第三章蛋白质
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应用 根据氨基酸的电荷不同（电泳法,离子交换层析）分离混
合物。 根据氨基酸的等电点不同（调节溶液pH ）分离混合物。
Handerson-Hasselbalch公式
pH = pKa + lg（[A-]/ [HA]）= pKa + lg（[碱]/[酸]）
2021/3/3
等电点的计算
• 1.侧链不解离的中性氨基酸
•
Baidu Nhomakorabea
pI = ( pK1 + pK2 )/2
• 2.侧链含有可解离基团的氨基酸
– 酸性氨基酸 pI = ( pK1 + pKR2 )/2 – 碱性氨基酸 pI = ( pK2 + pKR3 )/2 – 半胱氨酸 pI = ( pK1 + pKR2 )/2 – 酪氨酸 pI = ( pK1 + pKR2 )/2
定各种氨基酸。
2021/3/3
3.侧链R基参加的反应
(1)酪氨酸的酚基
➢米伦反应（Millon) ；与与Hg浓N硝O3酸、作H用g（生N成O黄3)2色、H。NO3作用呈红色
➢Pauly反应 与重氮化合物反应生成橘黄色化合物。 注： His的咪唑基与重氮化合物反应生成棕 红色
（2）精氨酸的胍基
➢坂口反应（Sagakuchi） 与次氯酸钠(或次溴酸钠)及α-萘酚在氢氧化 钠溶液中产生红色产物。
1. 化学组成：C、H、O、N、P、S 蛋白质系数：1g氮所代表的蛋白质g数。是凯氏定氮法测蛋
白质含量的计算基础 2.蛋白质的生理功能：要点 构成生物体的基本成分；具有多
种多样的生物功能
（二）.蛋白质结构
1、肽 2、蛋白质的一级结构 3、蛋白质的构象
二级结构 超二级结构和结构域 三级结构 四级结构
2021/3/3
氨酸(257nm)和色氨酸(280nm)有吸收。这是紫外 吸收法测定蛋白质含量的基础。
2021/3/3
（六）氨基酸混合物的分离和分析
• 分配层析法的一般原理 • 纸层析 • 柱层析 • 离子交换层析 • 气液层析 • 薄层层析 • 高效(压)液相层析HPLC
2021/3/3
二、蛋白质通论与结构
（一）蛋白质通论
2021/3/3
（3）Cys侧链上的巯基（－SH）
与卤化烷生成稳定的烷基衍生物------可保护 -SH 以防被氧化
Cys巯基打开氮丙啶的环 巯基能和各种金属离子形成络合物----SH 酶遇到
重金属离子而生成硫醇盐时，将导致酶失活 巯基易受空气或其他氧化剂氧化－两种氧化衍生
物 形成二硫化物：胱氨酸的形成 形成磺酸基：对游离的巯基具有保护作用，保护
Cly巯基之间的氧化。
2021/3/3
二硫键的还原（打开） ①氧化剂：过甲酸（HCOOOH）
②还原剂：巯基乙醇、巯基乙酸、二硫苏糖醇 等。
2021/3/3
（五）氨基酸的光学活性和光谱性质
氨基酸的旋光性 氨基酸的光谱性质 在280nm处有最大吸收峰 • 可见光区都没有光吸收 • 在远紫外区和红外区都有光吸收 • 近紫外区(220~400nm)只有酪氨酸(275nm)苯丙
• 注意：pKa的数值选公式中代入的质子供体和质 子受体之间的解离子数。
2021/3/3
（四）氨基酸的化学反应
1.α- 氨基参加的反应 与亚硝酸反应 与酰化试剂反应 烃基化反应 生成西佛碱的反应 脱氨基反应与转氨基反应
2,4－二硝基氟苯 （DNFB或FDNB，Sanger试剂） 苯异硫氰酸酯 （PITC， Edman试剂） 用于鉴定多肽或蛋白质的N端氨基酸及序列测定
（三）肽
一分子氨基酸的α-羧基与另一分子氨基酸α-氨基脱水缩合的化合物叫
做肽．肽是氨基酸的线性聚合物。
• 肽键的特点
具有部分双键特性，不能自由旋转,呈现相对的刚性和平面化。 肽键的亚氨基没有明显的解离和质子化。 除脯氨酸外多以反式结构存在。
2、根据分子中氨基与羧基数目
酸性氨基酸：Asp Glu 碱性氨基酸：Lys His Arg 中性氨基酸：15种
20种组成蛋白质的氨 基酸均为L-型
3、根据人和哺乳动物所需氨基酸是否能自身合成
必需氨基酸：Lys Val Met Try Leu Ile Thr Phe
半必需：Arg His 非必需：其余10种
2021/3/3
（三）氨基酸的酸碱化学
aa在晶体或水中以兼性离子形式存在
等电点：在溶液某一特定pH值时，氨基酸主要以两性离子形
式存在，净电荷为零，在电场中不向电场的正极或负极移动， 这时的溶液pH值称为该氨基酸的等电点。 ➢ 当溶液pH低于该氨基酸等电点时，氨基酸净电荷为正，反之 为负。 ➢ 氨基酸在等电点时溶解度最低．不同氨基酸等电点不同．
2021/3/3
2.α-氨基和α-羧基共同参加的反应
• （1）与茚三酮的反应 • （2）氨基酸的两性解离 • （3）形成肽键 • （4）离子交换反应 茚三酮在弱酸性溶液中与氨基酸共热，所有具有游离氨基氨
基酸都生成紫色化合物（570）。 脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应直接生成的是黄色化合物（
440）。 应用：是一个检测和定量氨基酸和蛋白质的重要反应。 用层析法把各种氨基酸分开后，利用茚三酮显色可以定性测
不常见的氨基酸：4-羟基脯氨酸 5-羟基赖氨酸 （由常见的氨基酸经修饰而来 的）
非蛋2白021质/3/3氨基酸：150余种
特殊氨基酸的总结
唯一一个无手性碳、无旋光性的氨基酸 ：Gly 唯一一个亚氨基酸、与茚三酮反应生成黄色物质的氨基酸：Pro 含有巯基，在空气中易氧化生成二硫键的氨基酸：Cys 在生物合成中是一种重要甲基供体的氨基酸：Met 在大多数酶的活性中心都发现有其残基的氨基酸：Ser 在生理pH条件下唯一具有缓冲能力的氨基酸：His 碱性最强、在生理条件下完全质子化的氨基酸：Arg 含有两个手性碳的氨基酸：Thr Ile 在近紫外区有吸收的氨基酸：Trp Tyr Phe 能够发生Millon反应的氨基酸：Trp 能够发生Pauly反应的氨基酸：His 能够发生坂口反应的氨基酸： Arg
第三章蛋白质
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（二）氨基酸的分类
1、根据侧链R基团是否有极性
非极性氨基酸 Ala 、Val、 Ile、 Pro、 Phe、 Trp、 Met 极性氨基酸 不带电极性：Gly Ser Thr Cys Tyr Asn Gln
带负电：Asp Glu 带正电：Lys Arg His
合物。 根据氨基酸的等电点不同（调节溶液pH ）分离混合物。
Handerson-Hasselbalch公式
pH = pKa + lg（[A-]/ [HA]）= pKa + lg（[碱]/[酸]）
2021/3/3
等电点的计算
• 1.侧链不解离的中性氨基酸
•
Baidu Nhomakorabea
pI = ( pK1 + pK2 )/2
• 2.侧链含有可解离基团的氨基酸
– 酸性氨基酸 pI = ( pK1 + pKR2 )/2 – 碱性氨基酸 pI = ( pK2 + pKR3 )/2 – 半胱氨酸 pI = ( pK1 + pKR2 )/2 – 酪氨酸 pI = ( pK1 + pKR2 )/2
定各种氨基酸。
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3.侧链R基参加的反应
(1)酪氨酸的酚基
➢米伦反应（Millon) ；与与Hg浓N硝O3酸、作H用g（生N成O黄3)2色、H。NO3作用呈红色
➢Pauly反应 与重氮化合物反应生成橘黄色化合物。 注： His的咪唑基与重氮化合物反应生成棕 红色
（2）精氨酸的胍基
➢坂口反应（Sagakuchi） 与次氯酸钠(或次溴酸钠)及α-萘酚在氢氧化 钠溶液中产生红色产物。
1. 化学组成：C、H、O、N、P、S 蛋白质系数：1g氮所代表的蛋白质g数。是凯氏定氮法测蛋
白质含量的计算基础 2.蛋白质的生理功能：要点 构成生物体的基本成分；具有多
种多样的生物功能
（二）.蛋白质结构
1、肽 2、蛋白质的一级结构 3、蛋白质的构象
二级结构 超二级结构和结构域 三级结构 四级结构
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氨酸(257nm)和色氨酸(280nm)有吸收。这是紫外 吸收法测定蛋白质含量的基础。
2021/3/3
（六）氨基酸混合物的分离和分析
• 分配层析法的一般原理 • 纸层析 • 柱层析 • 离子交换层析 • 气液层析 • 薄层层析 • 高效(压)液相层析HPLC
2021/3/3
二、蛋白质通论与结构
（一）蛋白质通论
2021/3/3
（3）Cys侧链上的巯基（－SH）
与卤化烷生成稳定的烷基衍生物------可保护 -SH 以防被氧化
Cys巯基打开氮丙啶的环 巯基能和各种金属离子形成络合物----SH 酶遇到
重金属离子而生成硫醇盐时，将导致酶失活 巯基易受空气或其他氧化剂氧化－两种氧化衍生
物 形成二硫化物：胱氨酸的形成 形成磺酸基：对游离的巯基具有保护作用，保护
Cly巯基之间的氧化。
2021/3/3
二硫键的还原（打开） ①氧化剂：过甲酸（HCOOOH）
②还原剂：巯基乙醇、巯基乙酸、二硫苏糖醇 等。
2021/3/3
（五）氨基酸的光学活性和光谱性质
氨基酸的旋光性 氨基酸的光谱性质 在280nm处有最大吸收峰 • 可见光区都没有光吸收 • 在远紫外区和红外区都有光吸收 • 近紫外区(220~400nm)只有酪氨酸(275nm)苯丙
• 注意：pKa的数值选公式中代入的质子供体和质 子受体之间的解离子数。
2021/3/3
（四）氨基酸的化学反应
1.α- 氨基参加的反应 与亚硝酸反应 与酰化试剂反应 烃基化反应 生成西佛碱的反应 脱氨基反应与转氨基反应
2,4－二硝基氟苯 （DNFB或FDNB，Sanger试剂） 苯异硫氰酸酯 （PITC， Edman试剂） 用于鉴定多肽或蛋白质的N端氨基酸及序列测定
（三）肽
一分子氨基酸的α-羧基与另一分子氨基酸α-氨基脱水缩合的化合物叫
做肽．肽是氨基酸的线性聚合物。
• 肽键的特点
具有部分双键特性，不能自由旋转,呈现相对的刚性和平面化。 肽键的亚氨基没有明显的解离和质子化。 除脯氨酸外多以反式结构存在。
2、根据分子中氨基与羧基数目
酸性氨基酸：Asp Glu 碱性氨基酸：Lys His Arg 中性氨基酸：15种
20种组成蛋白质的氨 基酸均为L-型
3、根据人和哺乳动物所需氨基酸是否能自身合成
必需氨基酸：Lys Val Met Try Leu Ile Thr Phe
半必需：Arg His 非必需：其余10种
2021/3/3
（三）氨基酸的酸碱化学
aa在晶体或水中以兼性离子形式存在
等电点：在溶液某一特定pH值时，氨基酸主要以两性离子形
式存在，净电荷为零，在电场中不向电场的正极或负极移动， 这时的溶液pH值称为该氨基酸的等电点。 ➢ 当溶液pH低于该氨基酸等电点时，氨基酸净电荷为正，反之 为负。 ➢ 氨基酸在等电点时溶解度最低．不同氨基酸等电点不同．
2021/3/3
2.α-氨基和α-羧基共同参加的反应
• （1）与茚三酮的反应 • （2）氨基酸的两性解离 • （3）形成肽键 • （4）离子交换反应 茚三酮在弱酸性溶液中与氨基酸共热，所有具有游离氨基氨
基酸都生成紫色化合物（570）。 脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应直接生成的是黄色化合物（
440）。 应用：是一个检测和定量氨基酸和蛋白质的重要反应。 用层析法把各种氨基酸分开后，利用茚三酮显色可以定性测
不常见的氨基酸：4-羟基脯氨酸 5-羟基赖氨酸 （由常见的氨基酸经修饰而来 的）
非蛋2白021质/3/3氨基酸：150余种
特殊氨基酸的总结
唯一一个无手性碳、无旋光性的氨基酸 ：Gly 唯一一个亚氨基酸、与茚三酮反应生成黄色物质的氨基酸：Pro 含有巯基，在空气中易氧化生成二硫键的氨基酸：Cys 在生物合成中是一种重要甲基供体的氨基酸：Met 在大多数酶的活性中心都发现有其残基的氨基酸：Ser 在生理pH条件下唯一具有缓冲能力的氨基酸：His 碱性最强、在生理条件下完全质子化的氨基酸：Arg 含有两个手性碳的氨基酸：Thr Ile 在近紫外区有吸收的氨基酸：Trp Tyr Phe 能够发生Millon反应的氨基酸：Trp 能够发生Pauly反应的氨基酸：His 能够发生坂口反应的氨基酸： Arg
第三章蛋白质
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（二）氨基酸的分类
1、根据侧链R基团是否有极性
非极性氨基酸 Ala 、Val、 Ile、 Pro、 Phe、 Trp、 Met 极性氨基酸 不带电极性：Gly Ser Thr Cys Tyr Asn Gln
带负电：Asp Glu 带正电：Lys Arg His