详细介绍western blot

Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。

原理

与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

WesternBlot试剂的准备

1. 30%储备胶溶液：丙烯酰胺（Acr）29.0g

亚甲双丙烯酰胺（Bis） 1.0g

混匀后ddH2O，37℃溶解，定容至100ml，棕色瓶存于室温。

2. 4×分离胶缓冲液（1mol/L Tris-Hcl PH 8.8）

Tris 18.17g加ddH2O溶解，浓盐酸调PH 8.8，定容至100ml。

3. 4×浓缩胶缓冲液（0.5mol/L Tris-Hcl PH 6. 8）

Tris 12.1g加ddH2O溶解，浓盐酸调PH 6. 8，定容至100ml。

4. 10%SDS：电泳级SDS 10.0g加ddH2O，68℃助溶，浓盐酸调PH 7.2，定容至100ml。

5. 5×电泳缓冲液（PH 8.3）： Tris 15.2g

甘氨酸94g

ddH2O 定容到1000ml

SDS 5g

先在974ml蒸馏水中加入Tris碱，待溶解完全后，再加甘氨酸，最后加SDS。

6. 10%过硫酸铵（AP）：0.1g AP加ddH2O至1.0ml，4℃保存，要在一周内使用，最好新鲜配制。

7. 2×加样缓冲液：2×SDS加样缓冲液

0.5mol/L Tris-HCL (PH 6.8) 2ml

10%SDS 4 ml

β-巯基乙醇 1ml

甘油2ml

1%溴芬蓝 1ml

置4℃避光保存

8. TEMED：注意室温较低时TEMED量可加倍，最后灌胶之前再用

9. 转膜缓冲液(Towbin transfer Buffer)：即1×SDS-PAGE

10. 0.0 1mol/L PBS (PH 7.4) ： NaCl 8.5g

(12H2O)Na2HPO4 2.9011g

(2H2O)NH2PO4 0.24g

加ddH2O定容至1000ml

11. 封闭液:1×PBS中加入30ml

5%（V/V）脱脂奶粉 1.5g

0.02%叠氮钠0.006g

0.05%Tween-20 0.015g

12. 漂洗液（PBST）：含0.05% Tween-20的PBS溶液

每1000 ml PBS溶液中加0.5 ml Tween-20

13. 水饱和正丁醇：正丁醇50 ml

ddH2O 5 ml 加入瓶中震荡，使结合，存于室温。

用时取上面一相加在凝胶上面。

14. 考马斯亮蓝染色法试剂：一般用G250考马斯亮蓝（蛋白定量专用）

染色液：90 ml甲醇：水（1：1，V/V）和10 ml冰乙酸的混合液中溶解G250马斯亮蓝0.25g，用Whatman 1号滤纸过滤染液以去除颗粒状物质。（染色液多次回收利用）

脱色液：90 ml甲醇：水（1：1，V/V）和10 ml冰乙酸的混合液

15. 丽春红S染色色法试剂：2%乙酸，

0.5%丽春红的水溶液

脱色液：TBS

16. Aprotinin:为一58氨基碱性多肽，经反复冻融后，会发生集聚，储存液应分装成小份，保存于-20度，每一小份用后应予废弃。

17. PMSF：在溶液中不稳定，应在临用前从储存液中现加于裂解液中。一旦眼睛或皮肤接触了PMSF，应立即用大量的水冲洗。凡被PMSF污染的衣物应予丢弃。PMSF通常配成10mmol/L浓度储液（1.74或17.4mg/ml溶于异丙醇中）保存于-20度。

18. 显色液：联苯胺显色液（DAB）

DAB 2ml

10%H2O2 60μl

PBS(0.1mol/L PH6.4) 10ml

19. 三去污裂解缓冲液

0.5mol/L Tris-HCL (PH 8.0) 0.785g/100ml

0.15mol/L NaCl 0.8775 g/100ml

0.02%叠氮钠 0.02 g/100ml

0.1%SDS 0.1 g/100ml

100ug/ml苯甲基黄酰氟（PMSF）

1ug/ml Aprotinin

1%Nonidet P-40(NP-40) 1.0 g/100ml

0.5%去氧胆酸钠 0.5 g/100ml

凝胶的制备

试剂总量

20 ml

分离胶浓度（%）浓缩胶

总量2.5 ml 8101215

30%丙烯酰胺 4.0 ml 5.0 ml 6.0 ml7.5ml0.4 ml

1.5mol/LTris-Hcl

PH 8.83.75ml 3.75ml 3.75ml 3.75ml

0.5mol/LTris-Hcl

PH6.8

0.625ml

10%SDS150μl150μl150μl150μl25μl

10%AP150μl150μl150μl150μl8.3μl

ddH2O 6.9ml 5.9ml 4.9ml 3.4ml 1.44ml

TEMED8μl8μl8μl8μl 2.5μl

样品处理

由于蛋白酶抑制剂可影响蛋白定量，且新鲜蛋白很少降解，故可不加，如加按建议比例即可。提取磷酸化的蛋白还需加Na3VO4 0.1mM及NaF 25mM）。

注意SDS终浓度勿超过10%。对于心脏，肌肉等碎屑较多的组织可用5%的SDS，肝肾等组织2%即可。