重组降血压肽VLPVPR酶解制备工艺优化及降解原因分析
降血压肽研究进展
降血压肽研究进展许伟瀚;双全;吴楠【摘要】The prevention and cure of hypertension had drawn public attention.Antihypertensive peptides earned people's concern because they had good effect on blood pressure regulation and no other side effects.In this article we give a review on recently study of Antihypertensive peptides,anticipating to give a reference for further research.It will be an theoretical reference for antihypertensive peptides industrial production,and pro-vide new options for hypertension prevention and treatment.%公众早已重视高血压病的防治,降血压肽以其高效的降压效果且无毒性、无副作用,受到人们的广泛关注.综述近年来降血压肽的研究进展,希望为降血压肽的进一步研究提供依据,为预防和治疗高血压提供新的选择,为降压药物或功能性食品的产业化生产提供理论参考.【期刊名称】《食品研究与开发》【年(卷),期】2017(038)005【总页数】5页(P216-220)【关键词】降血压肽;作用机理;制备;活性检测【作者】许伟瀚;双全;吴楠【作者单位】内蒙古农业大学食品科学与工程学院,内蒙古呼和浩特 010018;内蒙古农业大学食品科学与工程学院,内蒙古呼和浩特 010018;内蒙古农业大学食品科学与工程学院,内蒙古呼和浩特 010018【正文语种】中文高血压作为冠心病、外周动脉疾病及中风重要诱因，严重危害着人类的健康，在西方国家平均每三人就有一人受到高血压的威胁[1]。
重组降血压肽IYPR的分离与稳定性研究
重组降血压肽IYPR的分离与稳定性研究黄六容;王薇薇;马海乐;白慧敏;鞠英姿;雷雪香【摘要】研究了大肠杆菌表达的降血压肽IYPR（Ile—Tyr—Pro—Arg）的分离纯化过程，并分析了其活性稳定性。
大肠杆菌细胞经过超声提取和亲和层析得到重组蛋白，然后经过肠激酶和胰蛋白酶酶切、凝胶过滤得到肽IYPR，测定了IYPR经过不同的温度、pH和消化道酶处理后的活性变化。
结果表明，亲和层析后重组蛋白的纯度达到了约90％，肠激酶酶切重组蛋白后利用透析法将串联多肽IYPR和6×His标签成功分离，串联多肽经过胰蛋白酶酶切和凝胶过滤后得到了单体肽IYPR。
IYPR在90℃处理1h时，其活性为原来的98％，在pH为2—10的水溶液处理5h时活性保持不变，经过胃蛋白酶消化后，其活性升高了13％。
这些特性为重组降血压肽IYPR作为高血压病的防治药物的深入研究提供了参考。
%This research mainly dealt with the purification and stability of recombinant peptide IYPR(Ile-Tyr- Pro-Arg) expressed in E. coli. The inclusion bodies were washed, separated from the cells by ultrasound assisted ex- traction. After purification by affinity chromatography, recombinant protein was cleaved with enterokinase and trypsin. The purified IYPR was collected from gel filtration. The information had also been realized regarding the activity of purified IYPR under different conditions including temperature, pH and gastrointestinal proteases. The results showed that the recombinant protein was recovered with a high purity of about 90 % by affinity chromatography. The series peptide of IYPR and the 6 x His tag were successfully isolated by dialysis. Peptide IYPR was obtained by cleavage of the recombinant protein with trypsin. When the sample washeated at 90 ℃ for 1 h, the activity of IYPR was reduced to 98 % of the original. Incubation in aqueous solutions (from pH 2 to 10) for 5 h didn' t change the activity of IYPR. When the peptide was digested by pepsin, its activity was increased by 13.0 %. The data obtained provided a good reference for further development of peptide IYPR into an effective antihypertensive agent for prevention and treatment of hypertension.【期刊名称】《食品与发酵工业》【年(卷),期】2012(038)009【总页数】5页(P33-37)【关键词】降血压肽;纯化;稳定性;活性【作者】黄六容;王薇薇;马海乐;白慧敏;鞠英姿;雷雪香【作者单位】江苏大学食品与生物工程学院江苏省农产品物理加工重点实验室,江苏镇江212013;江苏大学食品与生物工程学院江苏省农产品物理加工重点实验室,江苏镇江212013;江苏大学食品与生物工程学院江苏省农产品物理加工重点实验室,江苏镇江212013;江苏大学食品与生物工程学院江苏省农产品物理加工重点实验室,江苏镇江212013;江苏大学食品与生物工程学院江苏省农产品物理加工重点实验室,江苏镇江212013;江苏大学食品与生物工程学院江苏省农产品物理加工重点实验室,江苏镇江212013【正文语种】中文【中图分类】TS201.21高血压是常见的心血管疾病，发病率高，常伴有心脏、血管、肺以及肾脏等器官功能性或器质性改变，是引发心、脑、肾和眼血管等各种并发症的一个重要危险因素［1］。
响应面法优化青蛤降血压肽酶解制备工艺
响应面法优化青蛤降血压肽酶解制备工艺作者：詹秋桂李杰煌施鹏飞雷鸣罗李王余方苗来源：《安徽农业科学》2018年第05期摘要[目的]采用响应面法优化青蛤降血压肽的酶解制备工艺。
[方法]以青蛤肉为原料，木瓜蛋白酶为酶种，血管紧张素转换酶抑制率为指标，在单因素试验的基础上，选择pH、酶解时间和料液比为影响因素，进行3因素3水平的Box-Behnken试验设计，采用响应面法分析3个因素对青蛤降血压肽制备工艺的影响。
[结果]木瓜蛋白酶酶解制备青蛤降血压肽的最佳工艺条件为pH 5.8、酶解时间8.4 h、料液比1∶3.1，该条件下酶解产物对血管紧张素转换酶抑制率达93.58%。
[结论]该研究为青蛤的高值化利用和降血压肽的制备提供了新思路。
关键词青蛤；木瓜蛋白酶；降血压肽；响应面法中图分类号S-3文献标识码A文章编号0517-6611（2018）05-0007-03Abstract[Objective]Enzymatic hydrolysis process for preparing antihypertensive peptides from Cyclina sinensis was optimized by using response surface methodology.[Method]Taking angiotensinconverting enzyme （ACE） inhibition rate as index，a 3factor and 3level BoxBehnken design coupled with response surface analysis was carried out to investigate the effects of pH，hydrolysis time and solidliquid ratio on ACE inhibition rate.[Result]The optimal conditions for preparing antihypertensive peptides from Cyclina sinensis by using papain were as followed：pH 5.8，hydrolysis time 8.4 h and solidliquid ratio1：3.1，and the ACE inhibition rate of enzymatic hydrolysates were up to 93.58% under these conditions.[Conclusion]This study provides novel ideas for the highvalue use of Cyclina sinensis and preparing antihypertensive peptides.Key wordsCyclina sinensis；Papain；Antihypertensive peptides；Response surface methodology我国成年人高血压的发病率约为30%，血压升高易引发脑卒中、心肌梗死、肾衰竭、冠心病等心血管疾病，每年因高血压导致死亡人数高达200万，防治高血压成为研究的热点[1]。
酶解核桃蛋白制备降血压肽的工艺优化
[16] 郑喜群, 刘晓兰, 王晓杰,等. 挤压膨化玉米黄粉酶解制备生物活 性肽[J]. 食品与发酵工业, 2005, 31(8): 1-3
[17] 杜双奎, 魏益民, 张波. 挤压膨化过程中物料组分的变化分析[J]. 中国粮油学报, 2005, 20(3): 39-43
贵州 贵阳 550005；3. 贵州省果品加工工程技术研究中心，贵州 贵阳 550005； 4. 贵州大学生命科学学院，贵州 贵阳 550025）
摘 要：以蛋白质含量为 88 %的核桃蛋白为试验原料，利用碱性蛋白酶对其进行酶解，采用酶解产物血管紧张素转 换酶（angiotensin converting enzyme，ACE）抑制率为检测指标。考察酶解温度、pH 值、加酶量以及底物浓度这 4 个因素 对酶解产物 ACE 抑制率的影响，通过响应面优化试验，重复 3 次验证性试验，最后确定酶解的最佳工艺条件酶解温 度、pH 值、加酶量、底物浓度分别为：可达 60.23 %。经超滤分 离，得到小于 3 kDa 分子量的核桃降压肽，IC50 值最低为 0.389 3 mg/mL，其 ACE 抑制活性最高。 关键词：降血压肽；制备工艺；蛋白质；酶解；超滤分离
mulberry and their scavenging effects on superoxide radicals [J]. Food Chemistry, 1999, 64(4): 555-559 [13] 彭伟, 钱海峰, 周惠明. 挤压膨化对脱脂和全脂小麦胚芽营养品 质的影响[J]. 食品工业科技, 2008, 29(3): 267-270 [14] 周小理, 钱韻芳, 周一鸣,等. 不同处理工艺对苦荞麸皮膳食纤维 体外抗氧化活性的影响[J]. 食品科学, 2011, 32(8): 1-4 [15] 李杰, 罗志刚, 肖志刚,等. 挤压超声联用提取米糠多糖工艺优化 [J]. 农业机械学报, 2013, 44(3): 174-179
胰蛋白酶水解工程菌表达产物制备重组降血压肽
胰蛋白酶水解工程菌表达产物制备重组降血压肽卢真保1，刘冬2，李世敏2，喇文军2，梁世中1（1.华南理工大学生物科学与工程学院，广东 广州 510641）（2.深圳职业技术学院化生学院，广东 深圳 518055）摘要：本实验研究了胰蛋白酶对工程菌E.coli BL21表达产物的酶解作用，以酶解产物降血压多肽VLPVPR含量为指标，分析pH值、酶解温度、酶浓度和酶解时间等因素对酶解反应的影响。
结果表明，最佳酶解条件为：酶解温度37 ℃，pH 8.0，酶浓度90 U/mL，酶解时间4 h。
在此条件下酶解产物VLPVPR含量为211.1 mg/L。
关键词：胰蛋白酶；酶解；VLPVPR中图分类号：Q516；文献标识码：A；文章篇号:1673-9078(2008)05-0412-04Preparation of Recombinant Antihypertensive Peptide by Trypsin-catalyzed Hydrolysis of Expressive Products of EngineeringBacteriaLU Zhen-bao1, LIU dong2, LI Shi-min2, LA Wen-jun2 , LIANG Shi-zhong1（1. School of Bioscience and Biotechnology, South China University of Technology, Guangzhou 510640, China）（2.School of Chemical and Biological Engineering, Shenzhen Polytechnic College, Shenzhen 518055, China）Abstract: Trysin-catalyzed hydrolysis of expressive products of recombinant E.coli BL21 was studied. Results showed that the best reaction temperature, pH, enzyme dosage and reaction time were 37 ℃, 8.0, 90 U/mL, and 4 h, respectively, under which the concentration of VLPVPR was up to 211.1 mg/L.Key words: trypsin; enzymatic hydrolysis; VLPVPR降血压肽(antihypertensiv peptide, AHP)是一类降低人体血压的小分子多肽，通过抑制肾素-血管紧张素调节系统(renin-angiotensin system, RAS)的血管紧张素转化酶(angiotensin converting enzyme, ACE)活性而降低血压[1~2]。
抗高血压肽IYPR的原核表达、纯化与活性分析
抗高血压肽IYPR的原核表达、纯化与活性分析抗高血压肽是一种血管紧张素转化酶(Angiotensin I-Converting Enzyme,ACE)抑制剂,通过抑制ACE的活性,调节肾素-血管紧张素系统和激肽释放酶-激肽系统来起到降血压的作用。
它具有安全性高、效果专一无副作用、易被人体消化吸收、稳定性好等特点,广泛受到患者的青睐。
目前为止,抗高血压肽的生产基本都是通过酶解法生产制备得到,但是酶解法分离纯化工艺复杂、产量低。
为了找到简单经济的制备抗高血压肽(简称降血压肽)的方法,给新型降血压产品的生产研究提供理论基础和科学依据,本课题的研究目的是构建表达降血压肽IYPR(Ile-Tyr-Pro-Arg)的基因工程菌,并对该菌进行诱导表达、分离纯化表达产物、分析产物的生物活性和稳定性等,并研究超声法对工程菌的生长和重组蛋白表达的影响,主要研究内容及结果如下:1.根据IYPR的氨基酸序列和大肠埃希杆菌(Escherichiacoli,E.coli,又称大肠杆菌)BL21(DE3)偏爱的密码子,人工设计并合成了目的基因序列,该基因序列与载体通过酶切、目的序列回收和连接等步骤,构建了表达载体pET-30a(+)-IR,然后将该载体转化到大肠杆菌中,从转化的平板中筛选出阳性重组子,该重组子经过菌落PCR鉴定和基因测序,结果显示构建的基因工程菌中的目的基因符合设计要求,无移码和错码。
2.将构建的基因工程菌利用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达,并研究不同IPTG浓度、不同诱导时间、培养基组成和外源添加物对表达效果的影响,利用Tricine-SDS-PAGE电泳对表达情况进行检测分析。
结果显示,与未进行诱导的菌株相比,经过IPTG诱导的工程菌在分子量大小约8.0 kDa左右有明显的蛋白表达,且这一蛋白分子量大小与设计的分子量大小吻合。
在选用的五种培养细菌的常用培养基LB、TB、SOC、SOB及2×YT中,通过诱发培养发现,LB液体培养基是最好的,在LB中添加5mmol/LEDTA、1%葡萄糖、5 mmol/L Ca2+和5 mmol/L Mg2+等对重组蛋白的表达没有起到任何促进作用。
酶解核桃蛋白制备降血压肽的工艺优化
酶解核桃蛋白制备降血压肽的工艺优化裴璞花;安传相;刘晓燕;马立志;陈鸿申【摘要】以蛋白质含量为88％的核桃蛋白为试验原料,利用碱性蛋白酶对其进行酶解,采用酶解产物血管紧张素转换酶(angiotensin converting enzyme,ACE)抑制率为检测指标.考察酶解温度、pH值、加酶量以及底物浓度这4个因素对酶解产物ACE抑制率的影响,通过响应面优化试验,重复3次验证性试验,最后确定酶解的最佳工艺条件酶解温度、pH值、加酶量、底物浓度分别为:55℃、9.0、7300 U/g、2.7％,酶解物的ACE抑制率平均可达60.23％.经超滤分离,得到小于3 kDa分子量的核桃降压肽,IC50值最低为0.3893 mg/mL,其ACE抑制活性最高.【期刊名称】《食品研究与开发》【年(卷),期】2018(039)014【总页数】7页(P69-75)【关键词】降血压肽;制备工艺;蛋白质;酶解;超滤分离【作者】裴璞花;安传相;刘晓燕;马立志;陈鸿申【作者单位】贵州大学酿酒与食品工程学院,贵州贵阳550025;贵州大学酿酒与食品工程学院,贵州贵阳550025;贵阳学院食品与制药工程学院,贵州贵阳550005;贵州省果品加工工程技术研究中心,贵州贵阳550005;贵阳学院食品与制药工程学院,贵州贵阳550005;贵州省果品加工工程技术研究中心,贵州贵阳550005;贵州大学生命科学学院,贵州贵阳550025【正文语种】中文高血压是指在静息状态下或未服用降压药物，动脉收缩压或舒张压升高为特征的“心血管综合症”，被世界公认为是人类健康“无形杀手”，近些年来，随着经济的飞速增长发病率也在逐年递增且呈现年轻化[1-2]。
高血压易引起患者中风及心脑、肾等器官的损害[3]。
因此对高血压的预防和治疗，是全球人民势在必行的任务[4-5]。
降血压肽又称血管紧张素转化酶（angiotensin converting enzyme，ACE）的抑制肽。
酶解罗非鱼下脚料制备降血压肽的研究
酶解罗非鱼下脚料制备降血压肽的研究作者：赵阔张红建陈艳邹易谢娇梅郑联合来源：《农产品加工·上》2018年第11期摘要：以罗非鱼加工下脚料为原料研究制备降血压肽的工艺。
首先，对比分析碱性蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和复合蛋白酶等6种蛋白酶水解罗非鱼下脚料的效果，从中筛选出复合蛋白酶作为目标酶，之后通过单因素试验和正交试验对复合蛋白酶酶解工艺进行了优化，最后得到最适酶解条件为酶解温度47 ℃，加酶量2 000 U/g，底物质量分数20%，pH值7.5，此工艺条件下酶解度和ACE抑制率分别达到77.45%和70.12%。
关键词：罗非鱼加工下脚料;降血压肽;水解度;ACE抑制率中图分类号：TS254.9; ; ; 文獻标志码：A; ; doi：10.16693/ki.1671-9646（X）.2018.11.003Study on Antihypertensive Peptides from Tilapia Heels by Enzymatic HydrolysisZHAO Kuo，ZHANG Hongjian，CHEN Yan，ZOU Yi，XIE Jiaomei，ZHENG Lianhe （Hainan Institute of Grain and Oil Science，Qionghai，Hainan 571400，China）Abstract：The experiment was carried out to study the preparation technology antihypertensive peptides with tilapia heels as raw material by enzymatic hydrolysis. Firstly，studied the enzymolysis effect of six enzymes（alkaline protease，pepsin，trypsin，neutral protease，papain，and compound protease）respectively on tilapia heels，and acreened the compound protease as target enzyme. Then optimization hydrolysis conditions were carried out through mono-factor and orthogonal experiments：temperature 47 ℃，the amount of enzyme 2 000 U/g，substrate concentration 20%，pH 7.5. Under this condition，the hydrolysis degree and ACE inhibition ratewere 77.45% and 70.12%，respectively.Key words：tilapia heels;antihypertensive peptides;hydrolysis degree;ACE suppression ratio高血压是困扰全球的一种心血管疾病，常伴有血管、大脑、心、肾等器官器质性病变，是诱发中风、冠心病、脑卒死、心肌梗死和肾功能衰竭的最主要因素，被称为“无声杀手”[1-3]，已发展成为一个十分严重的社会公共卫生问题[4]。
重组人胰高血糖素样肽前药的表达、纯化及生物活性分析
1. 1药品与试剂
胰蛋白胨、酵母提取物（OXOID公司）；琼脂粉、氨苄青霉素（Sigma公司）；IPTG（Promega公司）；金属螯合亲和层析介质（Ni-NTA，Invitrogen公司）；ECL发光试剂（PIERCE公司）；乙腈（CNCH3，色谱纯）、三氟乙酸（TFA，色谱纯）购自Merk公司；HPLC色谱柱（Waters公司）；GLP-1 antibody及二抗购自北京博奥森公司；对照药GLP-1购于美国多肽公司；D-葡萄糖（Sigma公司）；胰岛素ELISA试剂盒（美国Linco公司）。
马雪1，惠宏襄2，周颖1，何功浩1，孟静茹1，贾敏1，罗晓星1*（1.第四军医大学药学系，陕西西安710032；2.美国加州大学医学部，加利福尼亚洛杉矶90048）
基金项目：陕西省国际合作重点项目基金资助（No 05D018）；西安市重大攻关专项项目基金资助（NoZX06015）
作者简介：马雪，女，博士，助教
KEY WORDS:diabetes;hGLP-1; recombinant protein; prodrug
胰高血糖素样肽-1 (glucagon-like peptide-1，GLP-1)是肠道L细胞分泌的由30个氨基酸残基组成的肽类激素[1]。作为一种重要的肠促胰岛素（incretin），GLP-1通过多种途径参与血糖调节，对维持机体的葡萄糖稳态起着十分重要的作用[2]，其降糖作用严格依赖于血糖浓度，因此用于治疗糖尿病时不会出现低血糖的不良反应[3]，表现出良好的临床应用前景。然而，由于GLP-1在体内极易被二肽基肽酶（dipeptidyl peptidase IV，DPP IV）降解而失活，同时很容易从肾脏排出，故其生物半衰期仅2～6min，在很大程度上限制了其临床应用。此外，化学合成的GLP-1长效类似物成本高且产率低，也在一定程度上限制了其产业化规模生产。针对这些不足，我们采用前体药物设计思路，应用蛋白融合技术制备了重组人胰高血糖素样肽前药（Prodrug of recombinant human GLPs，Pro-rhGLPs）。体外无活性的Pro-GLP-1进入体内后，在特异性酶作用下缓慢降解，释放出多个活性GLP-1分子；同时，大分子的前体药物也不易从肾脏排出，在很大程度上延长了药物的作用时间。本研究通过建立Pro-rhGLPs高效表达、纯化方法，并对获得的Pro-rhGLPs蛋白进行体内生物学活性分析，为GLP-1相关药物的研发提供新的思路。
大豆降压肽的研制_酶E作用条件的优化
大豆降压肽的研制( )——酶E作用条件的优化吴建平 丁霄霖(无锡轻工大学食品学院,214036无锡市惠河路170号;第一作者,男,29岁,博士) 摘要:对酶E水解生成最高体外A CE抑制活性的条件进行了优化,研究了水解液的氨基酸组成与分子量分布。
关键词:优化 氨基酸组成 分子量分布 天然蛋白质除提供能量与合成人体蛋白质所必需的氨基酸外,新近发现的蛋白质所具有的特殊生理机能正越来越引起人们的关注,这就是所谓的蛋白质第三功能[1]。
现已发现源于食物蛋白的一些特殊序列具促吸收、降血压、调节血清中血脂水平[2、3、4、5]等功能。
尤其是对那些具调节血压功能活性肽的研究更是当今研究的热点,这些肽主要是血管紧张素转化酶的抑制剂。
血管紧张素转化酶(A ngi o ten sin converting enzym e,A CE,EC31411511)是一种需锌与氯激活的蛋白水解酶,在人体内通过肾素—血管紧张素系统(简称R SA)和激肽释放酶—激肽系统(简称KKS)参与血压的调节,后者又称激肽前列腺素系统R SA是升压系统,通过A CE作用于血管紧张素 从其C末端去掉H is-L eu生成的血管紧张素 ,这是肾素—血管紧张素系统中已知的最强的血管收缩剂,作用于小动脉,使血管平滑肌收缩,迅速引起升压效应,同时血管紧张素 通过刺激醛固酮分泌和直接对肾脏作用(减少肾血流理及促进N a+、K+的重吸收),引起钠贮量和血容量的增加,也能使血压升高,与此相反,KKS是降压系统,又称抗高压因子,其中激肽是降压物质。
A CE在该系统中通过作用于舒缓激肽使其失去C末端的Phe-A rg与Ser-p ro,从而使激肽降解为失活片段,也引起血压升高。
1970年Yang等证实二者为同一种酶,因此,A CE又称激肽酶 ,由此可见,A CE通过作用R SA和KKS系统,共同使血压升高[6、7]。
不难想象,对肾素活性高的原发性高血压患者,如果服用A CE的抑制剂,则血管紧张素 的生成和激肽的破坏均减少,血压必然下降,从而达到治疗的目的,这对占高血压总数的95%以上的原发性高血压患者与医务人员来说无疑具重大实际意义。
一种复合蛋白酶酶解核桃粕制备降血压肽的方法[发明专利]
![一种复合蛋白酶酶解核桃粕制备降血压肽的方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/325b9b92a417866fb94a8e5b.png)
专利名称：一种复合蛋白酶酶解核桃粕制备降血压肽的方法专利类型：发明专利
发明人：孙秀兰,叶永丽,祝素莹,张银志,耿树香,宁德鲁
申请号：CN201911109923.X
申请日：20191114
公开号：CN110819674A
公开日：
20200221
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种复合蛋白酶酶解核桃粕制备降血压肽的方法，属于食源性蛋白深加工技术领域。
本发明对蛋白酶制剂进行筛选复配，优化酶解工艺条件，制备得到高活性的核桃蛋白源降血压肽。
酶解核桃蛋白最佳工艺条件为：复合酶比例1:2(碱性蛋白酶:中性蛋白酶)、底物浓度4％、酶解温度45℃、pH值8.0、酶添加量8000U/g、酶解时间60min。
对多肽产品的性质进行比较分析，发现产品的相对分子质量主要集中于0‑2kDa范围内，具有较好的常温储存稳定性及体外消化稳定性，为产品的工业化生产与实际应用提供理论基础。
申请人：江南大学
地址：214000 江苏省无锡市滨湖区蠡湖大道1800号
国籍：CN
代理机构：哈尔滨市阳光惠远知识产权代理有限公司
代理人：仇钰莹
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