第五章 生产菌种的制备和保藏

不同微生物菌种的接种量不同，细菌类一般 为0.1%-2%，霉菌和酵母菌一般为10%，抗生素菌 种一般为7 % -15%，甚至更多一些。
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（五）种子的质量标准 不同微生物菌种的种子质量标准不同，在 生产上主要有以下几个指标。 1.细胞或菌体 菌体形态、数量、生长量（△OD)、培养液 外观，是种子质量的重要指标。 2.生化指标 种子液的糖、氮、磷含量的变化pH变化是 菌体生长繁殖、物质代谢的反映，所以，它们 也是指标之一。 3.产物生成量 重要指标之一，是种子生产能力和成熟度 的反映。
发酵培养基浓度一般较小，种子培养过程pH一 般较稳定，这样可以较好地满足菌种的生长发育。 （二）培养条件 种子的培养条件一般包括温度、通气（供 氧）、搅拌强度等对菌种培养的影响。因此，
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在培养过程中，我们要给予这些参数高度关注， 尽可能地将其控制在最适条件下。 （三）种龄 种子的培养时间称为种子的种龄。在种子 培养罐中，随着种子培养时间的延长，菌体数 量逐渐增加。但是菌体繁殖到一定程度，由于 营养物质的消耗、代谢产物的积累，菌体数量 不再增加，菌体逐渐衰老。 由于菌体在不同的生长发育阶段其生理活 性差别很大，所以应特别重视种子的种龄。
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2.种子罐种子的制备 种子罐种子的制备工艺过程，因菌种不 同而异，一般可分为一级种子、二级种子和 三级种子的制备。
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现代生物技术的发展是以基因工程菌为 主导的微生物发酵，其菌种的培养要求无菌 程度高，而且培养过程中的条件要求也非常 严格（ 否则易发生变异丢失质粒），从这种 意义上讲，固体菌种的制备是难以实现的， 因此，应以液体培养为主导方式。
霉菌的培养温度一般为25-28 ℃，培养时间为 4-14d。 霉菌孢子的制备方法：菌种 （孢子） 子茄子瓶（孢子） 种子（菌丝） 3.细菌孢子的制备
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母茄子瓶 摇瓶
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细菌的斜面培养基多采用碳源限量而氮源丰富
的配方，牛肉膏、蛋白胨常作有机氮源。
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§5 生产菌种的制备和保藏
本章提要 生产菌种的制备过程 生产菌种的质量控制 生产菌种的保藏
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§5-1 生产菌种的制备过程
一、菌种扩大培养的目的 1.提供大量而新鲜的、具有较高活力的菌种。 目的： a、缩短发酵周期、降低能耗、减少染菌的机会 （空气过滤设备有效时间是有限的）。 b、为了使培养菌在数量上取得绝对的优势，抑 制杂菌的生长。
1.摇瓶种子的制备通常有两种方法：
固体法：用于酿造业（白酒等），也是源于酿 造业， 有霉菌的纯培养，也有混合培养如：大曲。 液体法：液体深层培养，适合于众多发酵行业。
（1）液体扩培流程 固体试管 三角瓶 大三角瓶 一级种子 二级种子 三级种子 发酵罐 （2） 固体扩培流程 固体试管 三角瓶 种曲 麸曲 （机械通风制曲）
丝状菌在斜面培养基上生长发育可分为 五个阶段，即孢子萌发和基内菌丝生长、气 生菌丝生长、孢子的形成、孢子的成熟、斜面 衰老菌丝自溶。
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1.孢子的培养时间
基内菌丝和气生菌丝内的核物质和细胞质呈液态， 各菌丝内质量是不同的，有的含有核粒、有的没有。 这是孢子培养的初期。 孢子的培养时间一般选择在孢子成熟阶段，此时 在光镜下可以看见成串孢子和游离的分散孢子。 2. 孢子的冷藏时间
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§5-2 生产菌种的质量控制
一、影响孢子质量的因素及其控制
（一）培养基
通常，对于种子用的培养基，摇瓶与种 子罐用的培养基也不相同，摇瓶要求培养基 用的原材料精细，碳源浓度较低而且是用微 生物较易利用的碳源。
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3.操作过程对细胞结构的损害 二、菌种的复壮 措施： 1.纯种分离 2.淘汰衰退的个体 3.选择合适的培养条件 三、国内外主要菌种保藏机构介绍 (一）国外菌种保藏机构 （二）国内菌种保藏机构
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小结
本次课首先介绍了菌种生产的制备过程：孢子制备、种 子制备。
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1cm。 4℃冰箱保藏。1年。 3.固体曲保存法 适用于真菌孢子。培养基成分为麸皮、大米、 小米、麦粒等。 保藏期1-３年。 4.沙土管保藏法 适用于产孢子的放线菌、霉菌和产芽孢的细菌。 5.冷冻干燥法 6.液氮超低温保藏法 （三）菌种保藏的注意事项 1.菌种在包藏前所处的状态 2.菌种保藏所用的基质
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小结
本次课首先介绍了菌种扩大培养的目的，其 次介绍了菌种生产的制备过程：孢子制备、种 子制备。第三介绍了影响孢子质量的因素及其 控制：培养基成分、培养温度和湿度、培养时 间和冷藏时间、接种量。
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通常情况下,干燥和限制营养可直接和间接 诱导孢子形成。放线菌斜面的培养温度一般为 28℃，少数为37℃，培养时间为5-14d。
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2.霉菌孢子的制备
培养霉菌孢子的培养基成分一般为大米、玉米、 麸皮、麦粒等农产品。这些农产品的营养成分比较 适合霉菌孢子的繁殖，而且这类培养基的表面积较 大，可获得大量的孢子。
细菌培养温度大多为37 ℃，少数为28 ℃，细 菌培养时间一般为1-2d。芽孢细菌则为5-10d。 三、种子制备 种子制备是将固体培养基上培养出的孢子或菌 体接入液体培养基中培养，使其形成大量菌丝或菌 体的过程。
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对于种子罐用培养基，要求使用接近大 生产用的原材料，氮源浓度较高，有利于菌 体的增殖。
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（二）培养温度和湿度
许多微生物其最适生长温度与最适发酵 温度往往有差异的，例如：谷氨酸发酵，谷氨 酸产生菌的最适生长温度为30℃，而最适产物 合成温度为32-34℃。
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4.酶活力 指标之一。 5.无污染 （六）种子异常的分析 1.菌种生长发育缓慢或过快 菌种生长发育缓慢或过快与孢子质量和培 养条件有关。无菌空气的温度和培养基灭菌条 件差影响大。 2.菌丝结团 在液体培养条件下，菌丝生长聚集成团状 称为菌丝结团。菌丝结团会影响菌的呼吸和对 营养物质的吸收。
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菌丝结团和搅拌效果差、接种量小有关。
3.菌丝粘壁 指在种子培养过程中，由于搅拌效果不好、 泡沫过多以及种子罐装料系数过小等原因，使 菌丝逐渐黏附在罐壁上，最后可能形成菌丝团。
§5-3 生产菌种的保藏
一、菌种保藏的目的与原理 一个优良的菌种被选育出来之后，要保持 其生产性能的稳定，不污染，不死亡，这就是 菌中保藏的目的。
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种子的种龄过老则…；适中则...；过短则…。 最适种龄因菌种不同而有很大差异。细菌菌种种 龄一般为7-12h；霉菌菌种种龄一般为16-50h，放 线菌菌种种龄为20-65h。
（四）接种量 种子培养液的体积与接种后发酵液的体积之 比称为接种量。发酵液的接种量大小与菌种特性、 种子质量和发酵条件有关。
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斜面孢子的冷藏时 间，对孢子质量也有影 响，总的原则是冷藏时间宜短不宜长。 （四）接种量 制备孢子时接种量要适当，种量过大或过小 都会对孢子的质量产生影响。一般要求接种后均 匀分布整个斜面，基本可见单菌落者为适当。接 种摇瓶的斜面孢子，要求菌落疏密适中，孢子数 达到要求。
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（一）菌种保藏的原理 菌种保藏是根据菌种的生理生化特性，人为 创造条件使菌种处于代谢的不活跃状态，保持菌 种的生产性能。 低温、干燥、缺氧。 （二）菌种保藏的方法 1.低温斜面保藏法 此法是利用低温降低菌种的新陈代谢，使 菌种的特性在短期保持不变。 4℃冰箱保藏。1-3月。 2.液体石蜡封存保藏法
与孢子培养基成分对孢子质量有较大影响一样， 种子培养基的原材料也对种子质量有较大的影响。
种子培养基成分首先应满足种子培养的
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需要，一般选择一些有利于孢子发芽和菌丝生长的 营养成分，如氮源和维生素等，使培养的菌丝粗壮、 活力强。其次，种子培养基成分应尽可能同发酵培 养基成分相似，以适应发酵生产的要求。
二、孢子制备
1.放线菌孢子的制备
孢子的制备是生产菌种生产的开始，是发酵生 产的第一个环节。孢子的质量、数量对以后菌丝的
生长、繁殖和代谢产物的形成有重要影响。
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不同菌种的孢子制备工艺有不同的特点。 放线菌孢子的培养一般采用斜面培养基，培 养基中含有一些适合产孢子的营养成分，如麸皮、 蛋白胨和无机盐等。
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从对数残留定律上看，任何灭菌过程都不能够 做到绝对无菌，因此，抑制杂菌生长，使菌种在数 量上占绝对优势也是一种方法，往往是一种行之有 效的方法。
2.让菌种从固试管、液体试管、三角瓶……， 逐步适应发酵要求。如：啤酒发酵。
3.菌种经过扩大培养，可以提高生产的成功率， 减少“倒罐”现象。 许多生产菌种往往都是“溶原性”的？
通过连续的扩大培养，每一级都要进行
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严格的检查，对于不合格的严禁使用，无疑增加了 生产的可靠性。
生产菌种的制备一般包括两个过程，即在固体 培养基上培养孢子的孢子制备过程和在液体培养基 中生产菌丝的种子制备过程。
种子扩大培养的温度的选择，应该考虑 的是菌体的快速增殖上，一方面可以缩短周期， 另一方面有利于抑制其他杂菌的生长。
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湿度是指斜面培养时的相对湿度,它对孢 子形成的速度、数量和质量有很大影响。 （三）培养时间和冷藏时间
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二、影响种子质量的因素及其控制
影响种子质量的因素有孢子质量、培养基组成、 培养条件、种龄和接种量等。 种子的制备目的是为生产提供一定数量和质量 的种子，而且要求菌种处于其生命活动的最旺盛时 期，一般是菌种培养的对数期。 （一）培养基