基因克隆的酶学基础
栖热袍菌α-葡糖苷酶的基因克隆表达及酶学性质
摘
要： 用 分 子 克 隆 手 段 获得 栖 热 袍 茵 （ Ｔ ｈ ｅ ｒ ｍ ｏ ｔ ｏ ｇ ａ ｎ ｅ ａ ｐ ｏ ｌ ｉ ｔ ａ ｎ ａ Ｄ Ｓ Ｍ ４ ３ ５ ９ ） 中的 ｄ 一 葡糖 苷 酶 基 因 ， 构 建 该 基 因的 原
ｓ ｉ ｏ ｎ ｖ ｅ ｅ ｔ ｏ ｒ ｐ Ｅ Ｔ一 ２ ８ ａ ．Ｔ ｈ ｅ ｒ ｅ ｃ ｏ ｍｂ ｉ ｎ ａ ｎ ｔ ｐ ｌ ａ ｓ ｍｉ ｄ ｐ Ｅ Ｔ一 ２ ８ ａ — ｇ ｌ ｕ ｗ ａ ｓ ｃ ｏ ｎ ｓ ｔ ｒ ｕ ｃ ｔ ｅ ｄ ａ ｎ ｄ ｔ ｒ ａ ｎ ｓ ｆ ｅ ｒ ｒ ｅ ｄ ｉ ｎ ｔ ｏ Ｅ． ｃ ｏ ｌ ｉ Ｂ Ｌ ２ １
为６ ２ Ｋ Ｄ ａ ： 酶 的 最适 反 应 温度 为 ７ Ｏ ℃， 最适 ｐ Ｈ为 ５ ． Ｏ 。
关键 词 ： ｐ Ｅ Ｔ 一 ２ ８ ａ ； 一 葡糖苷酶； 克隆 ； 表 达
中 图分 类 号 ： Ｔ Ｑ ９ ２ ５ ・ ５
文献标识码 ： Ａ
文章编号 ： １ ６ ７ ４ — ５ ０ ６ Ｘ（ ２ ０ １ ３ ） ０ １ 一 Ｏ ０ ０ ４ — ０ ０ ０ ４
核 表 达载 体 ， 并在大肠杆茵 Ｂ Ｌ ２ １ （ Ｄ Ｅ ３ ） 中表 达 。 以Ｔ ｈ ｅ ｒ ｍ ｏ ｔ ｏ ｇ ａ ｎ ｅ ａ ｐ ｏ ｌ ｉ ｔ ａ ｎ ａ Ｄ Ｓ Ｍ ４ ３ ５ ９的 ０ 【 一 葡糖 苷 酶 基 因 Ｄ Ｎ Ａ 为模 板， 通过 Ｐ Ｃ Ｒ 扩 增 目的基 因 ， 并连 接 至表 达 栽 体 中 ， 构建重组质粒 ｐ Ｅ Ｔ 一 ２ ８ ａ 一 ｕ ， 然后 转 化 到 大 肠 杆 菌 中 ， 加Ｉ Ｐ Ｔ Ｇ诱
吴乃虎—基因工程原理
目录第一章基因与基因工程第一节基因研究的发展第二节基因的现代概念第三节基因工程的诞生及其主要的研究内容第二章基因操作的主要技术原理第一节核酸的凝胶电泳第二节核酸分子杂交第三节细菌转化1.肺炎球菌的转化2.大肠杆菌的转化3.细菌转化频率第四节DNA核苷酸序列分析第五节基因的化学合成第六节基因定点突变第七节基因扩增第八节研究DNA与蛋白质相互作用的方法第三章基因克隆的酶学基础第一节核酸内切限制酶与DNA分子的体外切割1.寄主控制的限制与修饰现象2.核酸内切限制酶的类型3.I 型和III型核酸内切限制酶的基本特性4.II型核酸内切限制酶的基本特性[1].基本特性[2].同裂酶[3].同尾酶[4].限制片段末端的连接作用5.核酸内切限制酶的命名法6.影响核酸内切限制酶活性的因素[1].DNA的纯度[2].DNA的甲基化程度[3].酶切消化反应的温度[4].DNA分子的结构[5].核酸内切限制酶的缓冲液7.核酸内切限制酶对DNA的消化作用[1].核酸内切限制酶与靶DNA识别序列的结合模式[2].核酸内切限制酶对DNA分子的局部消化作用[3].核酸内切限制酶对真核基因组DNA的消化作用第二节DNA连接酶与DNA分子的体外连接1.DNA连接酶2.粘性末端DNA片段的连接3.平末端DNA片段的连接[1].同聚物加尾法[2].衔接物连接法[3].DNA接头连接法4.热稳定的DNA连接酶[1].寡核苷酸连接测定法[2].连接酶链式反应(LCR)第三节DNA聚合酶1.DNA聚合酶I与核酸杂交探针的制备[1].DNA聚合酶I[2].DNA缺口转移[3].DNA杂交探针的制备2.大肠杆菌DNA聚合酶I 的Klenow片段与DNA末端标记3.T4 DNA聚合酶和取代合成法标记DNA片段4.依赖于RNA的DNA聚合酶与互补DNA的合成5.T7 DNA聚合酶6.修饰的T7 DNA聚合酶第四节DNA及RNA的修饰酶1.末端脱氧核苷酸转移酶与同聚物加尾2.T4多核苷酸激酶与DNA分子5’-末端的标记3.碱性磷酸酶与DNA脱磷酸作用第五节核酸外切酶1.核酸外切酶VII (exo VII)2.核酸外切酶III (exo III)3.λ核酸外切酶(λ exo)和T7基因6核酸外切酶第六节单链核酸内切酶1.S1核酸酶与RNA分子定位2.Bal1 核酸酶与限制位点的确定第四章基因克隆的质粒载体第一节质粒的一般生物学特性1.质粒DNA2.质粒DNA编码的表型3.质粒DNA的转移[1].质粒的类型[2].F质粒[3].质粒DNA的接合作用4.质粒DNA的迁移作用5.质粒DNA的复制类型6.质粒DNA的不亲和性[1].质粒的不亲和性现象[2].质粒不亲和性的分子基础7.第二节质粒DNA的复制与拷贝数的控制1.质粒DNA复制的多样性2.ColE 1质粒DNA复制的启动3.质粒DNA拷贝数的控制[1].天然质粒拷贝数的控制[2].杂种质粒拷贝数的控制4.质粒复制控制的分子模型[1].抑制蛋白质稀释模型[2].自体阻遏蛋白质模型5.第三节质粒DNA的分离与纯化1.氯化铯密度梯度离心2.碱变性法3.微量碱变性法4.影响质粒DNA产量的因素[1].寄主菌株的遗传背景[2].质粒的拷贝数与分子大小5.第四节质粒载体的构建与类型1.天然质粒用作克隆载体的局限性2.质粒载体必须具备的基本条件3.质粒载体的选择记号[1].高拷贝数的质粒载体[2].低拷贝数的质粒载体[3].失控的质粒载体[4].插入失活型的质粒载体[5].正选择的质粒载体[6].表达型的质粒载体4.第五节重要的大肠杆菌质粒载体1.pSC101 质粒载体[1].应用pSC101 质粒作基因克隆载体的实例一---葡萄球菌质粒基因在大肠杆菌中的表达[2].应用pSC101 质粒作基因克隆载体的实例二---在大肠杆菌中克隆非洲爪蟾2.Col 1质粒载体3.pBR322质粒载体[1].pBR322质粒载体的构建[2].pBR322质粒载体的优点[3].pBR322质粒载体的改良[4].应用pBR322质粒作为基因克隆载体的实例---水稻夜绿体光诱导基因psbA的结构分析4.pUC 质粒载体[1].pUC 质粒载体的结构[2].pUC 质粒载体的优点5.其他重要的质粒载体[1].丧失迁移功能的的质粒载体[2].能在体外转录克隆基因的质粒载体[3].穿梭质粒载体第六节质粒载体的稳定性问题1.质粒载体不稳定性的类型[1].结构的不稳定性[2].分离的不稳定性2.影响质粒载体稳定性的主要因素[1].新陈代谢负荷对质粒载体稳定性的效应[2].拷贝数差度对质粒载体稳定性的影响[3].寄主重组体系对质粒载体稳定性的效应3.随机分配的分子机理[1].通过精巧的控制环路使质粒拷贝数的差度限制在最低的水平[2].通过位点特异的重组作用消除天然质粒的寡聚体[3].通过调节细胞的分裂活动阻止无质粒细胞的产生[4].大肠杆菌素的合成增进了质粒的稳定性4.主动分配的分子机理[1].分配区的结构与功能[2].预配对模型[3].二聚体的解离有助于质粒的主动分配[4].寄主致死功能对质粒稳定性的效应5.第五章噬菌体载体和柯斯载体第一节噬菌体的一般生物学特性第二节λ噬菌体载体第三节柯斯质粒载体第四节单链DNA噬菌体载体第五节噬菌体载体第六章基因的分离与鉴定第一节DNA克隆片段的产生与分离1.基因组DNA克隆片段的产生与分离2.DNA片段的大小分部3.编码目的基因的克隆片段的富集第二节重组体DNA分子的构建及导入受体细胞1.外源DNA片段同载体分子的重组[1].外源DNA片段定向插入载体分子[2].非互补粘性末端DNA分子间的连接[3].最佳连接反应2.重组体分子导入受体细胞的途径[1].重组体DNA分子的转化或转染[2].体外包装的λ噬菌体的转导第三节基因克隆的实验方案1.互补作用基因克隆2.cDNA基因克隆[1].cDNA文库的建立[2].不同丰度mRNA的cDNA克隆[3].全长cDNA的合成[4].cDNA克隆的优越性3.基因组DNA克隆[1].应用 噬菌体载体构建基因组文库[2].应用柯斯质粒载体构建基因组文库4.基因定位克隆[1].拟南芥菜简介[2].RFLP分子标记[3].RFLP作图的原理与步骤[4].染色体步移[5].大尺度基因组物理图谱的构建第四节克隆基因的分离1.应用核酸探针分离克隆的目的基因[1].核酸探针的来源[2].寡核酸探针的的人工合成[3].假阳性克隆的克服2.应用差别杂交或扣除杂交法分离克隆的目的基因[1].差别杂交[2].差别杂交的局限性[3].扣除杂交3.应用mRNA差别显示技术分离克隆的目的基因[1].mRNA差别显示的原理[2].mRNA差别显示的基本过程[3].mRNA差别显示的局限性4.引用表达文库分离克隆的目的基因5.酵母双杂交体系[1].酵母双杂交体系的基本原理[2].酵母双杂交体系的寄主菌株[3].酵母双杂交体系的实验程序第五节重组体分子的选择与鉴定1.遗传检测法[1].根据载体表型特征选择重组体分子的直接选择法[2].根据插入序列的表型特征选择重组体分子的直接选择法2.物理检测法[1].凝胶电泳检测法[2].R-检测环法3.菌落或噬菌斑杂交筛选法4.免疫化学检测法[1].放射性抗体检测法[2].免疫沉淀检测法[3].表达载体产物之免疫化学检测法5.DNA蛋白筛选法6.转译筛选法[1].杂交抑制的转译[2].杂交选择的转译第七章基因的表达与调节第八章真核基因在大肠杆菌中的表达第一节真核基因的大肠杆菌表达体系第二节大肠杆菌的表达载体第三节克隆的真核基因在大肠杆菌中的表达第四节影响克隆基因在大肠杆菌中表达效率的因素第九章植物基因工程第十章哺乳动物基因工程第一节哺乳动物基因转移的遗传选择标记第二节外源DNA导入哺乳动物细胞的方法第三节SV 40病毒载体第四节反转录病毒载体第五节其他的病毒载体第十一章重组DNA与现代生物技术第十二章重组DNA与医学研究第一章基因与基因工程第一节基因研究的发展第二节基因的现代概念第三节基因工程的诞生及其主要的研究内容1.质的新组合，并使之参与到原先没有这类分子的寄主细胞内，而能够持续稳定的繁殖。
植物基因克隆的策略及方法
植物基因克隆的策略及方法首先，PCR是植物基因克隆的重要策略之一、PCR（聚合酶链反应）是一种体外复制DNA片段的方法，可以在短时间内扩增大量的特定DNA序列。
通过PCR可以快速准确地克隆植物基因。
PCR的基本原理是利用DNA 聚合酶酶学合成原理，在DNA片段两侧设计引物，将其与DNA片段的两侧结合，在适当的条件下进行DNA的聚合酶链反应，从而扩增目标基因。
PCR方法主要包括加热解性、引物连接、扩增和酶切等步骤。
其次，限制性酶切也是植物基因克隆的重要方法。
限制性酶切是指利用特定的限制性酶将DNA分子切割成特定序列的片段。
通过限制性酶切，可以将目标基因从植物DNA中剪切出来，然后进行进一步处理。
限制性酶切的基本原理是将特定的限制性酶加入反应体系中，该酶能识别和切割DNA的特定序列，从而将目标基因从DNA中剪切出来。
限制性酶切方法主要包括选择合适的限制性酶、反应条件的优化、酶切产物的回收和检测等步骤。
连接是植物基因克隆的另一种重要方法。
连接是指将目标基因连接到特定的载体DNA上，以便在目标植物中稳定地表达。
连接方法主要包括两个步骤：首先，需要处理载体DNA和目标基因的末端，以便它们能够相互连接；其次，利用DNA连接酶将载体和目标基因连接起来。
连接步骤中的处理涉及到DNA末端的修饰和处理，可以通过多种方法如限制性内切酶切割、引物扩增、酶切等进行。
最后，转化是植物基因克隆的最后一步。
转化是指将连接好的目标基因插入到目标植物的基因组中，使其能够在植物体内稳定表达。
转化的方法有多种，包括农杆菌介导的转化、基因枪转化、电穿孔转化等。
其中，农杆菌介导的转化是最常用的方法之一、农杆菌介导的转化是利用农杆菌作为载体将外源DNA导入到目标植物细胞中，通过农杆菌的自然寄生习性以及在植物细胞中特定的植物基因的活性表达，实现目标基因的稳定表达。
总的来说，植物基因克隆的策略和方法包括PCR、限制性酶切、连接和转化。
通过这些方法，可以快速准确地克隆植物基因，实现对植物遗传特性的改变和优化，为农业生产和植物遗传研究提供有力的技术支持。
基因工程的酶学基础
DNA甲基化对酶活性的影响 •大多数大肠杆菌菌株中含有Dam甲基化酶 和Dcm甲基化酶。 •Dam可以在GATC序列中腺嘌呤N-6位上 引入甲基 •Dcm在CCA/TGC序列的第一个胞嘧啶C-5 位置上引入甲基。 •部分限制性内切酶对甲基化的DNA不能切 割，如FbaI和MboI等。
通常有两种方法： ①选用上述酶的同功酶，如Sau3AI，DNA 识别切割位点与MboI相同；但不受甲基化 影响； ②利用甲基化酶缺失的受体细胞进行DNA 的制备，如E. coli & nbsp; JM110和链霉菌 等，前者Dam和Dcm甲基化酶已敲除，而 后者细胞内本就没有甲基化酶，从这些细 胞中抽提的DNA就能被上述酶切割。
CATG
SAGE Tag 5
CATG
SAGE Tag 2
SAGE Tag 4
SAGE Tag 6
•II型限制性内切酶的酶切位点位于识别位点之中或
附近，产生以下4种情况。 ① 5’粘性末端；② 3’粘性末端；③ 平末端和 ④ 非互补的粘性末端 •无论DNA的来源如何，只要是使用同一种限制性内 切酶，所留下的残端都是一样的。 •经酶切后，5’端总是保留一个磷酸根；3’端总是 保留一个OH
第二讲 基因工程的酶学基础
本节内容
•限制性内切酶—主要用于DNA分子的特异切割 •DNA甲基化酶—用于DNA分子的甲基化 •核酸酶—用于DNA和RNA的非特异性切割 •核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成 •核酸连接酶—用于DNA和RNA的连接 •核酸末端修饰酶—用于DNA和RNA的末端修饰 •其它酶类--用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯化、 检测等。
Ⅱ型限制性内切核酸酶的基本特性
1.具有高度特异性的识别位点与酶切位点。 2.辅基： Mg++。 特定识别序列一般长4 - 8对碱基； 大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧；
基因工程概要
基因工程概要第一章：绪论让幸福的细胞不凋亡；让开心的基因多表达；让健康的质粒常转染；让快乐的双链不变异；让烦恼的片段永封闭。
一、基因工程的基本定义基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。
上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技术）；而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。
二、四大里程碑遗传物质的明确——DNA；DNA双螺旋结构理论（半保留复制及其中心法则）；基因遗传密码子的破译；基因转移载体的发现。
三、三大技术发明工具酶的发明：内切酶、合成酶、连接酶；基因合成和测序（合成仪、测序仪）；PCR技术（PCR扩增仪）。
四、基因的现代概念移动基因；断裂基因；假基因；重复基因；重叠基因；或嵌套基因五、工具酶种类核糖核酸酶；脱氧核糖核酸酶； DNA连接酶；DNA聚合酶；RNA聚合酶；反转录；限制性核酸内切酶。
第二章：重组ＤＮＡ技术基础1、DNA组成与结构：核酸、一级结构、二级结构和高级结构；2、RNA的组成与功能：mRNA、tRNA、rRNA.3、核酸的理化性质：（1）一般性质：核酸的溶解度.；酸碱性；核酸的高分子性质粘度： DNA>RNA dsDNA > ssDNA；核酸的紫外吸收(OD260)单核苷酸 > ssDNA(或RNA) > dsDNA；核酸的化学性质：核酸中的嘌呤和嘧啶能进行脱氨、聚合、烷基化等反应等。
（2）DNA的变性：DNA变性的本质是双链间氢键的断裂；（3)DNA的复性与分子杂交 : DNA复性(renaturation)的定义:在适当条件下，变性DNA的两条互补链可恢复天然的双螺旋构象，这一现象称为复性。
热变性的DNA 经缓慢冷却后即可复性，这一过程称为退火(annealing) ;减色效应: DNA复性时，其溶液OD260降低的现象.(4)核酸酶:核酸酶是指所有可以水解核酸的酶.(5)核酶:催化性RNA 作为序列特异性的核酸内切酶降解mRNA; 催化性DNA人工合成的寡聚脱氧核苷酸片段，也能序列特异性降解RNA。
周氏啮小蜂CcGSTS1基因的克隆·蛋白表达纯化及酶学特征分析
（大连）有限公司；引物合成及测序由苏州金唯智生物科技有
限公司完成；其他如氯仿、异丙醇等试剂均为国产或进口分
析纯试剂。
菌种及质粒：大肠杆菌 Ｔｒａｎｓｅｔｔａ （ＤＥ３） Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｃｏｍ⁃
ｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌ、Ｔｒａｎｓ１ － Ｔ１ Ｐｈａｇｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ Ｃｈｏｕｉｏｉａ ｃｕｎｅａ Ｙａｎｇ；Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓ⁃ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ；Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ；Ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ
昆虫的宿主适应性及杀虫剂抗性与解毒代谢相关蛋白
１－十二烯对小蜂已交配雌性具有较强的引诱性，但其诱发周
ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ， ＡＢＣ ）、 细 胞 色 素 ｐ４５０ （ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０ｓ，
和线粒体 ＧＳＴｓ。 迄今为止，在昆虫中只发现了胞质 ＧＳＴｓ 与
ｓｉｌｏｎ、Ｏｍｅｇａ、Ｓｉｇｍａ、Ｔｈｅｔａ 和 Ｚｅｔａ
［５］
。 普遍存在于原核生物和
真核生物中谷胱甘肽 Ｓ－转移酶，除对内源性和外源性化合
物的解毒作用以外，还参与多种细胞生理生化反应，如胞内
１．１ 材料 供试昆虫：周氏啮小蜂，由河南省漯河市豫中南
３４０ ｎｍ 处的吸光值，分别于 １ ｍｉｎ 和 ６ ｍｉｎ 各测定 １ 次，按照
１００ ｍｇ，用液氮研磨后，按照 ＲＮＡ ｉｓｏｌａｔｅｒ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ
２ 结果与分析
据反转录试剂盒说明书进行反转录反应获得单链 ｃＤＮＡ。
ＣｃＧＳＴＳ１ 基因，该基因全长 ４７４ ｂｐ，编码 １５７ 个氨基酸。 应用
重组DNA-分子克隆技术
重组DNA技术 Recombinant DNA Techniques
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主要内容
CONTENTS
基本知识
实验流程
实验操作
01
相关问题
02
03
04
克隆与克隆化
01
克隆：指同一副本或拷贝的集合
02
克隆化：获取同一拷贝的过程称为克隆化。
03
分子克隆：为某一研究目的，从众多不同的分子群体中分离的某一感兴趣分子，继而经无性繁殖（扩增）产生的很多相同分子的集合。
粘端连接
CCGG CCGG
GGCC GGCC
CGG C
C GGC
CGG C
C GGC
08
上幸存并形成菌落。
09
标志补救：若克隆的基因能够在宿主菌
01
表达，且表达产物与宿主菌的营养缺陷
02
互补，那么就可以利用营养突变菌株进
03
行筛选，这就是标志补救筛选。
04
01
挑取单菌落，于液体培养基中培养；
03
对质粒进行限制性内切酶酶切；
05
根据酶切产物的大小，鉴定阳性克隆。
02
收集菌体，提取纯化质粒；
在有模板DNA、引物及dNTP存在时，向
DNA合成体系中引入热稳定的Taq DNA聚
合酶。反应体系经变性、退火及扩增循环
自动。反复进行感兴趣DNA片段的酶促合
成，使目的基因按指数增长。
变性、退火、延伸三步曲
变性：双链DNA解链成为单链DNA
退火：部分引物与模板的单链DNA的特定互
补部位相配对和结合
04
琼脂糖凝胶电泳检测；
酶切和电泳
挑取平板上生长的单菌落直接进行PCR；
基因工程原理练习题及其答案
基因工程复习题题型：名词解释（10个）30分；填空（每空1分） 20分；选择题（每题1分）10分；简答题（4个）20分；论述题（2个）20分。
第一章绪论1.名词解释：基因工程：按照预先设计好的蓝图，利用现代分子生物学技术，特别是酶学技术，对遗传物质DNA直接进行体外重组操作与改造，将一种生物（供体）的基因转移到另外一种生物（受体）中去，从而实现受体生物的定向改造与改良。
遗传工程广义：指以改变生物有机体性状为目标，采用类似工程技术手段而进行的对遗传物质的操作，以改良品质或创造新品种。
包括细胞工程、染色体工程、细胞器工程和基因工程等不同的技术层次。
狭义：基因工程。
克隆：无性(繁殖)系或纯系。
指由同个祖先经过无性繁殖方式得到的一群由遗传上同一的DNA分子、细胞或个体组成的特殊生命群体。
2．什么是基因克隆及基本要点?3.举例说明基因工程发展过程中的三个重大事件。
A) 限制性内切酶和DNA连接酶的发现（标志着DNA重组时代的开始）；B) 载体的使用；C) 1970年，逆转录酶及抗性标记的发现。
4.基因工程研究的主要内容是什么？基础研究：基因工程克隆载体的研究基因工程受体系统的研究目的基因的研究基因工程工具酶的研究基因工程新技术的研究应用研究：基因工程药物研究转基因动植物的研究在食品、化学、能源和环境保护等方面的应用研究第二章基因克隆的工具酶1.名词解释：限制性核酸内切酶：一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶。
回文结构：双链DNA中的一段倒置重复序列，当该序列的双链被打开后，可形成发夹结构。
同尾酶：来源不同、识别序列不同，但产生相同粘性末端的酶。
同裂酶：不同来源的限制酶可切割同一靶序列和具有相同的识别序列黏性末端：DNA末端一条链突出的几个核苷酸能与另一个具有突出单链的DNA末端通过互补配对粘合，这样的DNA末端，称为粘性末端。
平末端：DNA片段的末端是平齐的。
《基因工程》课程教学大纲
《基因工程》课程教学大纲课程名称：基因工程课程类别：专业主干课适用专业：生物技术考核方式：考试总学时、学分：32 学时 2 学分其中实验学时：0 学时一、课程教学目的通过对本门课程的学习，使学生掌握基因工程技术的基本原理、常用技术和工作思路，了解基因工程技术的应用及发展趋势，为进一步学习有关专业课及参加相关领域的生产和科研工作奠定基础。
二、课程教学要求本门课是以遗传学、生物化学、微生物学、细胞生物学、分子生物学等学科为基础的学科，要求学生有扎实的上述课程基础。
本课程的主要内容包括: 基因工程载体、基因工程的酶学基础、目的基因的克隆、ＤＮＡ连接和转化、转化子的筛选与重组子的鉴定、大肠杆菌基因工程、酵母菌基因工程、高等动物基因工程、高等植物基因工程等。
要求学生掌握基因工程的基本原理和常用方法与技术，了解该领域的研究动态与发展方向。
课程的基本内容随着本学科的发展而调整并限定其广度和深度，在保证达到一定培养规格的前提下，考虑学生的接受能力和学习负担，同时注意本课程和其它相关课程的相互联系与衔接，防止疏漏和不必要的重复。
三、先修课程生物化学、微生物学、遗传学、细胞生物学、分子生物学。
四、课程教学重、难点教学重点：基因工程载体、基因工程的酶学基础、目的基因的克隆、ＤＮＡ连接和转化、转化子的筛选与重组子的鉴定。
教学难点：目的基因的克隆、ＤＮＡ连接和转化、转化子的筛选与重组子的鉴定。
五、课程教学方法与教学手段以教师讲授为主，要求教师认真备课，熟悉本课程的基本内容以及该学科的最新发展趋势，以合适的形式进行教学，提倡采用多媒体作为辅助教学手段；学生可以通过阅读相关的英文资料了解本学科的研究状况与发展方向，也可以阅读一些感兴趣的参考资料，训练其针对所感兴趣的问题进行深入探讨的能力。
六、课程教学内容第一章概述（1学时）1．教学内容（1）基因工程的概念；（2）基因工程的发展和历史；（3）基因工程的研究意义。
2．重、难点提示（1）重点：基因工程的概念；（2）难点：基因工程的基因原理及在生物工程中的地位。
知识、能力、素质结构表
附表1 知识、能力、素质结构表
附表2：
生物工程专业课程结构比例一览表
说明：实践课学分总计55.5学分，占总学分比例为31.7%。
附表3：
生物工程专业教学计划进程表
注：1.形势与政策课按平均每学期16周，每周1学时，计2学分。
2.军事理论及训练：军事理论课程36学时，计2学分，以理论课、讲座、答疑的形式进行；军事训练2周，计1学分。
注：3.大学生职业发展与就业指导课程分两段上课：大学生职业发展部分20学时，在第二学期完成；就业指导部分18学时，在第七学期完成，计1学分，以理论课、讲座、答疑的形式进行。
注：4.社会实践4个学分，其中1个学分安排劳动实践，时间为一周，在第三学期进行；其余3学分在三学年内组织开展三下乡社会实践、社会公益、志愿服务等活动。
5.创业教育课程安排在第三学期至第七学期，以理论课、讲座、答疑的形式进行。
6.学科专业基础课程选修课和专业课程选修课须修满16学分；职业课程需修满23学分。
7. 中学阶段学习俄语的同学，可不修大学英语，学习大学俄语（TS1314）。
基因克隆简介
2. DNA 连接酶 3.1 DNA连接酶（ligase)的发现
从细菌DNA环化现象推测，必定存在一种能把 两条DNA双链连接到一起的酶。
DNA复制一定有断口。 基因克隆简介
3.2 DNA ligase的特点
1. 两种DNA连接酶
（1）大肠杆菌连接酶 只能连接粘性末端。
限制性内切酶
能识别并切断外来DNA分子的某些部位，使外来 DNA失去活性，限制外来噬菌体的繁殖，把这类酶称 为限制性核酸内切酶。
基因克隆简介
1.2、限制性核酸内切酶的命名原则
限制酶的命名是采用Smith和Athens提议的方案， 即名称的第个1字母取自它来源细菌属名的第1个字母 ，大写；第2，3二个字母取自它来源细菌的种名的头 2个字母，小写；如果它的来源菌还有株系，则有第4 个字母；最后用大写罗马数字，代表同一菌株中不同 限制酶的编号。前三个字母用斜体表示。
基因克隆简介
基因克隆简介
一. DNA分子克隆的基本原理
❖ 基因克隆（gene cloning）或分子克隆,又称为重组 ＤＮＡ技术，是应用酶学方法，在体外将不同来源 的DNA分子通过酶切、连接等操作重新组装成杂合 分子，并使之在适当的宿主细胞中进行扩增，形成 大量的子代DNA分子的过程。
❖ 克隆（clone）一指含有单一的DNA重组体的无性 繁殖系，或指将DNA重组体引入宿主细胞建立无性 繁殖系的过程(cloning)。
基因克隆简介
一个完整的基因克隆过程包括以下步骤
❖ １.获得待克隆的DNA片段（基因）； ２.目的基因与载体在体外连接； ３.重组DNA分子导入宿主细胞； ４.筛选、鉴定阳性重组子； ５.重组子的扩增与／或表达。
基因克隆简介
➢ 1. 从生物有机体基因组中，分离出带有目的基因 的DNA片段。
3、基因克隆的酶学基础-01
7、完全酶切和部分酶切
3.2 DNA连接酶与DNA 分子的体外连接 3.2.1 DNA连接酶：大肠杆菌DNA连接酶和T4DNA连接酶
动物细胞和噬菌体
缺口（nick)
裂口（gap)
大肠杆菌及其它细菌
3.2.2 粘性末端的连接
用碱性磷酸 酶的脱磷酸 作用阻止线
S1 核酸酶在分子生物学研究中的主要用途是给RNA定位。
3.6.2 Bal 31 核酸酶与限制位点的确定 具有单链特异的核酸内切酶活性和双链特异的核酸外切酶活性。
应用Bal 31 核酸酶诱发 DNA分子的缺失突变
（a）质粒DNA分子，A区段是准 备诱发缺失突变的序列
（b）用Bal 31核酸酶不同时间长 度分别消化线性DNA分子 S1 核酸酶与RNA分子定位 反应条件：低水平Zn2+、最适pH值：4.0~4.3、NaCI浓度：
100mmol/L
S1 核酸酶的主要功能： ① 催化RNA和单链DNA分子降解成5′单核苷酸； ② 作用于双链核酸分子的单链区，并从此处切断核酸分子 （单链区可小到一个碱基对）。
T4 多核苷酸激酶的交换活性
3.4.2 碱性磷酸酶（BAP、CIP)与 DNA脱磷酸作用
3.5 DNA 外切酶
核酸外切酶（exonucleases）：是一类从多核苷酸链的一 头开始按序催化降解核苷酸的酶。按作用特性的差异可分为 单链核酸外切酶（如exo I、 exo VII等 ）和双链核酸外切酶 （如exo III、λ exo等）。
（c）将带有另一种限制性内切酶 识别序列的衔接物连接到这些缺 失分子上并将它们环化起来
（d）新形成的环状质粒分子具有 新的限制性内切酶（Hind III）的 切点，其A区段有缺失
蛋白酶SpP1基因克隆、表达及酶学性质的表征
蛋白酶SpP1基因克隆、表达及酶学性质的表征殷亮;王代玮;刘悦莹;刘海燕;罗光宏【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2024(40)4【摘要】【目的】对螺旋藻来源的一个蛋白酶基因进行克隆、表达,并探究重组酶酶学性质,为藻类蛋白酶的深入研究奠定基础。
【方法】从钝顶螺旋藻(Spirulina platensis)基因组扩增获得了蛋白酶基因SpP1,进而构建pET28a-SpP1重组质粒,将其转入Escherichia coli BL21(DE3)实现了异源表达,利用镍柱分离纯化重组蛋白酶并研究其酶学性质。
【结果】螺旋藻蛋白酶SpP1属于丝氨酸蛋白酶家族成员,分子量为47.04 kD,最适温度和pH值分别为50℃和8.0。
其热稳定性较差,在pH=8.0-9.0的范围内具有良好的酸碱稳定性。
以酪蛋白为底物时,最大反应速度V_(max)=8.237 U/mL,米氏常数K_(m)=16.369μg/mL。
Mn^(2+)对其具有较强的激活作用,添加0.1 mol/L Mn^(2+)后其酶活提高了18倍,同时0.1 mol/L的Fe^(3+)、Zn^(2+)、Ca^(2+)、乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA)等对酶活也具有明显的促进作用。
【结论】螺旋藻来源的蛋白酶SpP1具有丝氨酸蛋白酶家族成员的典型结构和性质特征,具有较好的酸碱稳定性,添加金属锰离子可有效提升其催化活性。
【总页数】9页(P278-286)【作者】殷亮;王代玮;刘悦莹;刘海燕;罗光宏【作者单位】河西学院甘肃省微藻工程技术研究中心甘肃省微藻技术创新中心;河西学院农业与生态工程学院【正文语种】中文【中图分类】TS2【相关文献】1.一种新颖的毕赤酵母酸性蛋白酶基因的克隆和异源表达以及酶学性质研究2.天冬氨酸激酶突变体G277K中AK基因的克隆表达及酶学性质表征3.粪肠球菌β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因的克隆表达及酶学性质表征4.耐热嗜碱蛋白酶基因的克隆、表达及其酶学性质分析5.一株海洋来源铜绿假单胞菌Gxun-7角蛋白酶基因的克隆、表达及重组酶酶学性质因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
基因工程习题题目练习（附答案）版
基因⼯程习题题⽬练习（附答案）版基因⼯程原理复习题思考题考试时间：2009.06.21 上午9：00-11：00 地点5D305基因⼯程绪论1、基因⼯程的定义与特征。
定义：在体外把核酸分⼦（DNA的分离、合成）插⼊载体分⼦，构成遗传物质的新组合（重组DNA），引⼊原先没有这类分⼦的受体细胞内，稳定地复制表达繁殖，培育符合⼈们需要的新品种（品系），⽣产⼈类急需的药品、⾷品、⼯业品等。
特征：1、具跨越天然物种屏障的能⼒。
2、强调了确定的DNA⽚段在新寄主细胞中的扩增。
2、试述基因⼯程的主要研究内容。
1）、⽬的基因的分离2）、DNA的体外重组（载体、受体系统等）3）、重组DNA分⼦转移到受体细胞及其筛选4）、基因在受体细胞内的扩增、表达、检测及其分析。
3、基因⼯程在⾷品⼯业上有何应⽤发展？主要是通过基因重组，使各种转基因⽣物提⾼⽣产⾕氨酸、调味剂、酒类和油类等有机物的产率；或者改良这些有机物组成成分，提⾼利⽤价值。
4、转基因是⼀把双刃剑，请客观谈谈对转基因及转基因⾷品安全性的认识。
转基因技术所带来的好处是显⽽易见的，在⼈类历史进步和发展中起到了积极作⽤。
⾸先，通过该项技术可以提供⼈们所需要的特性，改良培育新品种；第⼆，延长⾷品保存时间或增加营养成分；第三，将抗⾍防菌基因转⼊到作物中，使作物本⾝产⽣抵抗病⾍害侵袭的能⼒，减少了农药的使⽤量，有利于环境保护；第四，转基因技术及基因⾷物在医学⽅⾯得到⼴泛研究和应⽤。
⼈们对转基因技术的主要担忧在于环境⽅⾯。
外源基因的导⼊可能会造就某种强势⽣物，产⽣新物种或超级杂草、损害⾮⽬标⽣物、破坏原有⽣物种群的动态平衡和⽣物多样性，也即转基因⽣物存在潜在的环境安全问题。
转基因作物的⼤⾯积种植已有数年，⾷⽤转基因⾷品的⼈群⾄少有10亿之多，但⾄今仍未有转基因⾷品对⽣命造成危害的实例；更何况⽬前每⼀种基因⼯程⾷品在上市前，都要经过国家法律认可，⾷品卫⽣部门和环境部门的严格检测。
基因克隆原理及实验介绍
859bp
859bp
336bp
336bp
336bp
2700bp 2700bp 2700bp
1485bp
339bp 339bp 339bp
498bp 498bp 498bp
质粒载体 pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag
pcDNA3.1+3flag
T4 DNA Ligase Total
• 混匀，4℃过夜或常温条件下反应4h
用量 13-15μl 2-4μl
2μl 1μl 20μl
整理课件
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引物设计
pCR
回收纯化
双酶切
连接
转化
挑菌
提质粒
测序
将连接产物通过转化转入到感受态大肠杆菌中，从而使连接产物（重组质粒）在大肠杆菌中大量复制
LB培养基配制
2μl
enzyme 1
2μl
enzyme 2
2μl
enzyme 2
2μl
dd H2O
补至50μl
dd H2O
补至50μl
*根据质粒浓度（如pcDNA3.1+3flag浓度为455ng/μl，4000bp，反应体积约为9μl）
• 混匀，37℃孵育4-6h（6h以上更佳）整理课件
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引物设计
pCR
回收纯化
双酶切
连接
转化
挑菌
提质粒
测序
通过凝胶电泳验证目的DNA、质粒是否酶切成功，并通过胶回收DNA及质粒（切去 的片段除外）最终回收体积为30μl
通过连接使目的DNA导入质粒中，为下一步转染准备
Procedure
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数字表示在 不同寄主中 生长的噬菌 体的成斑率， 表示限制程 度。
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二．限制和修饰作用的分子机制
1．大肠杆菌宿主细胞 K株，B 株 ，有各自的限制和修 饰系统。
1） 它们均有三个连续的基因位点控制，hsdR; hsdM; hsdS.
2） hsdR编码限制性核酸内切酶---识别DNA分子特定 位点，将双链DNA切断。（DNA分子转化细胞：受 体细胞去掉hsdR基因位点）
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② 对称性 ③ 限制酶切后产生两个末端，末端结
构是5’-P和3’-OH
EcoRI 5’-G A A T T C-3’ 3’-C T T A A G-5’
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（3）末端种类
① 3’-端突起，个数为2或4个核苷酸
Pst I 5’-CTGCAG-3’ 5’-CTGCA
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（3）Ⅲ型酶
这类酶可识别特定碱基顺序，并在这一 顺序的3’端24~26bp处切开DNA，所以它 的切割位点也是没有特异性的。
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二、限制性内切酶的特点 1、定义、命名
（1）定义
广义指上述三个系统中的限制酶； 狭义指II型限制酶。
（2）命名
限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。 例如：HindⅢ 前三个字母来自于菌种名称H. influenzae， “d”表示菌系为d型血清型（菌株号）；“Ⅲ”表示分离 到的第三个限制酶。
EcoRI—Escherichia coli RI
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2、限制酶的特点
（1）基本特点 在DNA双链的特异性识别序列部位，切割
DNA分子，产生链的断裂。 两个单链断裂部位在DNA分子上的分布，通
常不是彼此直接相对的 因此，断裂的结果形成的DNA片断，也往往
具有互补的单链延伸末端。
第三章 基因克隆的酶学基础
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常用的工具酶：
限制性核酸内切酶 DNA连接酶
DNA聚合酶Ⅰ 反转录酶
多聚核苷酸激酶 末端转移酶 碱性磷酸酶
切割DNA 生成3’- 5’磷酸二酯键 探针标记、补平3’末端
cDNA合成 5’磷酸化、探针标记
3’末端多聚尾 切除末端磷酸基
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2
第一节 限制性核酸内切酶 第二节 DNA连接酶 第三节 DNA聚合酶 第四节 DNA及RNA的修饰酶
• 根据酶的功能、大小和反应条件，及切割 DNA的特点，可以将限制性内切酶分为三类： Ⅰ型酶、Ⅱ型酶、 Ⅲ型酶
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（1）Ⅰ型酶：
• 1968年，M. Meselson和R. Yuan在E. coli B和E. coli K中分离出的核酸内切酶。 • 分子量较大，反应需Mg2+、S-腺苷酰-L-甲硫 氨酸（SAM）、ATP等。 • 这类酶有特异的识别位点但没有特异的切割位 点，而且切割是随机的，所以在基因工程中应 用不大。
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修饰的甲基转移酶
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作 用： 保护自身DNA不受限制； 破坏外源DNA使之降解
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8
E.coli B含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶
当λ(k)噬菌体侵染E.coliB时，由于其DNA中 有EcoB核酸酶特异识别的碱基序列，被降解 掉。而E.coli B的DNA中虽然也存在这种特异 序列，但可在EcoB甲基化酶的作用下，催化 S-腺苷甲硫氨酸（SAM）将甲基转移给限制 酶识别序列的特定碱基，使之甲基化。EcoB 核酸酶不能识别已甲基化的序列。
细菌的R/M体系类似于免疫系统，能辨别 自身的DNA与外来的DNA，并能使后者降 解掉。
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5
• 限制与修饰系统是细胞的一种防卫手段。 各 种 细 菌 都 能 合 成 一 种 或 几 种 能 够 切 割 DNA 双链的核酸内切酶，它们以此来限制外源 DNA存在于自身细胞内，但合成这种酶的 细胞自身的DNA不受影响，因为这种细胞 还合成了一种修饰酶，对自身的DNA进行 了 修 饰 ， 限 制 性 酶 对 修 饰 过 的 DNA 不 能 起 作用。
第五节 核酸外切酶 第六节 单链核酸内切酶
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3
第一节 限制性核酸内切酶 与DNA分子的体外切割
一、寄主控制的限制与修饰 二、Ⅱ型限制酶的特点 三、影响内切酶活力的因素 四、核酸内切酶对DNA的消化作用 五、 限制酶的用途
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一、寄主控制的限制与修饰
人们发现侵染大肠杆菌的噬菌体都存在着 一些功能性障碍。即所谓的寄主控制的限 制与修饰现象简称（R/M体系）。
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（2）Ⅱ型酶
1970年，H.O.Smith和K.W.Wilcox在流 感嗜血菌Rd株中分离出来的限制酶。
分子量较小（105 Da），只有一种多肽， 通常以同源二聚体的形式存在。
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反应只需Mg2+的存在，并且具有以下两个 特点， 识别位点是一个回文对称结构，并且切割 位点也在这一回文对称结构上。 许多Ⅱ型酶切割DNA后，可在DNA上形成 粘性末端，有利于DNA片段的重组。
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（2）识别顺序和酶切位点 ① 识别４-8个相连的核苷酸
Mbo I NGATCN Ava II GG(A/T)CC BamH I GGATCC PpuM I PuGG(A/T)CCPy
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1• 估算RE识别序列在DNA上出现的频率: 识别序列的频率=1/4n Sau3A (4bp)=1/44 256bp EcoR I、Pst I (6bp)=1/46 4096 Not I (8bp)= 1/48 65536 (rare cutters) 仅是理论推测
3） hsdM编码产物是DNA甲基化酶---催化DNA分子特 定位点的碱基甲基化反应。
4） hsdS表达产物的功能是---协助限制性核酸内切酶 和甲基化酶，识别特殊的作用位点。
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2、限制性内切酶的类型
• 限制性内切酶本是微生物细胞中用于专门水 解 外 源 DNA 的 一 类 酶 ， 其 功 能 是 避 免 外 源 DNA的干扰或噬菌体的感染，是细胞中的一 种防御机制。由于R/M现象的发现使得核酸 内切酶成为基因工程重要的工具酶。