抗荧光衰减封片剂(AntifadeSolution)
DAPI-抗荧光淬灭封片剂
DAPI-抗荧光淬灭封片剂
产品编号：F-0045 规格：10ml
产品简介
DAPI即4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole)，它能与DNA结合，在紫外光下可观察到蓝色荧光，最大吸收波长为358nm，最大发射波长为461nm。
使用范围
本产品为即用型工作液，无须稀释，直接用于FISH、IF、TUNEL等细胞核的荧光染色。
储存条件
-20℃，避光
本产品需要严格避光，可放于铝饭盒中或用锡纸包裹。
本产品为淡黄色粘稠液体，由于其中的抗荧光淬灭成分会吸收光，使用时间长后，液体会慢慢变深，最终为变为深褐色时，请勿使用。
使用方法
FISH
杂交结束，标本经过洗液洗涤、再经梯度酒精脱水、干燥，直接在标本上滴加10～20μl DAPI，加上盖玻片，室温下，大约20分钟后可观察荧光。
IF
孵育二抗结束，PBS洗涤后，直接在标本上滴加10～20μl DAPI，加上盖玻片，避光，室温下，大约20分钟后可观察荧光。
注意：
本产品含有甘油、抗荧光淬灭剂，也具备封片作用，在细胞核染色后，无须清洗，可减缓荧光淬灭，在严格避光情况下，4℃保存一周，荧光仍不会淬灭。
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广州市外显子生物技术有限公司
广州市海珠区敦和路189号留学人员创业基地1栋308室
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DAPI染色封片剂
北京雷根生物技术有限公司
DAPI 荧光封片剂
简介：
DAPI 荧光封片剂是一种专门用于染色体C 带的DA-DAPI 染色的减缓荧光淬灭的封固剂。
DA 和DAPI 易与A-T 碱基对结合，DAPI 染色可同时检测C 带和G 带，进行DA 对比染色后图像荧光强度减弱，只能特异的C 带呈强荧光染色。
按每个样本需要50～100μl 封片剂计算，5ml 可以用于至少50样本的封片。
组成：
操作步骤(仅供参考)：
1、 染色样本用DA 染色液染色，McIlvaine 缓冲液轻轻清洗。
2、 DAPI 染色液染色，McIlvaine 缓冲液轻轻清洗。
3、 滴一滴DAPI 荧光封片剂于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片，让细胞接触封片液，尽
量避免气泡封片。
4、 用透明黏合剂密封盖玻片。
注意事项：
1、 荧光物质均易发生淬灭，染色后的样品宜避光保存。
2、 在使用DAPI 荧光封片剂的情况下，虽然可减缓淬灭，仍需尽量避光。
3、 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
编号 名称 DZ0125 Storage DAPI 荧光封片剂 10ml 4℃ 避光 使用说明书 1份。
TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(显色法)说明书
TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒(显色法)产品编号 产品名称包装 C1098TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒(显色法)50次产品简介：碧云天生产的显色法TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒(Colorimetric TUNEL Apoptosis Assay Kit)为您提供了一种高灵敏度又快速简便的细胞凋亡检测方法。
对于待检测的细胞或组织样品，经过生物素标记和后续的DAB 显色等步骤，即可在普通光学显微镜下观察到凋亡细胞。
细胞在发生凋亡时，会激活一些DNA 内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA 。
细胞凋亡时抽提DNA 进行电泳检测，可以发现180-200bp 的DNA ladder 。
基因组DNA 断裂时，暴露的3'-OH 可以在末端脱氧核苷酸转移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT)的催化下加上生物素(Biotin)标记的dUTP(Biotin-dUTP)，随后和辣根过氧化物酶(HRP)标记的Streptavidin (Streptavidin-HRP)结合，最后在HRP 的催化下通过DAB 显色来显示凋亡细胞，从而可以通过普通光学显微镜检测到凋亡的细胞，这就是TUNEL(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)法检测细胞凋亡的原理。
本试剂盒有如下优点。
(1) 高灵敏度：背景染色极低，阳性染色强，可以在单细胞水平检测到细胞凋亡，同时由于凋亡早期就有DNA 断裂，可以检测到早期的细胞凋亡。
(2) 特异性好：TUNEL 检测时通常更容易标记凋亡细胞，而不容易标记坏死细胞。
(3) 快速：仅需约2-3个小时即可完成。
(4) 应用范围广：可以用于检测冷冻或石蜡切片中的细胞凋亡情况，也可以检测培养的贴壁细胞或悬浮细胞的凋亡情况。
(5) 实测效果好：参考图1。
图1. 本试剂盒的检测效果图。
A. HeLa 细胞未处理或用DNase I 室温孵育10分钟后的检测效果图。
抗荧光衰减封片剂 (Antifade Solution)
抗荧光衰减封片剂(Antifade Solution)SC1210 5 ml 200 元10 ml 350 元概述：抗荧光衰减封片剂以高纯度甘油为介质，内含抗荧光淬灭剂，有强烈的抗荧光衰减作用，用于对荧光组织和细胞样品的封片。
样品封片后4ºC或－20ºC避光保存2-3周，可最大限度延长荧光持续时间和维持荧光发光强度，同时封片剂中的其它成分有助于保持组织抗原抗体处于结合状态。
适用于所有光谱范围的荧光如FITC，Cy2, Cy3, Rhodamine, Texas Red, Cy5, Cy7，DAPI, AMCA, R6G, Hoechst 33258 and 33342。
适用：1. 组织细胞免疫荧光组织化学染色样品封片；2. 染色体荧光观察封片；3. 核酸荧光原位杂交样品封片。
对所有光谱范围的荧光均有抗衰减作用，如FITC，Cy2, Cy3, Rhodamine, Texas Red, Cy5, Cy7，DAPI, AMCA, R6G, Hoechst 33258 and 33342。
使用方法：1. 吸去载玻片上的液体，略微晾干残留液体。
2. 取约20µl封片试剂滴加在载玻片的样品处。
也可取适量直接加到细胞培养孔内。
3. 盖上盖玻片。
盖玻片规格为24 x 24 mm或24 x 60 mm大小。
4. 轻轻压盖玻片，用滤纸小心吸除盖玻片周围多余液体，室温放置数分钟。
5. 直接进行荧光显微镜观察。
片子于4ºC或－20ºC避光保存2周，荧光无明显衰减。
6. 如需永久封片可用市售指甲油封固盖玻片周围，但通常这样做并无必要。
规格：5 ml或10 ml包装，每一24 x 24 mm盖玻片用约10-20µl。
储存：自然温度运输，收到后－20ºC避光保存。
组织自发荧光淬灭剂AutoFluo QuencherSC1212 20 ml 200 元概述：许多组织会产生可透过各种波长滤光片的内源性自发荧光，显著干扰抗体标记荧光观察甚至导致荧光组化染色失败。
FISH技术全攻略
FISH（荧光原位杂交）技术全攻略荧光原位杂交技术（Fluorescence in situ hybridization，FISH）是一种应用非放射性荧光物质依靠核酸探针杂交原理在核中或染色体上显示核酸序列位置的方法。
该技术问世与70年代中期左右，其曾多于与染色体异常的研究，近年来随着FISH探针种类的不断增多，使得该技术逐步应用于各种领域。
该技术具有快速，安全，灵敏度高以及探针可长期保存等特点，目前已广泛应用于细胞遗传学，肿瘤生物学，基因定位，基因作图，基因扩增及分子诊断等领域。
1对于FISH操作来说，那些因素比较重要？在FISH中最重要的因素是温度、光照、湿度和各种试剂的PH值。
温度和湿度直接影响着探针和目标DNA的杂交效率；光照影响了荧光染料的强度，因此探针要避光保存，其已经杂交的片子可用防荧光淬灭剂封片且避光保存；各种试剂pH也要精确达到要求，这也直接关系到FISH的稳定性。
2 如何保证FISH操作中的温度？最佳的措施是使用一些FISH的专用仪器进行操作，如Vysis的Hybrit FISH杂交仪。
如果是手工操作，首先要对FISH操作过程中可能使用的一些仪器进行温控能力的检查，如水浴锅、孵箱，对其中不符合要求的要进行更换（疾病诊断中的探针要求温控精度在0.5度以内）。
其次，要尽可能地保持操作环境温度在20度以上，对于在冬季进行的FISH操作尤为重要。
此外对于需要预热以达到要求温度的试剂，在使用前必须使用温度计对其进行测温。
同时检测的样本最好不能超过4块。
操作中的行动一定要迅速。
操作者还往往忽视一些小部件的温度，诸如载玻片和盖玻片。
特别是在冬季，盖玻片本身温度就低，加之探针的量本就不多（10ul），因此事先没有预热的盖玻片会使得杂交液的温度急剧下降严重地影响了探针和目标DNA的杂交效率。
因此对上述小部件的要进行预热处理，不然会影响FISH 的杂交效果。
3 使用荧光显微镜观察结果时，最初有清晰而明亮的信号，但随后信号急剧衰减，几分钟后信号就消失了。
TUNEL染色
相关疾病：•产品名称：罗氏(Roche)公司Tunel试剂盒英文名称：Tunel产品货号：产品规格：50T试剂级别：试剂级产品产地：USA产品商标：RocheIn situ cell death detection kit-POD法一、原理：TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）细胞凋亡检测试剂盒是用来检测组织细胞在凋亡初期进程中细胞核DNA的断裂情形。
其原理是荧光素（fluorescein）标记的dUTP 在脱氧核糖核苷酸结尾转移酶（TdT Enzyme）的作用下，能够连接到凋亡细胞中断裂DNA的3’-OH结尾，并与连接辣根过氧化酶（HRP，horse-radish peroxidase）的荧光素抗体特异性结合，后者又与HRP底物二氨基联苯胺（DAB）反映产生很强的颜色反映（呈深棕色），特异准确地定位正在凋亡的细胞，因此在光学显微镜下即可观看凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA断裂，因此没有3‘-OH形成，很少能够被染色。
本试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片）在单细胞水平上的凋亡原位检测。
还可应用于抗肿瘤药的药效评判，和通过双色法确信细胞死亡类型和分化时期。
二、器材与试剂器材：光学显微镜及其成像系统、小型染色缸、湿盒（塑料饭盒与纱布）、塑料盖玻片或封口膜、吸管、各种规格的加样器及枪头等；试剂：试剂盒含TdT 10×、荧光素标记的dUTP 1×、标记荧光素抗体的HRP；自备试剂：PBS、双蒸水、二甲苯、梯度乙醇（100、95、90、80、70%）、DAB工作液（临用前配制，5 μl 20×DAB+1μL 30%H2O2+94 μl PBS）、ProteinaseK工作液（10-20 μg/ml in 10 mM Tris/HCl，pH ）或细胞通透液（% Triton X-100 in % sodium citrate，临用前配制）、苏木素或甲基绿、DNase 1（3000 U/ml– 3 U/ml in 50 mM Tris-HCl，pH ，10 mM MgCl2，1 mg/ml BSA）等。
防止细胞荧光淬灭的方法
防止细胞荧光淬灭的方法
选择合适的荧光染料和荧光蛋白：使用与荧光显微镜的激发波长和发射波长相匹配的荧光染料和荧光蛋白进行细胞成像。
降低激发光的强度：尽可能降低激发光的强度，减少曝光时间。
避免长时间暴露：避免长时间将样品暴露在“无用”的光照条件下，例如在没有收集数据时在镜下长时间观察。
使用抗荧光淬灭封片剂：为尽量减少实验样品的光漂白，可以使用抗荧光淬灭封片剂，以提高活细胞和固定细胞样品中荧光染料的光稳定性。
使用荧光淬灭剂：荧光淬灭剂中的离子可通过碰撞方式，捕获自发荧光光源分子发出的电子，阻止该电子从激发态回归基态和能量释放，从而淬灭自发荧光。
使用Evan’s蓝或者台盼蓝：可以采用0.001%或至0.1%浓度的Evan’s蓝或者台盼蓝染色，这种物质会均匀分布到组织或者细胞上，它能够结合不必要的固有荧光物质或背景性荧光物质，显著减少自发荧光。
免疫荧光层析试剂信号弱
免疫荧光层析试剂信号弱免疫荧光层析试剂（immunofluorescence assay reagents）是一种常用的实验工具，用于检测和研究生物样品中特定分子的存在和定量。
然而，有时候我们可能会遇到免疫荧光层析试剂信号弱的情况，这给我们的实验带来了一定的挑战。
信号弱可能是由多种原因造成的。
首先，可能是样品中目标分子的浓度较低。
在样品中，目标分子的浓度越低，与试剂结合的机会就越少，从而导致信号弱。
此外，样品中存在其他干扰物质也可能会影响信号的强度。
这些干扰物质可能与试剂结合，使得试剂与目标分子结合的机会减少，进而导致信号减弱。
另外，试剂的质量也会对信号强度产生影响。
如果试剂的纯度不高或保存不当，可能会导致信号弱。
为了解决信号弱的问题，我们可以采取一些策略。
首先，可以尝试增加目标分子的浓度。
这可以通过对样品进行浓缩或纯化来实现。
其次，我们可以优化试剂的使用条件。
例如，调整试剂的浓度、温度和反应时间等参数，以提高试剂与目标分子的结合效率。
此外，我们还可以尝试使用其他更敏感的检测方法，如放射免疫测定法（radioimmunoassay）或酶联免疫测定法（enzyme-linked immunosorbent assay），以提高信号的强度。
最后，我们还可以选择更高质量的试剂供应商，确保试剂的质量可靠。
除了以上策略，我们还可以通过优化实验步骤来改善信号弱的问题。
首先，我们可以仔细选择样品的处理方法，确保样品中的目标分子不会受到损坏或降解。
其次，我们可以优化固定和染色步骤，确保试剂与目标分子的结合效率最大化。
此外，我们还可以优化显微镜的设置，如调整曝光时间和增益等参数，以提高信号的可见性。
在实验过程中，我们还需注意一些可能导致信号弱的常见错误。
首先，我们应该避免使用过期的试剂，因为过期的试剂可能会导致信号弱。
其次，我们应该避免使用不适当的控制组，以确保我们的实验结果可靠。
此外，我们还应该注意实验条件的一致性，如温度、湿度和pH值等，以减少不确定性因素对信号的影响。
抗荧光衰减封片剂(含DAPI)说明书
抗荧光衰减封片剂（含DAPI）说明书货号：S2110规格：5ml/25ml保存：-20℃保存，一年有效。
产品简介：抗荧光衰减封片剂是一种用于减缓荧光衰减的封片试剂。
以甘油为基础，加入抗荧光衰减剂，有强烈的抗荧光衰减作用，用于对荧光组织和细胞样品的封片。
封片后，样品4℃或者-20℃避光可保存2-3周。
本试剂操作简单，在封片时用移液枪滴一滴抗荧光衰减封片液，盖上盖玻片就可以了。
抗荧光衰减封片剂内含DAPI即4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole)，是一种能够与DNA强力结合的荧光染料，常用与荧光显微镜观测。
因为DAPI可以透过完整的细胞膜，它可以用于活细胞和固定细胞的染色，显微镜下可以看到显蓝色荧光的细胞。
DAPI和双链DNA结合后，最大激发波长为360nm，最大发射波长为460nm。
使用说明：使用前平衡至室温。
1.贴壁细胞样品：A.染色完毕后，吸尽液体。
B.滴一滴(20-50ul)抗荧光衰减封片液于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片，让细胞接触封片液，尽量避免气泡。
C.随后即可通过荧光显微镜观察样品。
2.组织切片：A.染色完毕后，吸尽液体。
B.滴一滴(20-50ul)抗荧光衰减封片液于组织切片上，盖上盖玻片，让切片接触封片液，尽量避免气泡。
C.随后即可通过荧光显微镜观察样品。
3.其它样品：其它样品参考细胞样品或组织切片进行操作。
注意事项：1.荧光物质均易发生衰减，染色后的样品宜避光保存。
2.在使用抗衰减封片液的情况下可以减缓衰减，但仍宜尽量避光和尽早拍照。
3.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
抗荧光淬灭封片剂配方
抗荧光淬灭封片剂配方一、简介抗荧光淬灭封片剂是一种用于荧光显微镜下观察细胞的试剂。
在荧光显微镜下，由于荧光分子的不可逆性猝灭作用，会导致样品中的荧光信号逐渐减弱或消失，影响观察效果。
抗荧光淬灭封片剂可以有效地减轻这种猝灭作用，提高样品中荧光信号的稳定性和持久性。
二、配方1. PVA（聚乙烯醇）：PVA是本试剂的主要成分之一，在封片剂中起到增稠、降低表面张力、防止气泡生成等作用。
常见的PVA型号有17-88和10-98两种，前者的粘度较低，后者较高。
2. Glycerol（甘油）：甘油是一种具有保湿性质的化合物，在本试剂中起到保持细胞膜完整性、减少蒸发和挥发等作用。
3. DABCO（1,4-二氨基环己烷）：DABCO是一种具有活性氮原子的化合物，在本试剂中起到抗荧光淬灭的作用。
它可以与氧气、水和其他有机分子形成复合物，从而减少荧光分子的不可逆性猝灭作用。
4. PBS（磷酸盐缓冲液）：PBS是一种缓冲液，可以调节试剂的pH 值，使其适合于细胞生长和显微镜观察。
5. DAPI（4',6-二氨基-2-苯基吡啶）：DAPI是一种DNA染料，在本试剂中起到标记细胞核的作用。
它可以与DNA结合，发出蓝色荧光。
6. Mounting medium（封片剂）：封片剂是一种用于固定细胞和显微镜观察的介质。
常见的封片剂有DABCO、Vectashield等。
三、制备方法1. 加入PVA：将适量的PVA加入PBS中，并在50℃下搅拌至完全溶解。
2. 加入甘油：将适量的甘油加入PVA溶液中，并搅拌至均匀混合。
3. 加入DABCO：将适量的DABCO加入甘油-PVA溶液中，并搅拌至均匀混合。
4. 加入DAPI：将适量的DAPI加入甘油-PVA-DABCO溶液中，并搅拌至均匀混合。
5. 制备封片：将制备好的样品滴在载玻片上，加入适量的封片剂，然后用盖玻片覆盖。
最后用胶水固定盖玻片。
四、注意事项1. 避免过度搅拌：过度搅拌会使PVA分子链断裂，导致溶液黏度降低。
免疫荧光技术
免疫荧光双标技术中操作要点和注意事项一、免疫荧光技术中标本制作的基本程序近似于酶免疫组化，不同点如下：1、免疫荧光不需要使用双氧水处理，封闭和一抗孵育与其相同。
2、免疫荧光的二抗使用不同荧光标记的二抗孵育，孵育时间根据抗体的工作浓度确定。
3、二抗孵育之后充分洗片后即可贴片、封片和观察。
4、免疫荧光在封片时常使用专用封片剂或甘油：0.01M PBS （1：1）。
条件许可，建议购买抗淬灭的封片液，使标本可以保存更久。
5、荧光抗体的孵育以及后续处理需要避光。
6、荧光抗体染色假阳性可能会多，需要分别设定阳性和阴性对照。
二、注意事项1、荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4℃保存4h，时间过长，可能会使荧光提前衰退。
2、每次试验均需设置以下三种对照：（1）阳性对照：阳性血清+荧光标记物；（2）阴性对照：阴性血清+荧光标记物；（3）荧光标记物对照：PBS+荧光标记物。
三、免疫荧光双标的经验之谈1、选取一抗时，要求来源于两种不同的动物，我用的是来源于家兔和大鼠的抗体，二抗则是不同荧光信号标记的，我用的是donkey anti-rabbit-FITC（绿）和donkey anti-rat-Tex-Red （红）。
2、我的做法是两种一抗同时孵育，然后两种二抗同时孵育。
抗体浓度、孵育时间要自我摸索，我感觉一抗4℃孵育过夜比较好，背景比较清晰。
3、我的阳性对照采用的是阳性组织切片，阴性对照则分别是家兔和大鼠的IgG，荧光标记物对照是PBS+荧光标记物。
4、封闭血清是二抗来源动物的正常血清，我用的是10%正常donkey血清。
5、其余事项同免疫荧光单标操作。
免疫荧光的标本制作的基本程序同DAB显色的免疫组化：不同的是1 免疫荧光不需要使用双氧水处理，封闭和一抗孵育与其它相同2 免疫荧光的二抗使用不同荧光标记的二抗孵育，孵育时间根据抗体的工作浓度确定3 二抗孵育之后充分洗片后即可贴片、封片和观察4、免疫荧光在封片使用专用封片剂或甘油：0.01MPBS （1：1）5 条件许可可以购买防淬灭的试剂加入封片剂中，标本可以保存更久6荧光抗体的孵育以及后续处理需要闭光87荧光抗体染色假阳性可能会多，需要设定阳性和阴性对照注意事项1. 荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4℃保存4h，时间过长，会使荧光减弱。
抗荧光衰减封片剂(含 DAPI)使用说明
抗荧光衰减封片剂（含DAPI）使用说明货号：S2110规格：5ml/25ml保存：-20℃保存，一年有效。
产品简介：抗荧光衰减封片剂是一种用于减缓荧光衰减的封片试剂。
以甘油为基础，加入抗荧光衰减剂，有强烈的抗荧光衰减作用，用于对荧光组织和细胞样品的封片。
封片后，样品4℃或者-20℃避光可保存2-3周。
本试剂操作简单，在封片时用移液枪滴一滴抗荧光衰减封片液，盖上盖玻片就可以了。
抗荧光衰减封片剂内含DAPI即4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole)，是一种能够与DNA强力结合的荧光染料，常用与荧光显微镜观测。
因为DAPI可以透过完整的细胞膜，它可以用于活细胞和固定细胞的染色，显微镜下可以看到显蓝色荧光的细胞。
DAPI和双链DNA结合后，最大激发波长为360nm，最大发射波长为460nm。
使用说明：使用前平衡至室温。
1.贴壁细胞样品：A.染色完毕后，吸尽液体。
B.滴一滴(20-50ul)抗荧光衰减封片液于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片，让细胞接触封片液，尽量避免气泡。
C.随后即可通过荧光显微镜观察样品。
2.组织切片：A.染色完毕后，吸尽液体。
B.滴一滴(20-50ul)抗荧光衰减封片液于组织切片上，盖上盖玻片，让切片接触封片液，尽量避免气泡。
C.随后即可通过荧光显微镜观察样品。
3.其它样品：其它样品参考细胞样品或组织切片进行操作。
注意事项：1.荧光物质均易发生衰减，染色后的样品宜避光保存。
2.在使用抗衰减封片液的情况下可以减缓衰减，但仍宜尽量避光和尽早拍照。
3.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
相关试剂：P11128%多聚甲醛P11104%多聚甲醛P210010×多聚赖氨酸A1840荧光抗体稀释液SF8羊抗兔IgG-FITC。
免疫荧光检测
免疫荧光SOP一．总纲（一）技术原理免疫荧光技术（immunofluorescence，IF）。
基本原理是抗原与抗体特异性结合，具体为带荧光标记的抗体在组织细胞上与抗原特异性结合，在荧光显微镜下，对抗原进行定性、定位和定量检测的技术。
（二）研究进展二．实验操作免疫荧光基本操作流程如下：（一）切片脱蜡水化脱蜡水化的目的是将石蜡包裹住的抗原暴露于与抗体结合的水环境中，便于两者结合。
若脱蜡和水化不全，则易出现局灶性反应和浸洗不全，而产生非特异性背景着色。
1.实验操作如下：（1）烤片：将石蜡切片置于烤箱中烤片60min；（2）脱蜡：入二甲苯5min×3；（3）水合：100%乙醇，5min×2；95%乙醇5min；70%乙醇5min；ddH2O浸洗5min×2。
2.技术要点：（1）注意无水乙醇和二甲苯的新旧程度，若出现雾状，则需及时更换；（2）60℃烘箱烤片时间勿过久（二）抗原修复与封闭液封闭由于固定液和石蜡导致组织蛋白的氨基酸残基在分子内或分子间形成醛基，或发生蛋白交联，导致蛋白质三级结构或四级结构改变，出现空间位阻，从而封闭抗原决定簇，阻碍抗体与抗原的结合。
因此，需要进行抗原修复暴露抗原。
修复方法有很多种，常见的为高温高压修复法。
封闭目的为细胞表面（特别是淋巴造血组织、淋巴细胞、单核细胞等）存在Fc受体，可与抗体（Ig）结合，形成非特异性染色。
主要是与二抗的非特异性结合。
可用5%二抗来源动物种属的正常血清或5%BSA，可避免抗体蛋白吸附于组织切片中高电荷的胶原和结缔组织成分上，用于封闭组织切片的蛋白疏水基团。
1.实验操作如下：抗原修复以高温高压修复为例。
实验材料：柠檬酸盐组织抗原修复液（福州迈新），EDTA高温抗原修复（福州迈新），电压力锅（美的MY-12CH402A）A.柠檬酸盐高压抗原修复：（1）将商品化的柠檬酸盐缓冲液按说明书进行稀释，并调节pH至6.0；（2）将装有抗原修复液的修复盒置于已装有自来水的高压锅中，大火加热至沸腾；（3）将水化后的切片置于修复液中，盖上锅盖，扣上压力阀，继续加热中喷气，此时开始计时5min，压力锅断开电源，开气阀开盖；（4）取出修复盒自然冷却至室温。
细胞免疫荧光实验步骤.docx
第一天：1. 在培养板中将已爬好细胞的玻片用PBS浸洗3次,每次3min；2. 用4%的多聚甲醛固定爬片15min, PBS浸洗玻片3次,每次3min；3. 0.5%Triton X-100( PBS配制 )室温通透20min（细胞膜上表达的抗原省略此步骤）；4. PBS浸洗玻片3次,每次3 min,吸水纸吸干PBS,在玻片上滴加正常山羊血清,室温封闭30min；5. 吸水纸吸掉封闭液,不洗,每张玻片滴加足够量的稀释好的一抗并放入湿盒,4℃孵育过夜；第二天：6. 加荧光二抗：PBST 浸洗爬片3次,每次3min,吸水纸吸干爬片上多余液体后滴加稀释好的荧光二抗,湿盒中20-37℃孵育1h,PBST浸洗切片3次,每次3min；注意：从加荧光二抗起,后面所有操作步骤都尽量在较暗处进行。
7. 复染核：滴加DAPI避光孵育5min,对标本进行染核,PBST 5min×4次洗去多余的DAPI；8. 用吸水纸吸干爬片上的液体,用含抗荧光淬灭剂的封片液封片,然后在荧光显微镜下观察采集图像。
细胞免疫荧光步骤1.在24孔板里加500微升培养基,放爬片,接种细胞（做实验以30-50%汇合度较好。
10000-30000左右2.给药处理24h。
3.PBS洗三遍。
4. 4％冷的多聚甲醛固定15分钟,PBS洗三遍,每次5min,摇床。
（避光）5.0.5％Triton X－100（PBS配）破膜15min,PBS洗三遍,每次5min,摇床。
6.5%BSA（牛血清白蛋白,PBS配）封闭60分钟,不用洗。
7.加一抗孵育（5%BSA配）,4℃摇床过夜。
8. 收集一抗,PBS洗三遍,每次5min,摇床。
孵育二抗Alexa Fluor 488（1:1000 ）,室温60min（避光）9. 回收二抗,PBS洗三遍,摇床,每次5min。
10. 0.5ug/mLDAPI（5%BSA配,2滴/ml）染核15min。
（避光）11. PBS洗三遍,每次5min,摇床。
荧光原位杂交常见问题解析
荧光原位杂交常见问题解析荧光原位杂交常见问题解析1.如何保证荧光原位杂交（FISH）操作中的温度？最好的办法是用荧光原位杂交的专用仪器进行操作，如Vysis的Hybrit FISH杂交仪。
如果是手工操作，(1)对荧光原位杂交操作过程中可能使用的一些仪器（如水浴锅、孵箱）进行温控检查，不符合要求的进行更换（疾病诊断中的探针要求温控精度在0.5度以内）;(2)尽可能地保持环境温度在20度以上;(3）针对需要预热以达到要求温度的试剂，在使用前必须使用温度计对其进行测温(4)同时检测的样本最好不超过4块，且操作中一定要迅速。
实验人员往往忽视一些小部件（诸如载玻片和盖玻片）的温度。
尤其是在冬季，盖玻片本身温度就低，加之探针的量本就不多（10ul），这样事先没有预热的盖玻片会使得杂交液的温度急剧下降，从而严重降低探针和DNA的杂交效率。
2.能对同一样本进行多次的荧光原位杂交操作吗？一般情况下，如果操作没有得到理想的结果，是可以将探针洗涤然后进行再次的杂交的。
如果使用的是直标型探针，还可以使用不同探针对同一样本进行反复杂交。
针对不同的样本，处理方法略有不同。
外周血样本的处理：1、使用镊子小心地揭去杂交区的盖玻片2、将样本片浸泡于70％、85％和100％的乙醇中各一分钟以便充分脱水。
待片子风干后就可以进行二次杂交了。
二次杂交中建议将变性的时间缩短一半，但不能少于3分钟。
如果对同一样本还要进行三次杂交，变性的时间就无需减少了。
对于多次杂交，复染液浓度的降低有利于保持探针的亮度。
曾有报道称在同一样本片上进行了多达8次的FISH操作。
如何配制各种试剂呢？根据我们的经验，强烈推荐使用灭菌去离子水配制各种所需的试剂。
另外，配制后使用pH计检测试剂是否符合实验要求。
配制的各种试剂都要采用超纯级要求。
每次荧光原位杂交（FISH）实验使用新的试剂，旧的试剂最好弃置不用。
洗脱液和变性液当天用当天配。
3.使用荧光显微镜观察结果时，最初有清晰而明亮的信号，但随后信号急剧衰减，几分钟后信号就消失了。
细胞免疫荧光染色操作步骤
细胞免疫荧光染色操作步骤免疫荧光染色的主要原理是利用抗原抗体之间的特异性结合来显示目的蛋白，主要包括蛋白和一抗结合，其次是带有荧光基团的二抗识别并结合一抗，荧光显微镜下即可观察到荧光。
实验步骤如下：1.已转染72h的细胞种于共聚焦专用培养皿里，冰PBS洗三遍，每次5分钟。
2. 细胞半干时，覆盖以4%冷的多聚甲醛固定15分钟，避光。
3.吸去多聚甲醛后，用冰PBS洗三遍，每次5分钟。
4. 0.5%Triton X-100覆盖细胞10分钟，冰PBS洗三遍，每次5分钟。
5. 与二抗相同宿主的血清？进口胎牛血清室温封闭30分钟。
6. 配制一抗（SAB2104246-50UG, Sigma, USA）：SAB+FBS=1:200。
7.加入一抗覆盖细胞，锡纸包裹4度避光过夜。
次日：8.取出细胞复温至室温约1h。
9.冰1‰Tween洗两次，每次5分钟，于摇床。
冰PBS洗一次，5分钟，于摇床。
10.配制荧光标记二抗：Ab50598 Goat anti-rabbit IgG(H&L) TRITC，用PBS或FBS配制。
浓度1:20011.加入二抗，室温孵育1小时(避光)。
12. 冰1‰Tween洗两次，每次5分钟，于摇床。
冰PBS洗一次，5分钟，于摇床。
13.DAPI染核，每皿1滴，完全覆盖住细胞即可。
14. 冰1‰Tween洗两次，每次5分钟，于摇床。
冰PBS洗一次，5分钟，于摇床。
15.加入防荧光淬灭封片剂，避光。
16.上机confocol建议：1.还是染完之后没有封片前直接照一些，因为有的时候可能封片会出现问题，再想照反而没有了，另外不要拖太长时间，荧光会淬灭的。
2.荧光的片子一定要避光保存，保存的好的话，过一段时间仍然能照出很好的片子。
3.二抗用之前一定离心，不然有的时候有那种沉淀，在片子上就是一个很大的非特异性荧光光点，非常难看。
4.不管采用何种方法，在使用PBS缓冲液漂洗时，如果结果背景较高可以延长漂洗的次数和时间。
抗荧光淬灭封片剂配方
抗荧光淬灭封片剂配方一、引言在生物荧光显微镜技术中，荧光淬灭是一个非常重要的问题。
荧光淬灭指的是在激发荧光标记的样品时，标记的荧光会随着时间的推移逐渐减弱甚至消失。
这一现象常常会干扰实验结果的观察和分析。
为了解决荧光淬灭问题，研究人员通常会使用抗荧光淬灭封片剂来抑制荧光的淬灭，使得荧光信号能够更稳定和持久地显示。
本文将围绕抗荧光淬灭封片剂配方展开探讨，介绍常用的配方组分及相关考虑。
二、抗荧光淬灭封片剂配方的组成抗荧光淬灭封片剂的配方通常包含以下几个关键组分：1. 缓冲液缓冲液在抗荧光淬灭封片剂中扮演着重要的角色。
合适的缓冲液可以维持溶液的酸碱平衡，稳定荧光标记物并减少荧光淬灭的发生。
常见的缓冲液组分包括：•Tris（三羟甲基氨基甲烷）：用作缓冲剂并维持溶液的pH值稳定。
•磷酸盐缓冲液：常用的生物学实验缓冲液，能够提供稳定的pH值。
2. 荧光稳定剂荧光稳定剂是抗荧光淬灭封片剂中的关键组分，能够减缓或阻止荧光淬灭的发生。
它们可以与氧气或其他荧光淬灭因素发生反应，从而维持荧光信号的稳定性和持久性。
常见的荧光稳定剂包括：•溴化物盐：例如溴化钾、溴化钠等，能够减缓氧气对荧光的影响并提高荧光信号的持久性。
•抗氧化剂：例如丙酮酸、谷胱甘肽等，可以抑制氧气对荧光信号的淬灭。
3. 抗褪色剂抗褪色剂也是抗荧光淬灭封片剂的重要组成部分，它们能够保护荧光标记物免受光照引起的褪色和淬灭。
常见的抗褪色剂包括：•糖：例如蔗糖、葡萄糖等，能够降低光照对荧光淬灭的影响。
•抗氧化剂：例如硫代硫酸盐、联胺等，可以减少光照引起的褪色。
4. 抑制剂某些情况下，样品中的某些成分会对荧光信号产生干扰，因此需要加入适当的抑制剂来消除干扰。
常见的抑制剂包括：•胺基甲酸酯类物质：例如二乙氨基乙酸酯（DEAE）、甲基硫醇（MEA）等，可以抑制非特异性背景信号。
三、抗荧光淬灭封片剂配方的考虑因素在选择和设计抗荧光淬灭封片剂配方时，需要考虑以下几个因素：1. 样品特性不同的样品可能对荧光淬灭存在不同的敏感性和特性。
支原体检测试剂盒的操作步骤及注意事项
支原体检测试剂盒的操作步骤及注意事项 货号：CA1080 保存：4℃保存，有效期为 2 年，Hoechst 工作液需要避光保存。 产品内容：
Hoechst 33258 工作液
50ml
固定液
50ml
抗荧光衰减封片液
10ml
说明书
1份
产品简介： 本试剂盒是利用荧光染料（bisbenzimide,Hoechst 33258）检测支原体污染。这种染料会结 合到 DNA 的 A-T 富集区域，因为支原体的 DNA 中 A-T 含量高（55％～80％），所以可将 其染色而被检测到。被支原体污染的细胞经染色后在细胞周围可看到许多大小均一的荧光小 点，即为支原体的 DNA 染色斑，说明有支原体污染。 Hoechst 33258 的最大激发波长为 346nm，最大发射波长为 460nm；Hoechst 33258 和双链 DNA 结合后，最大激发波长为 352nm，最大发射波长为 461nm。 操作步骤： 贴壁细胞： 1、被检细胞接种于无菌的 6 孔细胞培养板中，接种密度为 1-2×10 4 。同时，接种正常 无支原体感染的同种细胞，作为阴性对照。 2、5 天后，先吸去培养液，再加入 1ml 的固定液，静置 20min， 3、吸去固定液，晾干。
4、于每孔中，加入 1ml 的 Hoechst33258 工作液（Hoechst 33258 工作液须覆盖全部被检 细胞），37℃避光放置 15-20min 或室温静置 20～30min。 5、吸去 Hoechst 33258 工作液，加入 2ml 灭菌超纯水洗涤三次，直接风干。风干后加入 一滴封片液，并以盖玻片覆盖。 6、荧光显微镜观察。用紫外激发光激发，观察细胞周围是否有蓝色荧光小点或串珠状荧光 小点。 悬浮细胞： 1、收集需检测的细胞，1500rpm，5min。 2、将收集的细胞涂片于载玻片上，再加 1ml 的固定液，静置 20min。 3、吸去固定液，晾干。 4、于每孔中，加入 1ml 的 Hoechst33258 工作液（Hoechst 33258 工作液须覆盖全部被检 细胞），37℃避光放置 15～20min 或室温静置 20～30min。 5、吸去 Hoechst 33258 工作液，用无菌水洗涤玻片 3 次，直接风干。风干后加入一滴封 固液，并以盖玻片覆盖。 6、荧光显微镜观察。用紫外激发光激发，观察细胞周围是否有蓝色荧光小点或串珠状荧光 小点。 结果判断（参考）： 阴性：仅见细胞的细胞核呈现黄绿色荧光。 阳性：除细胞外，细胞周围可见大量的大小均一的荧光着色颗粒。 注意事项： 1．Hoechst 工作液对人体有害，请注意防护。 2．固定液有刺激性气味，建议在通风橱进行固定。 3．支原体检测时，最好用不含抗生素的培养液培养 2～3 代，这样容易避免假阴性结果。 4．本试剂盒用于 6 孔板检测时，可以进行 50 次检测反应。
荧光染色检测细胞凋亡
荧光染色检测细胞凋亡1、吖啶橙AO/溴乙锭EB双染色吖啶橙（acridine orange，简称AO）：3，6－（二甲胺基）吖啶盐酸盐，分子式C17H19N3 · HCl · ZnCl2, 分子量438.12g/mol,是一种荧光色素，其检测激发滤光片波长488nm,阻断滤光片波长515nm。
它与细胞中DNA和RNA结合量存在差别，可发出不同颜色的荧光，与DNA结合量少发绿色荧光，与RNA结合量多发桔黄色或桔红色荧光。
该染料具有膜通透性，能透过细胞膜，使核DNA和RNA染色。
因此，在荧光显微镜下观察，吖啶橙可透过正常细胞膜，使细胞核呈绿色或黄绿色均匀荧光；而在凋亡细胞中，因染色质固缩或断裂为大小不等的片断，形成凋亡小体。
吖啶橙使其染上致密浓染的黄绿色荧光，或黄绿色碎片颗粒；而坏死细胞黄荧光减弱甚至消失。
吖啶橙AO常与溴化乙啶EB合用双染，因EB只染死细胞使之产生桔黄色荧光，由此可区分出正常细胞、凋亡细胞及坏死细胞.它还可以用作移码突变的诱变剂,能镶嵌于两个相邻的碱基对之间，这样在DNA复制过程中，会使DNA链增加或缺失一个碱基，造成移码突变。
吖啶橙染液有毒，操作时要戴手套，需避光。
吖啶橙/溴化乙锭双荧光染色测定PC12细胞凋亡（acridineorange/ethidium bromide, AO/EB）悬浮细胞AO/EB双染步骤1.调整细胞密度为106/ml，将细胞种至6孔板，每孔2ml细胞；2.向每孔加入相应浓度药物，培养至不同时间点；3.1000转/min离心5min收集细胞，PBS洗涤1次；4.PBS重悬细胞，使悬浮细胞浓度达106/ml左右；5.取100μl受检细胞悬液，各加2μl AO和EB(AO/EB染料配制：AO、EB各1mg，分别溶于10ml pH7.2 PBS中，使之配成100μg/ml的储备液，4℃保存，用前等量混合)；6.取上述染色液一滴，滴在洁净玻片上，加盖玻片后立即置荧光显微镜下观察，计取5个视野，共100个细胞中凋亡细胞百分数。