半定量检测与表述

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蛋白半定量,定量,绝对定量

百泰派克生物科技
蛋白半定量，定量，绝对定量
在蛋白质分析中主要对定性分析和定量分析进行研究，定量分析就是对蛋白样品的含量进行鉴定，可以分为定量、半定量、相对定量和绝对定量。

蛋白定量很容易理解，那什么又是半定量、相对定量和绝对定量呢？今天小编就和大家聊聊这个问题。

蛋白定量就是对某蛋白样品进行精确的定量鉴定，其测定结果较接近真实值，可信度高。

通常利用标记（iTRAQ、TMT、SILAC等）或非标记（Label Free）策略进行
蛋白定量研究。

蛋白半定量不是指对一半的蛋白质进行定量研究，而是指在某些特殊情况下，如难以直接对蛋白质含量进行测定或蛋白含量易发生周期性波动时，只能对蛋白质的含量进行粗略的、大致的鉴定，所得到的结果是近似的测量值，精确度远不如定量分析。

蛋白相对定量，又称为比较定量，是将两种蛋白质在不同状态下的表达量或含量进行相对比较分析，常用于检测不同生理或病理状态下蛋白含量的变化。

蛋白绝对定量是对各类蛋白进行浓度或含量的绝对分析，可以对组织、体液或细胞蛋白质组中的每一种蛋白质进行绝对含量和浓度分析，是一种靶向定量蛋白组学技术，常用于蛋白质或其修饰状态的定量分析。

目前主要利用内标法或基于质谱的非标记方法进行蛋白绝对定量研究。

百泰派克生物科技基于高分辨率质谱仪结合丰富的生物信息学分析经验，提供高效精准的蛋白质定量服务技术包裹，能够实现蛋白质定量、半定量、相对定量、绝对定量、标记定量以及非标记定量等分析，欢迎免费咨询。

半定量

半定量又叫半定量PCR半定量是RT-PCR做基因表达分析的一种方法，其操作的方法是在野生型和突变体中用一个看家基因（通常是actin）做参照标准来观察目标基因在各自的表达情况（上调还是下调），所谓半定量的“半”是通俗的说法，即在看电泳图估计参照亮度一致（可看作是表达的细胞数一致）情况下，确定目标基因的表达；这是与更加精确的Q-PCR的相对定量和绝对的量区分。

半定量解释（semi-quantitative interpretation）是介于定性和定量之间的解释。

尽管使用了数学方法对地质目标的空间位置或物性进行了数值计算，也获得了量值，但由于这些方法的使用是有非常严格的前提条件的，而在实际情况下这些条件是不满足的，所以这些定量计算的结果只能从趋势上为解释人员提供参考。

半定量分析定性分析是能区分出是个什么东西。

举个例子来说，你能辨认出这是苹果，但你不能确定是几个苹果。

定量分析是在定性的基础上给出清晰的数量关系。

比如，你确定了这是5个苹果。

而半定量分析是通常实现定量分析非常困难时采取的一种则中办法。

还是举例说明。

这里有一堆苹果，你不知道具体的数量。

但是你能知道的是这一堆苹果能装5麻袋。

这5麻袋的数量估计就是半定量分析。

定量PCR是PCR的一种。

PCR仪目的为了基因扩增。

在基因扩增中最重要的就是升降温过程，最早的PCR就是三个水浴锅,一个机械臂，定时抓出反应槽转换水浴锅。

PCR的结果需要借助其他手段来检测。

后来随着定量技术的发展，将PCR和检测做成一体，就形成了定量PCR仪。

还可以与荧光技术结合，同时在每个扩增过程都能实施监控。

定量PCR（PolymeraseChainReaction）技术有广义概念和狭义概念。

广义概念的定量PCR技术是指以外参或内参为标准，通过对PCR终产物的分析或PCR过程的监测，进行PCR 起始模板量的定量。

广义概念下的定量PCR技术可以分为五种类型：（1）外参法+终产物分析。

所谓“外参法”是指样本与阳性参照在两个反应容器内反应。

lh半定量检测试纸参考区间的描述

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半定量分析与定量分析

• 揭示物理规律和现象的本质
• 为物理理论建设和技术创新提供依据

化学研究
• 通过对化学反应和物质性质进行定量分析
• 揭示化学规律和现象的本质
• 为化学理论建设和技术创新提供依据
⌛️
自然科学研究方法的比较研究
• 通过对不同自然科学研究方法进行比较分析
• 探讨各种研究方法的优势和局限性
• 提高研究的准确性和可靠性
• 探讨各种研究方法的优势和局限性
• 提高研究的科学性和可靠性
半定量分析在自然科学研究中的应用
自然科学研究方法的比较研究
• 通过对不同自然科学研究方法进行比较分析
• 探讨各种研究方法的优势和局限性
• 提高研究的准确性和可靠性
生态系统分析
• 通过对生态系统进行定性描述和分类
• 揭示生态系统的结构和功能
推断性统计方法
• 揭示研究对象之间的相
互关系和影响程度
• 为预测和控制提供依据
和方法

• 通过对数据进行推断和
预测
• 揭示研究对象的内在关
系和规律
• 为实证研究提供依据和
方法
定量分析在社会科学研究中的应用
01
经济实证研究
• 通过对经济数据进行分析和计算
• 揭示经济增长和发展的规律
• 为经济政策制定提供依据和建议
• 采用非数值化的研究方法
• 适用于对复杂现象的研究
半定量分析的目的
• 深入了解研究对象的内在联系
• 为定量分析提供基础和支持
• 提高研究的科学性和可靠性
定量分析的定义与特点
01
定量分析是一种研究方法
• 通过数值化的手段
• 对研究对象进行测量和计算

半定量介绍

关于mRNA和蛋白的一致性，mRNA是不能代替蛋白水平的分析的，因为还有翻译效率和RNA降解速度的影响，当然还有蛋白的剪切和分解速度等等，但是表达水平一般来说可以大致估计一种基因的翻译产物的，有时。

但二者不能混委一谈。

基因组问题:如上所述，可以不用处理基因组的。

但是如果是单外显子呢?曾经有以为朋友问我，她的样品中总是有基因组的污染，用RNA去p总能P出来。

她先用trizol过两遍，再用qiagen过两遍，还能P出来。

这是很多人碰到的问题，问题的关键是TAQ(除了具有DNA指导的)还有RNA指导的DNA聚合酶功能，所以是可以直接从RNA中P出来的!那就冒险让RNA 高温一下吧，只是DNAase处理时一定小心，买大公司的，保险一些，至少也应该是takara 的，买液体做好的，不要自己配，比起标本来，这时候银子已经退居其次了。

长度:我们认为500之内比较好，不受中间可能出现的各种序列和二级结构的影响。

至于eeflying说的跑的在前会弥散则可以用2%的胶就行了。

我一般是250左右。

目的基因和内参照之间的大小比例可以根据爱好和胶的浓度、分辨率调整的。

如果是250，则相差100bp很好，如果4、500则差个200bp也可以。

内参照:每一次一定要做内参。

不作内参的结果是不可信的，实际上我想大部分半定量RT-PCR 本身就是不可信的，不过我做的是可信的，因为我反复摸，重复做，每次作内参照，跟自己对照，用不同的酶，不同的体系，作出同样的结果(基因表达结果，不是条带什么的)。

不管多少样品，内参不作，等于说比较珠穆朗玛峰和泰山的高度一样，没有海拔，泰山从地面的高度和珠穆朗玛峰从青藏高原的高度没什么差别。

PCR一定要同时作，但是电泳可以不一起跑，没有关系，记住，计算的是相对表达程度，再说一遍我的观点:1、半定量和定量RT-PCR做的都是基因相对表达量，不是绝对表达量，除非你能准确知道来自多少细胞，但是细胞还有死的呢。

半定量

半定量解释（semi-quantitative interpretation）是介于定性和定量之间的解释。

半定量分析定性分析是能区分出是个什么东西。

举个例子来说，你能辨认出这是苹果，但你不能确定是几个苹果。

定量分析是在定性的基础上给出清晰的数量关系。

比如，你确定了这是5个苹果。

而半定量分析是通常实现定量分析非常困难时采取的一种则中办法。

还是举例说明。

这里有一堆苹果，你不知道具体的数量。

但是你能知道的是这一堆苹果能装5麻袋。

这5麻袋的数量估计就是半定量分析。

定量PCR是PCR的一种。

PCR仪目的为了基因扩增。

在基因扩增中最重要的就是升降温过程，最早的PCR就是三个水浴锅,一个机械臂，定时抓出反应槽转换水浴锅。

PCR的结果需要借助其他手段来检测。

后来随着定量技术的发展，将PCR和检测做成一体，就形成了定量PCR仪。

还可以与荧光技术结合，同时在每个扩增过程都能实施监控。

定量PCR（PolymeraseChainReaction）技术有广义概念和狭义概念。

广义概念的定量PCR技术是指以外参或内参为标准，通过对PCR终产物的分析或PCR过程的监测，进行PCR 起始模板量的定量。

广义概念下的定量PCR技术可以分为五种类型：（1）外参法+终产物分析。

所谓“外参法”是指样本与阳性参照在两个反应容器内反应。

半定量pcr的原理及其应用

半定量PCR的原理及其应用1. 引言半定量PCR（Semi-quantitative PCR）是一种应用广泛的分子生物学技术，用于分析特定基因在样本中的相对表达水平。

本文将介绍半定量PCR的原理和其在生命科学研究中的应用。

2. 原理半定量PCR基于定量PCR技术，但相对于定量PCR，半定量PCR并不精确地确定特定基因的绝对表达水平，而是通过对样本中目标基因和内部参照基因的PCR扩增进行比较，从而得出目标基因的相对表达水平。

半定量PCR的原理过程如下：1.样本提取：从待测样本（如细胞、组织等）中提取总RNA或DNA，并经过反转录反应获得cDNA。

2.反应设计：选择目标基因的引物和内部参照基因的引物。

内部参照基因在不同样本中的表达水平稳定，因此可作为对照。

3.PCR反应：将待测样本的cDNA和引物以及适当的PCR缓冲液、酶等加入PCR反应管中，进行PCR扩增。

4.延伸周期：利用PCR仪按照特定的温度和时间条件进行一系列的扩增周期，使目标基因和内部参照基因进行扩增。

5.凝胶电泳：将PCR产物进行凝胶电泳，确定扩增产物的大小，并通过测定相对带状强度来比较目标基因和内部参照基因的表达水平。

6.数据分析：通过半定量PCR的标准曲线或内标法等方法，计算出目标基因的相对表达水平。

3. 应用半定量PCR的应用广泛，特别在以下方面具有重要作用：3.1 基因表达研究半定量PCR可用于研究不同基因在不同组织或细胞中的相对表达水平，从而了解基因的功能及其调控机制。

通过对目标基因和内部参照基因的半定量PCR分析，可以比较不同样本中目标基因的表达差异。

3.2 药物研发半定量PCR可用于药物研发过程中的药效评估。

通过比较药物处理组和对照组样本中目标基因的表达水平，可以评估药物对基因表达的影响。

3.3 疾病诊断半定量PCR在疾病诊断中具有重要的应用价值。

通过检测目标基因在患者样本中的表达水平，可以辅助诊断某些疾病，如癌症、遗传病等。

基因表达的半定量PCR检测

基因表达的半定量PCR检测实验目的：以cDNA为模板，利用PCR技术制备目的基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶（Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）的大量拷贝，以便进行目的基因的克隆；此实验还包括PCR引物设计，PCR产物的琼脂糖电泳检测等内容。

实验原理：真核细胞含有三类基本RNA：核糖体RNA（rRNA）、信使RNA（mRNA）、转移RNA（tRNA）。

其中mRNA传递合成蛋白质的全部遗传信息，是蛋白质生物合成的中间环节，具有特殊意义。

Trizol试剂可从细胞中快速提取细胞总RNA，将其中的mRNA逆转录成cDNA，以一对特异性引物对目的cDNA进行聚合酶链式反应扩增。

由于每个循环中合成的引物延伸产物可作为下一循环中的模板，因而每次循环中靶DNA的拷贝数呈几何级数增长，因此，30次PCR循环将产生约1亿倍（230）的扩增片段。

PCR技术又称聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction）技术，是一种在体外（试管）扩增核酸的技术。

该技术模拟体内天然DNA的复制过程。

其基本原理是在模板、引物、4种dNTP和耐热DNA聚合酶（Taq DNA polymerase）存在的条件下，特异扩增位于两段已知序列之间的DNA区段的酶促合成反应。

每一循环包括高温变性、低温退火、中温延伸三步反应。

每一循环的产物作为下一个循环的模板，如此循环30次，介于两个引物之间的新生DNA片段理论上达到230拷贝（约为109个分子）。

PCR技术的特异性取决于引物与模板结合的特异性（图3-1）。

PCR反应的基本步骤包括高温变性（denaturation）；低温退火（annealing）；中温延伸（extension）三步反应（图3-2）。

①变性（denaturation）（95℃）；②退火(annealing)；③延伸(elogation)（72℃）图3-1 PCR扩增DNA原理示意图图3-2PCR实验中各种组分的剂量：（1）dNTP常用浓度为20~200μM，不能低于10~15μM。

化学计量实验教案：半定量分析的方法和应用

化学计量实验教案：半定量分析的方法和应用半定量分析的方法和应用化学计量实验是化学教育中的重要实验之一，是化学学科中非常重要的一个分支。

化学计量实验是以化学计量基本原理为基础，通过实验技术和方法来进行定量或半定量分析的一种实验方法。

化学计量实验的应用非常广泛，可以用于环境监测、食品检验、药品制造等领域。

本文将重点介绍化学计量实验中的半定量分析方法和应用。

一、半定量分析的方法半定量分析是一种只能得到样品中化学物质约定量的方法。

下面列举几种半定量分析常用的方法：1、滴定法滴定法是一种利用滴定液与被测液体反应生成定量产物的方法。

该方法可以用于计算定量的物质，但是无法得到准确的结果。

因此，它通常是被用于半定量分析。

滴定法的基本原理是利用滴定液中的一种化学物质来与被测液体中的目标化学物质反应，生成定量产物，如常用的KMnO4滴定法、HClO4滴定法等。

2、分光光度法分光光度法是一种可以利用吸收特定波长的光来测定化学物质浓度的方法。

它基于分子吸收光的本质，可用于半定量或使用校准曲线来进行定量分析。

该方法又称分光光度测定法，常用于分析痕量元素。

3、比色法比色法是利用化学物质与某种显色剂反应，使溶液颜色发生变化进行半定量分析的一种方法。

该方法与分光光度法的原理类似，但是常常受到样品矩阵干扰的影响。

二、半定量分析的应用1、环境监测半定量分析在环境监测中应用广泛，可以用于测定水、大气、土壤等中的污染物含量。

如利用滴定法测定水中硬度离子的含量、利用光度法测定大气中氧化物浓度的方法等。

2、食品检验食品安全问题一直是人们所关注的话题，半定量分析方法在食品检测中有着非常重要的应用。

如利用比色法检测食品中的添加剂、利用滴定法测定食品中盐分含量、利用分光光度法测定食品中的微量元素等。

3、药品制造半定量分析方法在药品制造中也应用广泛。

如利用分光光度法检测药品中的杂质、利用滴定法测定药品中有效成分的含量、利用比色法测定药品中添加剂的含量等。

半定量分析方法课件

结果评估和优化：如何
对分析结果进行评估和
优化
• 需要根据具体问题和数据情况进
• 需要建立完善的评估标准和优化
行研究
方法
半定量分析方法的发展趋势
多学科交叉融合：结合统计学、计算
机科学、管理科学等多学科知识
• 促进半定量分析方法的发展和创
新
智能化与自动化：利用
人工智能、大数据等技
术提高分析方法的智能
化和自动化程度
半定量分析方法课件
S M A R T C R E AT E
CREATE TOGETHER
01
半定量分析方法的概述与应用领域
半定量分析方法的定义与特点
半定量分析方法是一种结合定量与定性分析的技术
• 依赖数据收集和统计分析
• 结合专家知识和经验
• 提供近似结果而非精确数值
半定量分析方法的特点
• 灵活性：适应不同场景和需求
• 为生态保护提供支持
环境政策效果评估：评估环境政策和措施的效果
• 为政策调整提供依据
半定量分析方法在交通规划中的应用
交通需求预测：预测未来交通需求和变化趋势
• 为交通网络优化提供依据
道路拥堵分析：分析道路拥堵情况和影响因素
• 为交通政策制定提供依据
交通政策效果评估：评估交通政策和措施的效果
• 为政策调整提供依据
• 缺点：模型构建和求解复杂，需要专业知识
03
基于专家知识的半定量分析方法
• 优点：充分利用专家知识和经验，适用于复杂问题
• 缺点：专家知识获取和表示困难，结果受专家影响较大
03
半定量分析方法的原理与技术
半定量分析方法的基本原理
数据收集与处
理：收集相关

半定量检测名词解释_概述及解释说明

半定量检测名词解释概述及解释说明1. 引言1.1 概述半定量检测是一种常用的分析方法，用于测量分析样品中特定物质的含量。

相比于定量检测，它并不能给出具体的数值结果，但可以通过一系列定性和半定量的方式来判断目标物质的相对含量。

半定量检测在科学研究和工业应用中具有广泛的应用价值，并且随着技术的不断发展，其在医学领域中也扮演着重要角色。

1.2 文章结构本文将以以下结构进行阐述半定量检测名词解释与相关内容。

首先，在引言部分进行概述，并说明本文的目的；然后，在第二部分介绍半定量检测名词解释以及与定量检测之间的区别，并探讨其基本原理和意义；接下来，第三部分将详细介绍半定量检测中常见的技术和方法，包括周期性染色法、尺度分析法和标准曲线法；第四部分将通过实例分析，探讨半定量检测在医学领域中的应用，包括血糖水平、癌症标志物和药物代谢产物的半定量检测方法研究；最后，第五部分将总结大纲中各部分的主要发现，并提出对未来研究方向的建议和展望。

1.3 目的本文旨在全面解释半定量检测这一概念，并介绍其基本原理、常见技术方法以及在医学领域中的应用。

通过对半定量检测的深入了解，读者可以更好地理解该分析方法在实际应用中的significance 并为相关领域的研究提供参考和借鉴。

2. 半定量检测名词解释2.1 定量检测与半定量检测的区别：定量检测是一种可以精确确定样品中物质含量的方法，常用于实验室研究和临床诊断等领域。

它通常使用标准曲线法或其他精确计量方法来确定物质的浓度，结果以具体数值表示。

相比之下，半定量检测采用一些基于相对关系的方法来估计物质含量，结果以相对强度、阳性与阴性判读或者分级等方式进行表示。

半定量检测主要适用于需要对样本进行相对比较或筛查的情况，例如初步评估某种物质在不同样品中的相对水平。

2.2 半定量检测方法的基本原理：半定量检测方法通常利用观察到的信号强度与被测试物质含量之间的关系进行估计。

这些方法往往基于一些可观察到的特征或者指标，如颜色、荧光、尺度分析结果等。

半定量指标

半定量指标是一种用于描述和量化生物学、医学和生态学等领域中某些特征的方法，它通常基于一些定性的标准或指标，将观察到的特征分为不同的等级或类别，并将这些等级或类别转化为数值或百分比等形式的量化指标。

常见的半定量指标包括：
1. 酶活性：酶活性是指酶在一定条件下催化化学反应的速率，可以用半定量指标来描述酶的活性水平，如单位时间内反应物的消耗量或产物的生成量等。

2. 细胞密度：细胞密度是指单位体积内细胞的数量，可以用半定量指标来描述细胞的密集程度，如每立方毫米或每平方厘米内的细胞数等。

3. 免疫学指标：免疫学指标是指反映机体免疫系统功能的一些生化指标，如白细胞计数、C-反应蛋白、血沉等。

4. 微生物学指标：微生物学指标是指反映微生物感染或污染程度的一些生化指标，如细菌计数、真菌计数等。

5. 生态指标：生态指标是指反映生态系统或环境质量的一些指标，如土壤有机质含量、水质指标等。

总之，半定量指标在生物学、医学和生态学等领域中被广泛应用，可以帮助科学家们更好地描述和量化各种特征，从而更好地理解这些特征的本质和影响因素。

半定量RTPCR法在检测基因表达水平中的应用

半定量RT PCR法在检测基因表达水平中的应用半定量逆转录多聚酶链式反应是近年来常用的一种简捷、快速、特异的定量RNA 测定方法, 通过mRNA 反转录成cDNA , 再进行PCR 扩增, 扩增产物以指数形式增长, 通过测定PCR 产物的数量, 就可以推测各样品中特异mRNA 的相对含量, 即使模板浓度较低也能检测到. 这就为用非常少量的RNA分析提供了可能. 虽然此法只能测定mRNA 的相对含量, 但在比较模型组和对照组样品之间特异mRNA 的表达差异时足以说明问题.利用PCR 技术对生命过程中某种基因表达量变化的分析经历了一个从相对定量到绝对定量的过程, 荧光实时定量PCR 仪的问世, 使定量技术达到了一个新的高度, 实现了PCR 从定性到定量的飞跃, 但是, 由于荧光实时定量PCR仪价格昂贵, 限制了该仪器在研究中的推广使用。

事实上, 在许多研究过程中只需评估样品之间某种基因表达水平的相对差异, 半定量RT－PCR技术完全可以满足上述目的的要求。

与经典的检测基因的表达方法如Northern 印迹、RNA 酶保护分析等相比, 半定量RT －PCR法以其灵敏度高(比杂交法高1 000～ 10 000 倍)、专一性好、快速简便、且对初始总RNA 量要求不很严格, 不需已知浓度的标准品等优点而得到广泛的应用.1 半定量RT－PCR 方法的检测步骤1. 1 提取组织或细胞中的总RNA总RNA 的纯度和完整性关系到后面的cDNA合成及PCR 扩增, 因此所提的总RNA 要求纯度高,完整性好并达到一定的浓度. 要达到这一要求, 必须从取标本开始就进行无RNA 酶操作, 以防RNA 酶对所提总RNA 的降解, 具体做法为:所用的器械及器皿必须经200 ℃以上的高温烘烤最少5 h; 所用的耗材及试剂必须用0. 1% 的DEPC 水处理12～ 16 h,这样方可保证所提总RNA 的完整; 在选用试剂时最好选用知名品牌公司的试剂, 以保证总RNA 纯度及提取的产量;另外所用的组织量最少应在100mg、细胞数最少应在107.1. 2 总RNA 的纯度和完整性鉴定总RNA 提取之后, 必须用紫外分光光度计测定其纯度和浓度,A 260?A 280 在1. 8～ 2. 0 之间方可采用; 然后再用1. 5% 左右的琼脂糖凝胶对总RNA 进行电泳, 以鉴定其完整性, 浓度不高, 完整性不好的标本最好不用, 以免影响后面的实验结果.1. 3 cDNA 第一链的合成由总RNA 逆转录成cDNA 时, 所取的各组标本的总RNA 的量必须要一样多, 最好在1ug 以上, 这样才能保证各组标本总RNA 中所需检测的mRNA量的差异.为了使逆转录效益最大, 最好采用含有多个碱基的随机序列引物.1. 4 PCR 扩增以逆转录的cDNA 第一链为模板, 以特异性引物扩增所要检测的mRNA. 在PCR 扩增时一定要注意以下两点: ①为了克服不同管间扩增引起的“管效益”, 必须以组成型表达的内参基因如β-actin (或其它的看家基因, 如GA PDH、β-M G 等) 为内标, 在同一管中加入扩增内参基因的引物, 共同扩增所要检测的基因和内参基因, 内参扩增产物的大小最好与目的基因mRNA 扩增产物的大小相差200 bp 以上,这样便于观测结果; ②由于PCR 扩增存在着扩增效率及平台期的问题, 因此必须进行预试验以确定待检测基因与内参基因达到平台期前扩增效率最大的循环数. 对于PCR 反应存在着这样的关系式: N =N 0 (1+ E) n. 其中N 0为起始浓度, E 为扩增效率, n代表扩增周期,N 为产物最终浓度. 那么log N = nlog (1+ E) + log N 0. 通过预试验, 在不同的周期取样进行密度扫描, 以待检测基因与内标比值的对数分别与扩增周期作图, 如在20～ 30 周期内, 它们的线性关系良好, 说明在30 周期内二者的扩增未到达平台期, 最后确定扩增效率最大的循环数, 这样可有效地避免因引物结合效率不同而引起的误差.1. 5 结果的分析根据扩增产物片段的大小配制最适宜浓度的凝胶, 将PCR 扩增产物进行电泳. 待检基因与内参基因的扩增条带应相隔一定的距离(最少200 bp 以上) , 以便于观测结果及密度扫描, 且所选用的Marker 应尽量含有与扩增产物相对应的条带. 电泳条带经密度扫描仪扫描, 得到待测基因与内参基因条带各自的峰面积积分值, 计算各组样品两者的比值. 为了使扩增条带密度扫描的峰面积积分值尽量的准确可靠, 电泳条带一定要清晰, 不能有杂带出现. 有杂带出现的标本最好不用, 若有杂带应重新调整PCR 过程中的退火温度, 直至杂带消失, 这样才能保证扫描结果的专一性及可靠性.2 半定量RT -PCR技术的关键因素2. 1 总RNA 和cDNA 的质量只有在总RNA 未被降解的情况下, 才能保证其中mRNA 的完整性和随后反转录的cDNA 的质量,从而真实反映基因的表达.2. 2 总RNA 的定量在反转录之前, 作为起始模板各个样品中的总RNA 量要一样, cDNA 量和电泳PCR 产物量也要一样, 这样才能保证PCR 扩增产物能真实反映基因表达的实际情况.2. 3 引物的选择PCR反应的特异性是由一对上下游引物所决定的, 因此引物的好坏往往是PCR 反应成败的关键. 引物包括扩增目的基因的引物及扩增内参基因的引物, 引物的设计, 要根据基因的非保守序列设计, 以保证扩增的特异性.2. 4 PCR 循环数的确定选择合适的循环数不仅能使扩增产物在琼脂糖凝胶上清晰可见和定量, 也可使扩增反应在到达平台期前的线性范围内进行.在RT-PCR 方法中, 反应的循环数是一个必须分析的参数. PCR 扩增产物的量与循环数之间有一线性关系. 前期的扩增产物量随循环数的递增而成比例增加. 随着DNA 聚合酶活性的下降和溶液中反应底物的消耗, 扩增产物将达到一个平台. 半定量分析的循环数应确定在成比例的线性关系范围内. 表达丰度不同的基因半定量分析的PCR 循环数不同.PCR 扩增反应是酶促反应, 遵循酶促反应定律, 开始的循环内扩增产物呈指数累积, 产物与模板呈线性关系, 半定量RT-PCR 技术正是利用产物与模板的这一线性关系, 通过扩增产物来对比总RNA 中目的基因的表达, 但经过一定的循环后, PCR 产物不再呈指数累积而进入平台期, 在平台期低水平表达的目的RNA 可能会增加到与高水平表达的目的RNA 相同的浓度, 因此, 为避免平台效应的影响, 合适的循环数是PCR 半定量方法的关键因素之2. 5 最佳Mg2+ 浓度的确定M g2+ 浓度对PCR 扩增的特异性和产量有显著的影响, 因为它是影响Taq 酶扩增效率的重要因素,除此之外,M g2+ 还可影响引物的退火和解链温度,影响产物的特异性以及引物二聚体的形成等. 浓度范围多在0. 5～ 5 mmo lPL , 但扩增的效率则主要视序列而定. 在一般的PCR 反应中, 各种dNTP 浓度为200 umo lPL 时,M g2+ 浓度为1. 5～ 2. 0 mmolPL 为宜. M g2+ 浓度过高, 反应特异性降低, 出现非特异性扩增, 浓度过低会降低Taq DNA 聚合酶的活性, 使反应产物减少. 实验过程中可分别取1. 0、1. 5、2. 0mmo lPLMg2+ 进行预实验, PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳后, 通过鉴定其亮度和特异性, 来确定最适的M g2+ 浓度.2. 6 合适内参的选择设立内参照可以减少因RNA 定量时产生的误差, 也可消除细胞个数的差别所带来的误差. 为避免RNA 抽提、加样、测量、cDNA 合成及PCR 反应过程中的某些系统误差和人为误差, 实验要选用在生物体内稳定表达且在其它生理条件下不受影响或影响很小的持家基因片段作为内参.传统的半定量RT-PCR 技术多以β-act in 作内参, 另外常用的内参照还有GAPDH, 它是一种细胞内代谢酶,其基因属于保守性强的“管家基因”, 该基因在生物体内普遍存在且稳定表达. β-M G 也是常用的内参, 研究表明18 S rRNA 具有更强的保守性和更普遍而恒定表达的特性, 因此在很多情况下也常常被用作内参. 不同的生物体其生命过程和生理过程各不相同, 选用何种内参要根据目的基因和实验的具体情况而定.3 半定量RT-PCR 法的应用半定量RT-PCR 是目前研究基因转录水平的有效手段, 可用来检测基因表达及其变化状况, 并可进行定量分析, 万平等以微管蛋白基因(Tubulin) 为对照,利用半定量RT 2PCR 法研究发现小麦锌指蛋白基因(TazF) 属于组成型表达基因. 王维平等以水稻肌动蛋白基因(Actin) 为对照, 利用半定量RT-PCR 研究, 发现水稻RCOI1基因的表达受茉莉酸甲酯(MeJA) 的诱导. 同时半定量RT 2PCR 方法在病原体检测、转基因的安全检测及肿瘤的研究方面也有非常广泛的应用.4 总结与展望半定量RT-PCR 法除了要求反转录和PCR条件完全一致外, 相比较样品之间最好同批进行RT -PCR , 对于用凝胶扫描检测PCR 扩增产物来说, 更适宜在同一块凝胶上进行电泳分离. 如果样品数量多, 由于泳道限制, 就不能同时在一块胶上电泳. 这时可采用Life Technologies 公司的定量Marker, 通过计算分析, 得到PCR 扩增产物的含量, 这样就可对同批扩增的样品进行多次重复电泳检测, 以提高定量的准确性和可靠性. 另外采用反转录与PCR分开进行的两步法RT-PCR , 在实验摸索阶段较一步法RT-PCR更为经济和方便, 因为每次提取到的总RNA 立即反转录成cDNA 存放, 可以尽量避免RNA操作中的降解, 而且一次反转录的cDNA 模板可供多次PCR 使用, 不但节约成本还可缩短实验周期,提高实验成功率.若靶基因的模板量大大低于内参基因, 若按常规方法同时加入两种基因的引物进行PCR 扩增, 在同一PCR 体系中, 太高浓度的模板会竞争性地形成优势扩增, 从而使另一模板失去指数扩增. 同时, 由于PCR 扩增中“平台期”的影响, 当靶基因可用EB检测出时, 内参基因已快进入“平台期”. 因此可采用PCR 扩增时内参照引物滞后加入的方法, 使内参照与靶基因同时处于指数增长期, 这样就可避免内参的优势扩增. 另外半定量RT - PCR 检测体系必须防止混在RNA 中的基因组DNA 带来的假阳性. 为排除可能的污染, 在实验中可同时设置两个阴性对照,一是以mRNA 为模板直接进行PCR 反应, 另一组不加任何模板. 若含有基因组DNA , 则会有条带出现.总之, RT-PCR 法是讨论基因转录水平的有效手段, 利用RT 2PCR 法对mRNA 进行半定量分析,最关键的是优化实验条件, 寻求PCR线性扩增范围, 确定最适M g2+ 浓度和PCR 循环数. 但是要使该法能够较准确地定量, 还有许多要注意的问题, 如在进行目的基因的定量分析过程中尚需考虑目的基因和内对照基因的丰度、大小以及它们的引物长短对扩增反应的影响, 另外就定量分析而言, 要使PCR产物量能够较好地反映起始模板量, 必须对处于指数扩增阶段的产物进行检测, 而它是不能通过EB 染色检测到的, 这是在利用常规PCR 方法分析目的基因表达变化过程中常遇到的难题, 大多数实验室常将定量分析过程中的PCR 扩增循环数提高到30 甚至35 个循环, 但是, 往往导致实验失败, 因此, 寻求一种高灵敏度的检测核酸数量变化的方法是今后需要努力去做的工作.。

半定量介绍

半定量介绍关于mRNA和蛋白的一致性，mRNA是不能代替蛋白水平的分析的，因为还有翻译效率和RNA降解速度的影响，当然还有蛋白的剪切和分解速度等等，但是表达水平一般来说可以大致估计一种基因的翻译产物的，有时。

但二者不能混委一谈。

基因组问题:如上所述，可以不用处理基因组的。

但是如果是单外显子呢?曾经有以为朋友问我，她的样品中总是有基因组的污染，用RNA去p总能P出来。

她先用trizol过两遍，再用qiagen过两遍，还能P出来。

长度:我们认为500之内比较好，不受中间可能出现的各种序列和二级结构的影响。

至于eeflying说的跑的在前会弥散则可以用2%的胶就行了。

我一般是250左右。

目的基因和内参照之间的大小比例可以根据爱好和胶的浓度、分辨率调整的。

如果是250，则相差100bp 很好，如果4、500则差个200bp也可以。

内参照:每一次一定要做内参。

不管多少样品，内参不作，等于说比较珠穆朗玛峰和泰山的高度一样，没有海拔，泰山从地面的高度和珠穆朗玛峰从青藏高原的高度没什么差别。

现场快速检测题

快速检测：包括样品制备在内，能够在短时间内出据检测结果的行为称之为快速检测。

实验室快速检测方法：检测全过程在两小时以内，为实验室快速检测方法。

侧重于挖掘现有设备潜力、更新仪器设备以及改变样品前处理方式。

现场快速检测方法：现场检测在30分钟内出具检测结果，为现场快速检测方法。

侧重于将一切可以利用的手段从实验室拿到现场使用。

现场快速检测结果的表述1 检测方法1.1 定性检测：即快速地得出被检样品中是否含有有毒有害物质，或其本身就是有毒有害物质。

1.2 限量检测：即快速地得出被检样品中有毒有害物质是否超出标准规定值或有效物质是否达到标准规定值。

1.3 半定量检测：能够得出所测物质成分的大概含量，有利于结果的判断。

1.4 定量检测：也称全定量检测，一般在实验室中进行。

有些现场检测方法，其本身也属定量检测范畴，如温度、湿度、消毒间紫外线辅照强度等物理指标的检测。

2 定性检测表述形式2.1 阴性：表示用本方法未检出要检测的物质。

2.2 阳性：通常用来表示检出了有毒有害物质。

3 限量检测表述形式3.1 合格：表示检测结果在标准规定值范围之内。

3.2 不合格：表示检测结果超出或达不到标准规定值。

4 半定量与定量检测表述形式：与限量检测相同，也可标出具体数值。

1、急性中毒物质：通常是以LD50（半数致死量）加以区分。

通俗是指毒性较强的物质，当人体摄入一定剂量后，在几分钟或数小时即可出现中毒症状。

2、慢性伤害物质：是指与急性中毒物质相比在同等剂量的情况下毒性弱一些的物质，当人体摄入同等剂量时不会很快出现中毒症状，当毒性物质在人体中积累到一定程度时才显现出不良体征。

引发食品安全问题的主要原因1 食物在加工、贮存或运输过程中被污染。

2 食物在贮藏过程中腐败变质、分解产生有毒物质。

3 食物中残留有毒物质或食物本身含有有毒物质。

4 人为掺入了不该掺入的物质或过量掺入了对人体有危害的物质。

5 误食、误用有毒物质。

6 自杀或投毒等。

食品安全检测面试题

食品安全检测面试题一、单项选择题1、下列类农药不是农药速测卡的常检农药种类?A、有机磷B、有机氯C、氨基甲酸酯2、试剂保管时应注意以下因素?A、高温热源B、潮湿C、阳光照射D、密封E、以上都是3、具有很好的漂白、抗氧化和防腐等作用，还能掩盖发霉的蜜栈半成品、银耳和虾仁等霉斑。

A、二氧化硫B、二氧化碳C、硫化氢4、酱腌菜由于腌制、储存或加工不当，会含有高浓度的。

A、亚硝酸盐B、硝酸盐C、亚硫酸盐5、甲醛检测时，以下食品应作为最重点的检测与监管对象?A、水发品、血制品B、鲜香菇C、干香菇D、豆制品;6、硫磺燃烧时可产生气体，可使食品表面颜色显得白亮，鲜艳，有漂白和保鲜食品作用。

A、二氧化碳B、二氧化硫C、硫化氢7、以下样品浸泡液不需再处理就可直接用于检测?A、有明显可见色泽B、混浊或有悬浮物;C、澄清透明D、以上都不是。

8、下列物质中属于食品添加剂的是。

A、甲醛B、二氧化硫C、硼砂D、吊白块9、食品加工添加吊白块是利用其分解产生的具有增加食品弹性，亚硫酸盐有漂白食品的作用。

A、甲醛B、二氧化硫C、亚硫酸盐10、以下食品用工业双氧水处理后，对人体危害最大的是。

A、干果类;B、干制水产;C、病死禽畜肉;D、牛奶11、鱼丸、肉丸比较可能还有的含有的有毒物质是。

A、甲醛B、二氧化硫C、硼砂D、亚硝酸盐12、国家标准肉肠的亚硝酸盐含量为≤ mg/kg。

A、30B、70C、10D、5013、食品检测采样时，根据样品作用可以分为试验样品、复验样品、。

A、原始样品B、平均样品C、保留样品14、仪器快速检测西式火腿样品的亚硝酸盐含量为98mg/kg时，适宜的处理方法为。

A、提出警告B、查封食品C、取样送检D、暂停销售，取样复检15、根据《浙江省流通领域商品质量快速定性检测规则》规定，检测点每周检测不少于，每天检测样品不少于批次，全年检测样品不少于批次。

A、5天、12个、3500个B、5天、8个、2500个C、5天、10个、4000个D、5天、15个、5000个二、判断题(对的打√，错的打×)1、37%左右的甲醛溶液俗称“福尔马林”，医学上用于尸体和样品的防腐，水产品和水发品浸泡甲醛有保鲜和提高感官质量的效果。

定性,半定量,定量概念结果表述方法

定性概念结果表述方法是指通过观察和描述实验结果来描述实验结果，而不是使用数字。

例如，定性概念结果表述方法可以用来描述一种物质的颜色、形状、气味等特征。

半定量概念结果表述方法是指使用数字来描述实验结果，但不使用精确的数字，而是使用比较的方式来描述实验结果。

例如，半定量概念结果表述方法可以用来描述一种物质的溶解度，可以比较它的溶解度是“高”还是“低”。

定量概念结果表述方法是指使用精确的数字来描述实验结果。

例如，定量概念结果表述方法可以用来描述一种物质的比重，可以指定它的比重是多少。

半定量检测与表述

火锅（麻辣烫）底料,5分钟，定性
粉丝、肉（鱼、虾）丸等，15分钟，半定量，试剂法食用菌、农产品等，1分钟，台式机
现场快速检测的形式
随身携带型组合检测箱流动检测车简易实验室
仪器
仪器+试剂
一次性试剂或试纸
随身携带型
ATP测量仪
紫外线照度仪
食品中心温度计
组合检测箱
流动检测车
简易实验室
2.2 用试管显色的深浅来半定量：如亚硝酸盐、甲醇、二氧化硫等，比色定量可以是目视，也可以用便携式光度计。
3 便携式仪器法
如便携式甲醇速测仪、酸度计、电导仪、温湿度计、中心温度计、食用油极性测定仪、辐照度计、ATP荧光度仪等。
现场快速检测结果表述
➢ 定性检测与表述即快速地得出被检样品中是否含有有毒有害物质，或其本身就是有毒有害物质。通常以阴性或阳性来表述。阴性表示用本方法未检出要检测的物质。阳性表示检出了有毒有害物质。
现场快速检测是重大活动保障与应急事件处理的有效措施：现场第一时间快速筛查、发现食物安全风险隐患和食物中毒可疑因子，快速检测有其特殊作用可以利用。
快速检测的时间概念
快速检测没有明确的时间限制，但基本上有一种共识，即：理化快速检验方法：包括样品制备在内，能够在两小时以内出具检测结果，即可视为实验室快速检测方法。如果方法能够应用于现场，在30 分钟内出具检测结果，即可视为现场快速检测方法。如果能够在10几分钟甚至几分钟内得到检测结果，可视其为比较理想的现场快速检测方法。微生物快速检验方法：与传统检验方法相比，能够大幅度缩短检测时间，其检测结果基本相同或相近的方法，可视为快速检测方法。
过氧化氢检测管
9 亚硝酸盐
亚硝酸盐检测管