，判断电泳是否正常进行。
染色效果分析
判断染料的染色效果，以及是否能够清晰地显示出各条带的位置和 大小。
掌握琼脂糖凝胶电泳 的工作原理和分离机 制。
了解琼脂糖凝胶电泳 的荧光染料和检测方 法。
了解电泳过程中 DNA分子的迁移速 率与分子量的关系。
掌握琼脂糖凝胶电泳检测操作
学会配制琼脂糖凝胶和电泳缓冲液。
学会分析电泳结果，判断酶切效果。
掌握点样、电泳和染ຫໍສະໝຸດ 等操作步骤。02实验原理
质粒酶切原理
01
02
实验安全须知
实验过程中应佩戴一次性手套 、口罩和实验服，避免直接接
触试剂和样品。
酶切反应中使用的限制性内切 酶具有生物活性，应避免吸入
和直接接触皮肤。
琼脂糖凝胶电泳检测时，应注 意紫外线对人体的伤害，避免 长时间直接照射。
实验结束后，应按照实验室规 定正确处理废物，确保环境安 全。
实验拓展与思考
实验二质粒的酶切和琼脂糖凝胶电 泳检测
目录
• 实验目的 • 实验原理 • 实验步骤 • 结果分析 • 注意事项与实验拓展
01
实验目的
掌握质粒的酶切技术
01
了解限制性内切酶的种类和作用机制。
02
掌握质粒的酶切反应条件和操作步骤。
学会使用琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物。
03
了解琼脂糖凝胶电泳检测原理
条带识别与对比
质粒DNA的酶切鉴定及琼脂糖凝胶电泳
4) 限制性核酸内切酶的命名法
❖ 用属名的头一个字母和种名的头两个字母 表示寄主菌的物种名称，如E. coli 用Eco表 示，所以用斜体字。
❖ 用一个字母代表菌株或型，如流感嗜血菌 Rd菌株用d，即Hind。
❖ 如果一种特殊的寄主菌株，具有几个不同 的限制与修饰体，则以罗马数字表示，如 HindⅠ, HindⅡ，HindⅢ等。
质粒量 缓冲液 EcoR1 Xho1
H2O 总体积
（ng） (μl)* （μl） （μl） (μl) （μl）
I 200
2
0
0 17-19 20
II 200
2
0.5
0 15-17 20
III 200
2
0.5 0.5 14-16 20
* 缓冲液随不同的酶而不同,本实验用 H buffer。
置于37℃水浴酶解0.5-1小时。酶解完成后，分 别加入10l 3倍的上样缓冲液, 然后各取15l进 行电泳分析。
2) 琼脂糖凝胶的制备
琼脂糖凝胶液的制备：称取0.8g琼脂糖， 置于三角瓶中，加入100ml TBE或TAE 工作液，瓶口倒扣一个小烧杯等，将该 三角瓶置于微波炉加直至琼脂溶解。
3）胶板的制备
取有机玻璃内槽，洗净、晾干；取纸胶 条(宽约1cm)，将有机玻璃内槽置于一 水平位置模具上，放好梳子。
将冷却至65℃左右的琼脂糖凝胶液，小 心地倒在有机玻璃内槽上，控制灌胶速 度和量，使胶液缓慢地展开，直到在整 个有机玻璃板表面形成均匀的胶层。
片段 1 2 3 4 5 6 7 8 9
10a 10b
碱基对 10,002
8,001 6,001 5,001 4,001 3,001 2,000 1,500 1,000
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4.操作步骤 (1) 称取 1g 琼脂糖凝胶干粉，加 100ml 1*TAE 电泳缓冲 液，加热使琼脂糖熔化均匀，取出后室温冷却至 50~60℃； （制作凝胶液）
(2) 将胶倒入制胶槽中，并插入样品梳，待充分凝固后拔 出样品梳；（插梳子）
1. 寄主控制的限制与修饰现象
限制与修饰系统是细胞的一种防卫手段。
限制性核酸内切酶是由细菌产生的，其生理意 义是提高自身的防御能力。限制酶限制外源DNA存 在于自身细胞内，但合成这种酶的细胞自身的DNA 不受影响，因为这种细胞还合成了一种修饰酶，对 自身的DNA进行了修饰，限制性酶对修饰过的DNA 不能起作用。这种现象被称为寄主控制的限制与修 饰现象。
(3) 将凝胶板放入电泳槽中，加入 1*TAE 电泳缓冲液，使 液面略高于凝胶 1*TAE电泳缓冲液；（加电泳缓冲液） (4) 5μl DNA 样品加 1μl 6*凝胶加样缓冲液，搅拌均匀后全 部加入凝胶板的样品孔中；在另一加样孔中加 5μl 已知片 段大小的 DNA 标准溶液；（上样） (5) 打开电源开关，电压 100V，电泳约 30~40 分钟； （通电，跑电泳）
DAN酶切及凝胶电泳
DNA限制性内切酶的酶切分析
限制性核酸内切酶：是一类能识别双链DNA分子 特定的核甘酸序列，并在每条链中特定部位的两个 核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割的一类DNA水解酶， 是体外剪切基因片段的重要工具，常常与核酸聚合 酶、连接酶以及末端修饰酶等一起称为工具酶。
限制性核算内切酶的相关知识： 1. 寄主控制的限制与修饰现象 2. 核酸限制性内切酶的类型及基本特性 3. 同裂酶和同尾酶 4. 影响核酸限制性内切酶活性的因素
琼脂糖凝胶电泳
琼脂电泳是用琼脂糖或优质琼脂粉作支持物的一 种电泳方法。该法主要用于研究核酸等大分子物质， 是分子生物学中不可缺少的研究手段之一。
用琼脂糖胶分离双链 DNA时，其迁移率大小，主 要与样品的相对分子质量有关，而与核酸的一级结构 一级碱基的组成无关。利用琼脂糖电泳分离和分析蛋 白质和核酸的基本原理是电荷效应及分子筛效应。
分类：按照分离原理的不同，可分为：区带电 泳、移界电泳、等速电泳、等电聚焦电泳
应用：生物学上的可移动大分子，如氨基酸、 多肽、蛋白质及核酸等，具有可以电离的基团，在 具有一定pH值的溶液中，能够形成带电荷的阳离 子和阴离子，通过电泳方法可以将处于同一体系的 不同组分分开。
凝胶电泳技术
凝胶电泳是以各种具有网状多孔结构的凝胶为支 持物的电泳技术。同时，凝胶电泳具有电泳和分子 筛的双重作用，有很高的分辨能力。凝胶电泳的支 持介质一般有以下几种： （1）淀粉凝胶
Ⅱ型：限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序， 并在该顺序内的固定位置上切割双链。
这类限制酶识别的专一核苷酸顺序常见的是4 至6个核苷酸，其识别顺序是一个回文对称顺序， 即有一个中心对称轴。
Ⅱ型酶的切割有两种方式，分别生成平头末端、 粘性末端。
平头末端：在同一位置上切割双链，产生平头末端，这种末端 可以通过DNA连接酶连接起来。例如EcoRV的识别位置是： 5’……GAT’｜ATC……3’ 3’……CTA’ ｜TAG……5’
(6) 取出泳动后的凝胶板，EB 染色 20 分钟后才在紫外分 析仪中观察 DNA 区带。（取出凝胶，分析电泳结果）
一般情况下，实验后分析结果一般用肉眼观察， 通过比较待测 DNA 的条带与已知 DNA 的各条带的 荧光密度，估计待测 DNA 在凝胶中的含量和浓度。
பைடு நூலகம்
谢谢聆听!
用途
用于DNA基因组物理图谱的组建；基因的定位 和基因分离；DNA分子碱基序列分析；比较相关的 DNA分子和遗传工程。
电泳概述
带电质点在电场中向与其相反的电极进行泳动的 现象，称为电泳或离子泳。
基本原理：交替溶液中的蛋白质、肽都具有可解 离的基团，在溶液中形成带正电荷或带负电荷或咪唑 基的质点。在酸性溶液中，由于 H+浓度较大，它能抑 制蛋白质分子中的羟基解离出 H+，使更多的-NH2接受 H+形成-NH2+，因此，在酸性溶液中，蛋白质带有较多 的正电荷，在外加电场中，向负极移动；反之，在碱 性溶液中，氢氧根离子中和羟基中的氢离子，蛋白质 带有较多的负电荷，在外电场作用下，向正极移动。
2.仪器 紫外投射反射分析仪，电泳槽，电泳仪。
图1 电泳槽
图2 电泳仪电源
3.试剂
(1) 6*上样缓冲液：0.25%溴酚蓝，40%（W/V） 蔗糖水溶液；
(2) 50*TAE电泳缓冲液：Trish 碱 242g，冰乙酸 57.1ml ， 0.5mol/L EDTA100ml ， 加 水 溶 解 后 定 量 1000ml；
粘性末端：是交错切割，结果形成两条单链末端，这种末 端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键，其断裂的磷酸二 酯键和氢键可通过DNA连接酶连接起来。例如：EcoRI的识 别顺序 5’……G’AA ｜ TT_C……3’ 3’……C_TT ｜ AA’G……5’
Ⅲ型：限制性内切酶有专一的识别顺序，但不 是对称的回文顺序，在识别顺序旁边几个核苷酸对 的固定位置上切割双链，切割后产生的一定长度 DNA 片 段 ， 具 有 各 种 单 链 末 端 。
以琼脂糖凝胶电泳实验为例，待测 DNA 片段与已 知浓度的DNA片段同时进行电泳，根据结合的溴化乙 锭荧光强度，分析其含量：
1. 原理
溴化乙锭(EB)在紫外线照射下能够发射荧光。当 DNA 样品在含有适量 EB 的琼脂糖凝胶中进行电泳时， 其中插入到 DNA 分子中的 EB 与之形成荧光混合物， 使 DNA 发射的荧光增强几十倍。荧光强度与 DNA 含 量成正比关系。为了能够比较出待测样品的浓度，只 需把已知浓度的标准样品作为琼脂糖凝胶电泳的对照。 用肉眼可以检测到0.01~0.1mg DNA，薄层分析扫描仪 可以检测到 5~10ng DNA。
（2）琼脂糖凝胶，适用于分离大分子核；
（3）聚丙烯酰胺凝胶，普遍用于分离蛋白质及较小分 子的核酸。
凝胶电泳优点
(1) 样品不易扩散 (2) 制备简单，时间短； (3) 将分子筛效应和电荷效应结合在同一方法中，提高分辨能力； (4) 需要合成用的原料纯净，制成的多聚物的再现性高，因此样品 分离的重复性也比较高；
(5) 可以随意控制凝胶浓度，按需要可制作不同孔径的凝胶； (6) 一定浓度范围内透明性好，机械轻度好，有弹性； (7) 链上具有不活泼的酰胺基，没有带电的其他离子基，所以电泳 时不会产生电渗；
(8) 用途广泛，可以对核酸、蛋白质等生物高分子进行分离、定量、 定性、分子量的测定；
(9) 需要样品量少，1-100μg 已经足够。
结论：Ⅱ型限制性内切酶的特性使它在分子克 隆 中 得 到 了 广 泛 应 用 ， 是 重 组 DNA 的 基 础 。
3.同裂酶和同尾酶
同裂酶：有时两种限制性内切酶的识别核苷酸 顺序和切割位置都相同，其差别只在于当识别顺序 中有甲基化的核苷酸时，一种限制性内切酶可以切 割，另一种则不能。这些有相同切点的酶称为同裂 酶。
同尾酶：有时两种酶切割顺序不完全相同，但 却能产生相同的粘性末端，这类酶被称为同尾酶， 可以通过DNA连接酶将这类末端连接起来，但原来 的酶切位点将被破坏，有时可能会产生一个新的酶 切位点。
4.影响核酸限制性内切酶活性的因素
a. DNA的纯化 b. DNA的甲基化程度 c. 酶切消化反应的温度 d. DNA的分子结构 e. 溶液中离子浓度及种类 f. 缓冲液的PH值
2.核酸限制性内切酶的类型及基本特性
按限制酶的组成、与修饰酶活性关系以及切断核 酸的情况不同，分为三类：Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型。
Ⅰ型：限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序， 并在识别点附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的双 链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。 这类酶如：EcoB 、EcoK等。