实验二细菌的观察

细菌一般形态染色观察

一、实验目的

学习了解微生物染色的基本原理与方法

学习掌握细菌的简单染色和革兰氏鉴别染色技术

巩固显微镜油镜的使用方法。

二、实验原理

细菌的个体极微小，无色透明，必须借助于染色法，使细菌（或背景）着色，与背景（或菌体）形成明显的对比便于在显微镜下观察细菌的形态构造。

染色方法主要有：见下图

简单染色法

简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。

常用染料有：

碱性染料：结晶紫、碱性复红、龙胆紫、番红、中性红、孔雀绿等。

酸性染料：酸性复红、刚果红、曙红等

简单染色一般常用碱性染料进行染色

原因：在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，带正电荷，因此碱性染料很容易与细菌结合使细菌着色

细菌细胞壁含有蛋白质或多肽，也就有等电点

已知细菌的等电点pH为2～5。革兰氏阳性菌为2～3，革兰氏阴性菌为4～5。

当细菌的培养液pH值大于等电点时，细菌带有负电荷；反之，带有正电荷。

一般，细菌的培养、染色、试验过程均在偏碱性（7～7.5）、中性、偏酸性（6～7）条件下，都高于细菌的等电点，故均带有负电荷

革兰氏染色

革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法，根据细菌对这种染色反应的不同，可分为革兰氏阳性和革兰氏阴性两大类，其机理是由于细菌细胞壁的化学组成及结构不同和通透性不同的缘故。

革兰氏染色对于细菌的分类、鉴定及食品卫生检测都有重要意义。

革兰氏染色原理

影响革兰氏染色结果的因素

菌龄

培养基pH值

染色技术：涂片质量、染色时间、脱色时间、染色脱色均匀度等

三、实验器材

1. 器材：显微镜，擦镜纸，二甲苯，香柏油，载玻片，接种环，酒精灯,火柴，吸水纸，无菌牙签。

2. 染色液及试剂：石碳酸复红染液、碱性美蓝染液、结晶紫染色液，路戈氏碘液，95％的酒精，蕃红染色液，黑色素水溶液，蒸馏水。

3. 菌种：白葡萄球菌、大肠杆菌的新鲜斜面菌种各1支。

四、操作步骤

（一）简单染色

涂片

火焰固定

染色

水洗

干燥

镜检

（二）革兰氏染色

涂片→干燥→火焰固定

结晶紫染色→水洗

碘液媒染

95%酒精脱色→水洗

蕃红复染→水洗

干燥

镜检

（三）口腔中微生物观察

负染色

五、实验报告

1、实验结果绘图

2、思考题

（1）细菌制片过程应注意哪些？

（2）试分析菌龄、培养pH、染色技术对革兰氏染色结果的影响。

（3）现有一未知杆菌，个体明显大于大肠杆菌，如何确定该菌革兰氏染色性质，并确定你的结果正确？

（4）你对该实验教学的建议？

预习作业

1、芽孢、荚膜、鞭毛在染色观察时有何特殊性？

2、加热在芽孢染色中的作用是什么？