第五章 培养基和灭菌

（三）湿热灭菌 1、方法： 直接用加压湿蒸汽进行物料或设备容器 的灭菌。用蒸汽将物料升温到115－140℃保持一 定时间，可杀死各种微生物。常用的灭菌条件是 120℃，20－30min。 2、原理：在高温及有水分存在的条件下，微生物 细胞中的蛋白质极易凝固而引起微生物的死亡。 3、特点：经济，快速，适用于大量培养基及发酵 设备的灭菌。

P、S（可构成细胞物质） Mg、Fe（可作为酶的组成成分或维持酶活性） K、Na（调节细胞渗透压） Cu、Zn、Mn（作为酶的辅基和激活剂）
四、 水：


（1）构成生物体的成分； （2）培养基的组成部分； （3）参与代谢反应； （4）作为代谢反应介质； （5）作为物质传递介质； （6）良好的热导体。

三、 灭菌操作

灭菌操作不当不仅会减少培养基中有效的营养成 分，还会产生一些有毒物质，给发酵带来不利的 影响。
蛋白质在高温下变性，维生素在高温下失活


葡萄糖与含氨基的物质反应形成5-羟甲基糖醛和 棕色的类黑精（焦化），对微生物有一定的毒性
四、 培养基粘度的影响

粘度是培养基物性的重要指标之一，它直接影响 氧的传递、营养成分、无机盐、生长因子等的扩 散，从而影响细胞的呼吸、营养成分的吸收，最 终导致影响目标产物的形成。 “稀配方” ：（1）中间补料 ； （2）精料发酵、基础原料液体化； （3）补加无菌水
第一节 灭菌的理论和技术

灭菌是指用化学或物理的方法杀灭或去除物料 及设备中所有生命有机体的过程。 一、物理灭菌

射线灭菌 热灭菌（湿热和干热） 过滤除菌


（一）射线灭菌 1、方法： 通常用紫外线、高能量的电磁波或粒子 辐射灭菌。其中以紫外线最常用。 2、原理：紫外线的作用光谱与细菌体内核酸的吸 收光谱相一致，DNA链上核苷酸的碱基因此具有 强烈的吸收紫外线的能力，引起DNA结构形式的 变化而导致死亡。 3、特点：紫外线对芽孢和营养细胞都能起作用， 但其穿透力极低，只能用于表面灭菌。对真菌孢 子的杀灭能力不大。主要用来进行一定空间内空 气的灭菌（如无菌室等）。
供菌种繁殖孢子的固体培养基。
能使菌体迅速生长，产生较多优质孢子并不易引 起菌种发生变异。 例如：高氏培养基



2．种子培养基 指一、二级种子罐的培养基和摇瓶培养基。 主要含有容易被利用的碳源、氮源、无机盐等，使 孢子很快发芽、生长以及大量繁殖菌丝体，并使菌 体长得粗壮和使各种有关的初级代谢酶的活力提高。 赤霉素产生菌种子培养基：葡萄糖1.5%,糊精1.0%, 花生粉1.5%,MgSO4·7H2O 0.1%,KH2PO4 0.1%,消泡 剂0.2%

培养基灭菌
冷却


注意事项：
1．培养基预热：80～90℃。避免产生冷凝水造 成培养基稀释。 2．培养基灭菌：120 ～130℃，保温30min。各 路蒸汽进口要畅通，防止逆流，罐内液体翻动要 剧烈，以使罐内物料达到均一的灭菌温度。排汽 量不宜过大，以节约蒸汽用量。 3．冷却：灭菌将要结束时，应立即引入无菌空 气以保持罐压，然后开夹套或蛇管冷却水冷却， 避免罐压迅速下降，产生负压而抽吸外界空气。


第三节 影响培养基质量的因素


一、原材料质量的影响：
玉米浆、黄豆粉、花生饼粉、蛋白胨、淀粉、 糊精 品种、产地、加工方法、储藏条件



二、 水质的影响
地质（地区）（地貌）、季节、处理方法（漂白 粉、沉淀剂、消毒剂）和环境 水源质量的主要考虑参数包括pH、溶解氧、可 溶性固体、污染程度以及矿物质组成和含量。

主要用于构成菌体细胞物质，如氨基酸、蛋白质、核 酸等和含氮的目的产物如青霉素、链霉素等抗生素。

1、无机氮源（快速利用N源）：铵盐（如氯化铵、 硫酸铵、硝酸铵、磷酸铵），硝酸盐（如硝酸钠、硝 酸钾）和氨水等。 特点：（1）分解快，能被微生物迅速利用； （2）引起pH变化。 (NH4)2S04 →2NH3+H2S04 生理酸性物质 NaNO3+4H2→NH3+2H20+NaOH 生理碱性物质

注意！有机酸的利用常会使pH上升。
CH3COONa+O2→2CO2+H2O+NaOH
葡萄糖是最容易被吸收利用的碳源，几乎所 有微生物都可以利用葡萄糖，葡萄糖可以加 速微生物的生长，但葡萄糖浓度过高，反而 对生长、产抗生素不利。 淀粉、糊精等也是常用的碳源，一般经胞外 酶水解成单糖后被吸收利用。
二、 氮源：


（一）实罐灭菌
优点：不需要专门的灭菌设备，投资 少，操作简单，灭菌效果可靠。 缺点：设备利用率较低；灭菌过程需 要时间较长，培养基营养成分破坏较多。 该法多用于中小型发酵罐和种子罐的 灭菌。



3．发酵培养基 发酵培养基可供菌种生长、繁殖和合成产物。 发酵培养基的组成除有菌体生长所必需的元素和化 合物外，还要有产物所需的特定元素、前体和促进 剂等。 玉米淀粉7.0％，饴糖2.5％，豆饼粉0.3％，花生 粉1.0％，MgSO4· 2O 0.07％，KH2PO4 0.14％， 7H 消沫剂0.05％， α-淀粉酶0.05％

第五章 思考题

1、培养基在抗生素发酵中的作用如何？
2、培养基的种类及其特点是什么？
3、培养基的成分及其在抗生素发酵中的功用是什么？ 4、影响培养基质量的因素有哪些？ 5、培养基配制的原则？
第六章 灭菌及染菌防治



染菌对抗生素生产过程的危害： （1）消耗培养基的营养成分； （2）使培养条件如溶氧、粘度发生变化； （3）有的杂菌会分泌一些对抗生素产生菌有毒或 能使抗生素降解失活的物质，从而造成抗生素产量 大幅度下降； （4）影响后道工序的正常生产、影响产品外观及 内在质量； （5）如果污染了噬菌体，不仅引起产生菌自溶， 而且还会迅速大面积蔓延，严重威胁抗生素的生产。

六、 前体

在微生物合成抗生素过程中，有些化合物能被微 生物直接利用来构成抗生素分子结构的一部分， 而化合物本身的结构没有大的变化，这些物质称 为抗生素的前体。
七、 诱导物或刺激剂：

所谓诱导物是指一些具有调节抗生素生物合成 能力的小分子物质，它们是既不是营养物质又 不是前体却能提高产物产量的添加剂。 如：β－吲哚乙酸是金霉素生物合成的刺激物； 甲硫氨酸和亮氨酸是头孢菌素的刺激剂。

3、常用的化学药剂：乙醇、甲醛、苯扎溴铵 （新洁尔灭）、戊二醛、环氧乙烷、漂白粉和 苯酚（石炭酸）等。 4、用途：化学灭菌主要用来进行皮肤表面、 器具及无菌区域的灭菌，很少用于培养基的灭 菌。

第二节 培养基及有关设备的灭菌

一、实罐灭菌
分批灭菌是将配制好的培养基投入发酵罐中，
经过间接蒸汽预热后，直接通入饱和蒸汽使培养 基和设备一起灭菌。 流程： 培养基预热



4、C/N比等应与环境因素结合考虑。
三、 培养基配置与pH之关系原则

酸性抗生素发酵环境一般呈酸性（pH<7），中 性及碱性抗生素发酵环境一般呈中碱性 （pH>=7）。

配置培养基时，生理酸碱性原料应合理搭配。
四、 保证源副材料质量的稳定性原则

培养基中各组分质量的稳定性是获得连续、高 产的关键。 定点采购、定点加工、稳定加工工艺、恒定的 贮存条件、预试验。
二、 按状态分类：
固体培养基 ：适用于菌种的培养和保存；
半固体培养基 ：（琼脂用量为0.5～0.8％） 主要用于鉴定菌种、观察细菌运动特征及 噬菌体的效价测定等 ；
液体培养基 ：（水80％～90％），是发酵工 业大规模使用的培养基，它有利于氧和物 质的传递。
三、 按用途分类：

1．孢子培养基
第五章 培养基

培养基定义：
人工配制的适合于不同微生物生长、繁 殖和积累代谢产物，按一定比例组成的 营养物质。
第一节 培养基成分及其功能

碳源、氮源、无机盐、微量元素、水、生长因 子、前体、诱导剂或刺激剂、抑制剂 例：高氏培养基（培养放线菌）： 可溶性淀粉 2克，硝酸钾 0.1克，磷酸氢二钾 0.05克，氯化钠 0.05克，硫酸镁 0.05克，硫酸 亚铁 0.001克，琼脂 2克 ，水 100毫升。

一、碳源：
提供微生物生长繁殖所需的能源，构成细胞和抗 生素的碳骨架。 1．碳水化合物：单糖（葡萄糖、阿拉伯糖、甘露 糖、半乳糖） ，二糖（麦芽糖、乳糖），多糖 （蔗糖、淀粉、糊精等）

2．脂肪 ：油（脂肪）水解脂肪酶 溶解氧 C02+的盐也能作为微生物的碳源。




（二）干热灭菌
1、方法：包括火焰灭菌和热空气灭菌，常用的 干热空气灭菌是利用电热或者红外线在一定设备 内对各种用具物品进行杀菌。生产上常用的干热 灭菌的条件是160℃，时间1－2h。 2、原理：高温时微生物各种与温度有关的氧化 过程速率增快。 3、特点：时间长、耗热量大，应用不广。一般 用于灭菌后要求保持干燥状态的物料。

2、有机氮源（慢速利用氮源，多为天然有机 物） ：花生饼粉，黄豆饼粉，玉米浆，玉米蛋 白粉，蛋白胨，酵母膏。 在微生物分泌的蛋白酶作用下，水解成氨基酸， 被菌体吸收后再进一步分解代谢．最终用于合 成菌体细胞物质和含氮的目的产物。

三、 无机盐、微量元素：

微生物在生长繁殖和合成目的产物的过程中， 需要某些无机盐和微量元素作为其生理活性物 质的组成或代谢的调节物，为微生物提供除C、 N源外的各种重要元素。

第四节 培养基配置的原则


一、碳氮源种类的确定原则
快速利用碳氮源、慢速利用碳氮源的种类、配 比要满足不同微生物，不同生长阶段和生产阶 段的需要。