植物组织原位杂交FISH固定-包埋-切片

为保证材料中RNA的完整性，必须尽量避免RNase污染，因此，应选用DEPC水或RNase-free 水配制的试剂及RNase-free耗材。

1、取样：将装有2/3体积卡诺固定液（乙醇：冰醋酸=3:1）的小瓶置于冰上，选取所需组

织材料，离体后立即将组织快速浸入含有固定液的小瓶中固定；必须保证材料没有气泡。

换新鲜固定液，4℃放置5 个小时后，将材料置于70%乙醇中，4℃保存。

2、载玻片处理：

A. 将载玻片用洗涤剂清洗后清水冲净；

B.室温下将上步清洗干净的载玻片放于1mol/L 盐酸中浸泡30min；

C.用蒸馏水清洗载玻片；

D. 室温下将上步清洗干净的载玻片放于100%乙醇中浸泡1h；

E. 取出后室温晾干；

F. 0.01%多聚赖氨酸涂抹玻片正面（带磨砂一面）后晾干备用。

3、清洗：倒掉固定液，用DEPC 水配制的0.1 mol/L，pH7.0 的PBS（磷酸缓冲液）清洗

样品三次，每次15 min。

4、脱水：提前准备DEPC 水，无水乙醇，DEPC 处理的1 ml 枪头（烘干），镊子和新的

小瓶（RNase free），冰浴；用DEPC 水配制的浓度梯度乙醇进行脱水，依次经过：30%、50%、70%、85%、95%、100%、100%，每次脱水2 小时。

5、二甲苯透明：提前准备用DEPC 处理的1ml 枪头，镊子（RNase free），冰浴，二甲苯，

烘箱；将脱水材料依次经过：3/4 酒精+1/4 二甲苯、1/2 酒精+1/2 二甲苯、1/4 酒精+3/4 二甲苯、纯二甲苯、纯二甲苯，每个梯度2 小时。

6、浸蜡：将石蜡（约56-58 ℃，硬度适中）熔化，在60 ℃烘箱中按以下梯度进行浸蜡：

3/4 二甲苯+1/4 熔蜡、1/2 二甲苯+1/2 熔蜡、1/4 二甲苯+3/4 熔蜡、换纯蜡、换纯蜡、换纯蜡，渗蜡每梯度4 小时，使二甲苯充分蒸发。

7、包埋：固化前可以在60 ℃保温30 min 以除气。将大小合适的包埋用纸盒放在融蜡台

上，做好标记，将新熔化的石蜡倾倒于此盒内，把材料放到此盒内。用加热的解剖针迅速把材料按需要的切面及材料之间的间隔排列整齐。当石蜡表面凝固成一层薄膜时，平放入冷水中，数秒后翻转蜡块。包埋后可放入4℃冰箱中保存备用。

8、切片：调整仪器使切片厚度为5-8μm。

A. 用刀片将材料周围石蜡切除；

B.使用切片机切出厚度为5-8μm的蜡带；

C. 将蜡带剪切为2.5 至3.0cm，在载玻片上滴适量的DEPC水后将蜡带覆盖上后置于

45℃烤片台，待蜡带平整后吸去DEPC水；

D. 待切片完成后，将所有切片放入42℃烘箱中烘烤2h，使得切片完全贴附于载玻片

上。

9、切片室温保存备用（可放置一个月）。