SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量

C.拔出样梳后,在上槽内加入缓冲液,
D.加样（摸索加样量） 取10µ l标准蛋白溶解液于 EP管内，再加入10µ l 2倍样品缓冲液，上样量为20µ l。 取10µ l样品溶液，再加入10µ l 2倍样品缓冲液，上 样量分别为5µ l 和10µ l。 E.用微量注射器距槽底三分之一处进样,加样前, 样品在沸水中加热3分钟，去掉亚稳态聚合。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测 定蛋白质分子量
SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳技术是动物 生物化学实验技术教学中一个重要实验之 一。
能够带动生化实验技术综合型 实验项目的开设。
如：蛋白质盐析沉淀提取 → 葡聚 糖凝胶层析分离→ DEAE-纤维素分离 提纯蛋白质 → 蛋白质纯度鉴定、蛋白 质分子量测定等。
2. 不连续系统：由于缓冲液离子
成分、 pH 、凝胶浓度及电位梯度的 不连续性，带电颗粒在电场中泳动 不仅有电荷效应，分子筛效应，还 具有浓缩效应，因而其分离条带清 晰度及分辨率均较前者佳。
（二）特点：
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在 聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二 烷基磺酸钠）。
蛋白质在一定浓度的含有强还原剂 的 SDS 溶液中，与 SDS 分子按比例结合， 形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物。
图2 电泳迁移率与logMW之间的关系
六、分析计算
绘制标准曲线：按下式计算
电泳迁移率 = 样品迁移距离/溴酚篮迁移距离
以每个蛋白标准的分子量对数对它的相对迁移 率作图得标准曲线，量出未知蛋白的迁移率即可 测出其分于量，这样的标难曲线只对同一块凝胶 上的样品的分子量测定才具有可靠性。
标准蛋白分子量（标准试剂盒）： 97400kD、66200kD、43000kD、 31000kD、20100kD、14400kD。 采用不连续SDS-PAGE电泳法对所分 离纯化的蛋白质进行纯度鉴定，发现图中 电泳图谱可以清晰的看到两条蛋白带。
十二、达到预期目标
1. SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳技术是动
物生物化学实验技术教学中一个综合性实 验项目， 且是一个较高水平的一个实验项 目。
蛋白质盐析沉淀提取 → 凝胶层析分离（上年基金项目已完成） → DEAE-纤维素分离提纯蛋白质 → 蛋白质分子量测定、生物分子纯度鉴定等综合 项目（五个单项实验项目）。
蛋白质丧失了原有的电荷状态形成 仅保持原有分子大小为特征的负离子团 块，降低或消除了各种蛋白质分子之间 天然的电荷差异，因此在进行电泳时，
蛋白质分子移速度取决于分子大小。 当分子量在15000KD到200000KD 之间时，蛋白质的迁移率和分子量的 对数呈线性关系。合下式： ，式中 将已知分子量的标准蛋白质的迁 移率对分子量对数作图，可获得一条 标准曲线，未知蛋白质在相同条件下 进行电泳，根据它的电泳迁移率即可 在标准曲线上求得分子量。
开封后溶于200µl蒸馏水，置-20℃保存，使用前室温融化，沸水浴中加热3-5分钟后上样。
。
2. 30%丙烯酰胺（Acr）：称Acr30g， 甲叉双丙烯酰胺 （Bis）0.8g，加蒸馏水至100ml，过滤 后置棕色瓶中 3. 10%SDS（十二烷基磺酸钠） 4. 1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl缓冲液：称 取Tris18.2g（PH计）
一、实验目的



通过该实验使学生掌握 SDS-PAGE 测定蛋白质分子量的原理； 掌握该技术的操作方法（基础性很 强，使用范围宽阔； 运用 SDS-PAGE 测定蛋白质分子量 及染色鉴定。
二、实验原理

带电质点在电场中向带有异相电荷的电极移动， 这种现象称为电泳。
电泳分类：移动界面电泳、区带电泳等。
（1）制胶
（简单叙述）
（双层胶，摸索胶浓度）
A.将玻璃板用蒸馏水洗净晾干, 准备2个干 净的锥形瓶。把玻璃板在灌胶支架上固定好。 B.按比例配好分离胶，溶液立即倾入制胶 模板中(1 5ｍｍ模板)，加少许蒸馏水，待胶凝 固后，倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干，按比 例配好浓缩胶，连续平稳加入浓缩胶至离边缘 5mm处，样梳需一次平稳插入，静置40分钟，待 模板中的胶定型后，轻轻取出梳形样品槽模具， 梳口处不得有气泡，拔出样梳后，在上槽内加入 缓冲液。
定的可信度 。
用SDS-PAGE垂直板电泳测得绵羊血清具有一
七、思考题



在不连续体系 SDS-PAGE 中 , 当分离胶加完后 , 需 在其上加一层水,为什么? 在不连续体系 SDS-PAGE 中 , 分离胶与浓缩胶中 均含有TEMED和AP,试述其作用? 样品液为何在加样前需在沸水中加热几分钟?
2. 该项目的完成对我们课程的 建设起到了促进发展的作用，达到了 我们预期目标。
3. 该实验项目的开设，使学生掌 握了利用聚丙稀酰胺凝胶电泳技术分 离蛋白质 、SDS—PAGE测定蛋白质 分子量的基本理论及实验技术。
4. 通过对生物大分子的分离、 纯化、鉴定等过程的学习，使学生 在综合性实验技术方面 有了一个系 统的认识及动手能力, 为在现代分子 生物学技术等手段方面的运用打下 了良好的基础。
+
（7）10%过硫酸铵(AP) （8）TEMED（四甲基乙二胺） （9）样品溶解液：SDS（100mg）+巯基乙醇（0.1ml）
溴酚蓝（2mg）+甘油（2g） +0.05mol/L pH8.0TrisHCl（2ml），最后定容至10ml。 （10）固定液：取50%甲醇454ml，冰乙酸46ml混匀。 （11）染色液：称取考马斯亮蓝R250 0.125g，加上述固 定液 250ml， 过滤后备用。 （12）脱色液：冰乙酸75ml，甲醇50ml，加蒸馏水定容 至1000ml。 （13）电极缓冲液（内含0.1%SDS，0.05mol/LTris0.384mol/L甘氨酸缓冲液pH8.3）：称Tris6.0g，甘 氨酸 28.8g，加入SDS1g，加蒸馏水使其溶解后定容至1000ml。
F.电泳槽中加入缓冲液，接通电源，进行 电泳，开始电流恒定在8mA，（电流、电压） 当进入分离胶后改为16mA，溴酚蓝距凝胶边 缘约5mm时，停止电泳。
G.凝胶板剥离与染色 电泳结束后，撬开 玻璃板，将凝胶板做好标记后放在大培养皿内， 加入染色液，染色 过夜。 H.脱色 染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数 次，再用脱色液脱色 。 ※剥胶时要小心,保持胶完好无损,染色要充分。
5.“SDS — 聚丙稀酰胺凝胶电 泳法测定蛋白质分子量”一实验的开 设达到了与国内同类院校相当的较高 水平。 对本科生的内容。
两条蛋白带代表绵羊免疫球蛋白G的重 链和轻链。 计算分析结果表明： 绵羊血清lgG重链和轻链的分子量分别 为50000和28000Kd。一般说来，当蛋 白质的分子量在200000至15000 kD 之 间时，电泳迁移率与分子量的对数呈线性 关系 。实验结果各谱带所代表的成分的分 子量的范围均在此之间。
区带电泳 是在半固相或胶状介质上加一个点或一薄 层样品溶液，然后加电场，分子在支持介质上或支 持介质中迁移。


区带电泳使用不同的支持介质，有 滤纸、纤维素粉、聚氯乙烯树脂、淀 粉凝胶、琼脂凝胶、醋酸纤维素膜， 现在则多用聚丙烯酰胺（PAGE）和 琼脂糖凝胶。
（一）分类 PAGE 根据其有无浓缩效应，分为 连续系统和不连续系统两大类： 1. 连续系统：电泳体系中缓冲液 pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电 场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。
胶槽1
94 000
2
3
5.2
62 000 43 000
5 4.8
31 000 20 100
4.6 4.4 4.2
14 400
4 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1
图1 标准蛋白质与待测样品电泳图谱 注：胶槽1 标准蛋白；胶槽2、3 样品蛋白
得到同行专家赞
三、 实验试剂和器材
材料 实验试剂
1.低分子量标准蛋白试剂盒:
兔磷酸化酶B 牛血清白蛋白 兔肌动蛋白 牛碳酸酐酶 胰蛋白酶抑制剂 鸡蛋清溶菌酶
样品1：称3mg样品1，加2 ml蒸馏水溶解
MW=97,400 MW=66,200 MW=43,000 MW=31,000 MW=20,100 MW=14,400
图2 电泳迁移率与logMW之间的关系
采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法 测蛋白质分子量时，必须完全打开蛋 白质之间的二硫键，使蛋白质分子被 解聚， SDS 才能定量地结合到亚基上。 因此在用 SDS 处理样品同时用巯基乙 醇处理。
巯基乙醇是一种强还原剂，它使被还原的二硫键不易再氧化，从而使很多不溶 性蛋白质溶解而与SDS定量结合。
五、实验结果分析
胶槽1
94 000
5.2
2
3
62 000 43 000
5 4.8
31 000 20 100
4.6 4.4 4.2
14 400
4 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1
图1 标准蛋白质与待测样品电泳图谱 注：胶槽1 标准蛋白；胶槽2、3 样品蛋白
实验器材


垂直板电泳装置
直流稳压电源电泳厚胶浓度后要做8各小时，薄胶5各小时）

电泳仪 标准型酸度计（TLD80-2B） 离心机等
四、实验过程
如：免疫球蛋白G 分子量的测定
（一）血清γ-球蛋白的提取 硫酸胺盐析沉淀法 （二） γ-球蛋白脱盐纯化 葡聚糖凝胶过滤（柱层析法）除去硫酸胺，得到γ球蛋白（去年完成的基金项目） （三）纯化免疫球蛋白G DEAE-离子交换纤维素法纯化免疫球蛋白G。 （四） SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定血液免疫球 蛋白G的分子量（ 连续四个单项实验）。