血细胞分离培养
外周血细胞分离的方法有几种
外周血中除红细胞外，还有粒细胞、单核细胞和淋巴细胞及血小板等，通常是分离这些血细
胞的重要来源。
其分离方法有四种：自然沉降法、差异沉降法、氯化铵分离法、Ficoll分离法。
自然沉降法：
将无菌抗凝血放入试管中，在37℃水浴中静置，自然沉降1-2h，可见到红细胞下沉，并有明显分层，上层血浆中富含有大量的和淋巴细胞，下层主要为红细胞。
此方法简便但各层中
的细胞种类多，不纯。
血浆中虽以粒细胞、淋巴细胞为主，但也含有血小板，大单核细胞和
少量红细胞。
下层虽以红细胞为主，但也有上述各种细胞，此法适用于淋巴细胞转化试验。
差异沉降法：
用6%的右旋糖酐或3%的明胶溶液无菌消毒后，分装于中试管中，由于这些物质能使红细胞
形成“串状”，比粒细胞、淋巴细胞沉降速度快，因而可使红细胞与白细胞、淋巴细胞分离开。
其方法如下：用6%的右旋糖酐溶液5-10ml，经抗凝血5ml加入上层中混合后静置于37℃水
浴中30-60min，即可见红细胞下沉，上层富含大量粒细胞和淋巴细胞，下层为红细胞，使两
者易于分离开，取上层可用于粒细胞、淋巴细胞培养和实验，下层可用于红细胞培养和实验，经PBS洗3次后即可加入培养基培养，可用于天然白细胞干扰素的诱生和生产。
此法分离的细胞纯度也不高。
氯化铵分离法：
0.83%氯化铵（NH4CL）可使红细胞破裂，通常将分离获得的粒细胞。
淋巴细胞中混有的少
量的红细胞用0.83%氯化铵进行裂解，以排除红细胞的干扰。
另外，此法也适合大量粒细胞、淋巴细胞的分离制备，在天然白细胞干扰素诱生和生产中已被广泛应用。
人外周血单核细胞(PBMC)分离及培养
Ficoll是蔗糖的多聚体，呈中性，平均分子量为400,000，当密度为1.2g/ml仍未超出正常生理性渗透压,也不穿过生物膜。红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重，离心后漂浮于分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中。吸取分层液液面的细胞，就可从外周血中分离到单个核细胞。
③取两支15ml离心管，先加入5ml Ficoll溶液。然后将稀释的血液轻轻加到两支离心管的ficoll上层，一定要轻柔，避免两种溶液混合在一起，每只离心管各10ml稀释血液；
④2,000rpm，20min，注意，降速设置中一定要设置成no break，或者只有1-2成的制动。离心完毕将得到如图所示分层；
双抗P/S （Penicillin/ Streptomycin) (GIBCO)
二甲亚砜（DMSO）（SIGMA）
预先装好异丙醇的冻存盒
方法/步骤：
①配制所需的溶液：
a. 细胞培养基：RPMI 1640+10% FBS+1% P/S；
b. 细胞冻存液：FBS中加入10%DMSO；
②将10ml全血转入50ml离心管中，加入10ml PBS溶液稀释，轻轻混匀；
⑤PBMC所在细胞层为白色。此时可以用吸管将该层细胞吸取在另一干净的15ml离心管中。
血细胞分离培养方法和步骤-2
血细胞分离培养方法和步骤-2收集浑浊带分离获得的淋巴细胞，用无钙、镁离子的PBS洗3次后，再用培养基洗1次后计数，分瓶培养。
此法分离获得淋巴细胞纯度高。
分离液的制备：9% Ficoll（20℃下相对密度约1.020）24份与33.4%泛影葡胺（用泛影钠或Conray400也可，在20℃下相对密度约1.200）10份混合后，将其相对密度调至1.077金额可获得淋巴细胞分离液，于12 1℃高压蒸汽灭菌30min，室温保存备用。
若配制高相对密度的分离液用加入高浓度泛影葡胺来调整，若配制低相对密度的分离液用稀释的F icoll来调整。
（二）淋巴器官中淋巴细胞的分离：从脾脏、淋巴结、扁桃体或胸腺等器官中制备淋巴细胞悬液，在免疫学研究中是经常用到的。
方法如下。
无菌取上述淋巴器官，若为扁桃体，应将扁桃体在剥离外表的结缔组织和血块后，在含高浓度抗生素的洗液中4℃浸泡2-4h，以防污染。
将淋巴器官剪成碎块，用镊子压挤碎块，或在金属丝网上研磨，用洗液冲洗，或用玻璃匀浆器研磨，制成悬液。
自然下沉10min后，吸取上层细胞悬液，弃去下层沉淀的组织块，1500 r/min离心，取沉淀物，用无钙、镁离子的PBS洗2次后，混悬于培养基中，分瓶培养。
用上述分离法所获得的拎包细胞，可用于白细胞黏附移动试验、转化试验、细胞毒试验，同时可用于细胞因子的诱生和制备，或扩增外周血造血细胞、树突细胞、淋巴因子激活杀伤细胞(LAK细胞)、Tδ细胞等，供细胞移植用。
（三）人脐带血细胞分离培养：人脐带血来源方便，采集容易，对母婴均无伤害。
近年来研究表明，脐带血的血浆中富含许多高水平的造血活性物质，具有刺激和促进骨髓造血干/祖细胞增殖、分化和再植能力的功能，是造血生长因子的重要来源。
脐带血中富含类似于骨髓的造血干细胞，其中CFU-G、BFU-E、CFU-GM近似或高于正常成人骨髓和外周血中的造血干/祖细胞，比骨髓更原始，具有很强的自我复制和再植能力。
人视网膜血管内皮细胞的分离与培养
人视网膜血管内皮细胞的分离与培养作者：李琼徐国兴来源：《海峡科学》2007年第12期[摘要] 目的：探讨人视网膜血管内皮细胞的体外分离和选择性培养方法。
方法：将人视网膜通过剪碎、匀浆、过筛、胶原酶消化处理后，结合密度梯度离心和物理刮除等分离方法获得较纯的视网膜血管内皮细胞，接种于纤维连接蛋白包被的培养瓶中，并采用含内皮细胞生长因子和肝素的培养基促进内皮细胞贴壁生长，观察细胞生长状况，并应用免疫组化方法进行鉴定。
结果：培养的细胞成典型的铺路石样生长，Ⅷ因子相关抗原免疫组化染色为阳性，细胞纯度达98%以上。
结论：本实验方法简单易行，培养出的人视网膜血管内皮细胞纯度高、生长状态良好，并可稳定传代，为视网膜血管疾病的基础研究提供有效的模型建立方法。
[关键词] 视网膜微血管内皮细胞细胞培养许多视网膜疾病如糖尿病性视网膜病变、年龄相关性黄斑变性等均与视网膜血管病理性改变密切相关。
随着对视网膜血管性疾病的研究深入发现视网膜血管内皮细胞是血管病变过程中的关键细胞。
通过体外分离培养视网膜血管内皮细胞获得大量完整、纯度高的内皮细胞，从而对其进行形态、结构、生理功能和病理变化等方面的观察，为视网膜血管性疾病研究提供体外模型。
本实验综合国内外几种方法，以人视网膜为材料，探索简便、有效的人视网膜微血管内皮细胞的培养方法。
现报告如下：1 材料与方法1.1 材料0.1%Ⅱ型胶原酶（Sigma公司，美国）、胎牛血清(Gibco公司，美国) 、DMEM培养液(Gibco公司，美国)、含0.02%EDTA的0.25%胰酶(Gibco公司，美国)、纤维连接蛋白（Sigma 公司，美国）、内皮细胞生长因子ECGF(Sigma公司，美国) 、Percoll分离液（Gibco公司，美国）、肝素（Sigma公司，美国）、PBS（Sigma公司，美国）、培养瓶、培养皿、眼科器械、匀浆器、吸管、离心管、细胞筛、第Ⅷ因子相关抗原抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司)，完全培养液：DMEM培养液+15%FBS+90ug/ml肝素+0.1ug/L的ECGF，培养瓶：培养前1天用10ug/cm2纤维连接蛋白包被。
血细胞分离机的作用
血细胞分离机的作用
血细胞分离机是一种用于分离血液中的不同成分的医疗设备。
它通过特定的程序和离心技术，将血液中的红细胞、白细胞、血小板等成分分离出来，用于治疗各种疾病和进行科学研究。
血细胞分离机的作用包括：
1.成分分离：通过血细胞分离机，可以将血液中的各种成分分离出来，如红
细胞、白细胞、血小板等，用于不同疾病的治疗和诊断。
2.去除病理性细胞：血细胞分离机可以去除血液中的病理性细胞，如肿瘤细
胞、细菌、病毒等，从而达到治疗疾病的目的。
3.输血：血细胞分离机可以用于输血，将适量的血液成分输给患者，以补充
其血容量或改善其血液成分。
4.制备免疫细胞：血细胞分离机可用于制备免疫细胞，如淋巴细胞、单核细
胞等，用于免疫治疗和肿瘤治疗。
5.制备细胞培养基：通过血细胞分离机分离出的不同细胞成分，可用于制备
细胞培养基，用于细胞培养和生物医学研究。
总之，血细胞分离机在医疗和科研领域中发挥着重要作用，能够有效地分离血液中的不同成分，为各种疾病的治疗和诊断提供帮助。
人周血淋巴细胞分离液技术要求
人周血淋巴细胞分离液技术要求引言：人周血淋巴细胞是免疫系统中重要的组成部分，它们对于疾病的预防和治疗具有重要意义。
因此，人周血淋巴细胞分离液技术的发展和应用具有重要的临床和科研意义。
本文将从实验设备、试剂和实验操作等方面介绍人周血淋巴细胞分离液技术的要求。
一、实验设备1.高速离心机：用于离心样品，获得血细胞和血浆分离。
2.恒温振荡器：调节培养基的温度和震荡条件，确保细胞的生长和生存条件。
3.显微镜：观察细胞培养的状况，判断细胞的活性和纯度。
4.细胞计数仪：准确计算细胞数目，掌握细胞的生长和增殖情况。
二、试剂2.淋巴细胞分离液：选择合适的分离液，如密度梯度离心法、免疫磁珠分离法等。
分离液应具有高分离效率和良好的细胞生存率。
3.培养基：如RPMI-1640培养基等，含有必需氨基酸、维生素、矿物质和生长因子等，提供细胞所需的养分和生存环境。
4.细胞增殖试剂：如PHA（植物血球凝集素）、IL-2（白细胞介素-2）等，用于促进淋巴细胞的增殖和活化。
5.细胞保存液：含有冻存缓冲剂和细胞保存剂，保证细胞冷冻保存时的细胞活性和纯度。
三、实验操作2.制备分离液：根据所选的细胞分离方法，制备稀释好的分离液，注意消毒操作，避免污染。
3.样品离心：将血样离心分离，获得血浆和血细胞层。
4.加入分离液：将分离液缓慢注入离心管中，加入足量的分离液以确保细胞的分离效果。
5.离心分离：根据分离液的密度和离心速度，进行适当的离心分离操作，获得淋巴细胞层。
6.细胞计数和检测：使用细胞计数仪计数和检测细胞的活性和纯度，根据需求调整细胞浓度。
7.细胞培养：将分离得到的淋巴细胞进行培养，在恒温振荡器中培养细胞，提供养分和生长环境，促进细胞的增殖和活化。
8.细胞保存：将培养得到的淋巴细胞分装到冻存管中，添加细胞保存液，迅速置于液氮中进行冻存，保存好的细胞可供后续实验和应用。
结论：。
造血细胞分离、集落培养及表型分析
造血细胞分离、集落培养及表型分析所谓造血干细胞（hematopoietic stem cells，HSC，）是指具有自我更新和多向分化能力的一类细胞。
它的基本特性是具有自我更新能力，即经过一个细胞周期活动之后，可以产生两个与分裂前性质相同的造血干细胞,同时又具有多向分化能力，即在一定的环境条件下，造血干细胞具有向各系血细胞分化的能力。
图1 造血系统和造血干细胞分化图Fig。
1 hematopoietic system and hematopoietic stem cell differentiation.造血干细胞主要存在于骨髓、动员的外周血、脐血中，与骨髓和动员的外周血相比，脐血来源丰富、受病毒污染的几率小、富含造血干细胞且所含的造血干细胞具有更高的增殖潜能，同时脐血中的淋巴细胞幼稚，具有较低的免疫排斥活性，是优良的造血干细胞来源。
造血干/祖细胞鉴别的传统方法还是应用集落分析方法，它可检测粒-巨嗜细胞集落形成单位（colony - forming unit-granulocyte/ macrophage，CFU-GM）、红系爆式集落形成单位（burst-forming unit-erythroid，BFU-E）、巨核细胞集落形成单位（colony-forming unit-megakaryocyte，CFU-MK）、红系-粒系-巨嗜系-单核系集落形成单位（multipotent colony-forming units，CFU-GEMM或mixed colony-forming unit，CFU-Mix），等等，它是在半固体培养基上培养14天，然后在显微镜下计数集落。
造血干细胞的表面标志随着个体发育的不同时期不同，CD34+、CD38-、HLA-DR-、Thy-1+、c-kit+、LFA-1-、CD45RA-、CD71-、lin-已经普遍被认为是造血干细胞的标志。
此外，1997年发现一个新的造血干细胞标志是AC133，但具CD34抗原是目前公认的造血干细胞和祖细胞的共同标志。
血细胞分离机
血细胞分离机血细胞分离机是一种用于分离不同种类血细胞的设备，广泛应用于医疗领域。
它通过不同的物理或化学性质，如细胞大小、密度、表面性状等，将混合的血液样本中的不同类型的细胞有效地分离出来，为医生提供快速、可靠的检测结果，帮助诊断各种疾病。
血细胞分离机的原理和操作方法如下：原理血细胞分离机基于不同种类血细胞（如红细胞、白细胞、血小板等）在离心机、过滤器或离子梯度管等分离设备中沉降速度、密度或其他特性的差异。
通过对这些细胞特性的差异进行有效分离，从而实现血细胞的分离和富集。
操作方法1.准备血液样本：将采集的血液样本按照操作规范进行标本处理，确保样本质量符合要求。
2.样本处理：将准备好的血液样本加入血细胞分离机中，根据设备指引进行操作。
3.血细胞分离：通过设备中的分离模块，根据设定的参数快速分离红细胞、白细胞和血小板等不同种类的血细胞。
4.结果收集：待分离完成后，收集不同种类的血细胞并进行后续检测或研究。
应用领域血细胞分离机在临床医学、实验室检测等多个领域有着广泛的应用，其中包括但不限于： - 临床诊断：通过分离血细胞，辅助医生进行疾病诊断和监测，如血液系统疾病、感染性疾病等。
- 实验室研究：在科研领域，血细胞分离机可用于纯化不同种类的血细胞，帮助研究人员进行相关实验和研究。
- 输血医学：用于提取和净化输血所需的不同种类血细胞，确保输血过程的安全和有效性。
未来发展随着医疗技术的不断发展和血液学研究的深入，血细胞分离机的性能将不断提升，应用领域也将进一步拓展。
未来可能会出现更加智能化、高效化的血细胞分离设备，以满足不断增长的医学需求，并为人类健康提供更好的保障。
血细胞分离机在医疗、科研和其他领域的作用不可忽视，其高效、精准的分离技术为医学研究和诊疗工作带来了极大便利和帮助。
随着科技的不断进步，相信血细胞分离机在未来会发挥越来越重要的作用，为人类健康事业做出更大的贡献。
原代造血干细胞培养
原代造血干细胞培养
1. 细胞来源，造血干细胞可以从骨髓、外周血或者胎盘等多种来源获得，不同来源的细胞可能有不同的特性，需要根据实验目的选择合适的来源。
2. 细胞分离，从原代组织中分离出造血干细胞需要使用适当的分离方法，比如密度梯度离心、免疫磁珠分选等，以保证分离的细胞具有较高的纯度和活力。
3. 培养条件，原代造血干细胞在体外培养时需要提供适当的营养物质、生长因子和培养基，同时也需要控制适当的温度、湿度和气体环境，以提供良好的生长条件。
4. 培养监测，在培养过程中需要定期观察细胞的形态、增殖情况和表型特征，以及对细胞进行鉴定和纯度检测，确保培养的细胞符合实验要求。
5. 应用领域，原代造血干细胞培养在干细胞治疗、造血系统疾病研究、药物筛选等领域具有重要的应用前景，可以为相关疾病的治疗和研究提供重要的实验材料。
综上所述，原代造血干细胞培养是一项复杂而重要的实验技术，需要在细胞来源、分离方法、培养条件和监测等方面进行严格的操
作和控制，以确保获得高质量的细胞用于后续的研究和应用。
脐带血间充质干细胞的分离培养和鉴定
脐带血间充质干细胞的分离培养和鉴定概述脐带血间充质干细胞（Wharton’s jelly mesenchymal stem cells, WJ-MSCs）是一类来源于脐带的干细胞。
WJ-MSCs具有较强的增殖能力、多向分化潜能、免疫调节功能等，是目前研究领域中备受关注的干细胞类型之一。
在该文档中，我们将介绍如何从脐带血样中分离出WJ-MSCs，并进行相关的细胞培养和鉴定。
分离过程脐带血样获取首先需要从人体获得脐带血样。
脐带血样一般可以在婴儿出生后通过脐带穿刺等方式获取。
获取脐带血样需要得到母亲的同意，并通过相关机构进行规范化处理。
分离WJ-MSCs脐带血样获取后，需要将其中的WJ-MSCs进行分离。
具体分离步骤如下： 1.将脐带血样转移至离心管中； 2. 加入相同体积的PBS，并轻轻混合； 3. 通过低速离心分离脐带血样中的血细胞等成分； 4. 取下沉后的WJ组织，加入胶原酶等酶类消化物进行消化，离心分离细胞； 5. 通过细胞培养等方式扩增细胞数量。
细胞培养在分离得到WJ-MSCs之后，需要进行相关的细胞培养。
具体培养步骤如下：1. 将分离得到的WJ-MSCs转移至新的培养皿中； 2. 加入含有10% FBS的DMEM低糖培养基； 3. 定期更换培养基，并记录生长状况。
鉴定方法确定分离的细胞为WJ-MSCs的方法很多，常用的方法如下： #### 形态学鉴定通过显微镜观察细胞形态、吸附能力等，判断细胞是否符合WJ-MSCs的特征。
免疫学鉴定通过使用针对WJ-MSCs标记的分子抗体（如CD73、CD90等）对细胞进行标记，并使用流式细胞仪等方法进行检测。
活力检测通过MTT法、细胞增殖实验等，检测WJ-MSCs是否具备较强的增殖能力。
多向分化鉴定通过对WJ-MSCs进行分化培养，如脂肪细胞培养、软骨细胞培养等，检测WJ-MSCs是否显示多向分化的潜能。
结论通过脐带血样的分离，可以获得WJ-MSCs，并通过相关的培养和鉴定方法，确定其为WJ-MSCs，并进一步应用于生物医学实验中，具有潜在的临床应用前景。
血液样本处理方法
血液样本处理方法
血液样本处理方法是指将采集到的血液样本进行预处理和处理，以达到分析和检测的要求。
血液样本处理方法的重要性不言而喻，它直接关系到最终的检测结果精度和准确性。
血液样本处理方法包括以下几个方面：
1. 血液采集：采集血液是进行后续处理的前提。
采集要求规范，操作要求严密，以确保采集到的血液样本足够数量且不受污染。
2. 血液预处理：处理前需对血液样本进行预处理，包括离心、
分装、保存等。
离心是将血液分离成红细胞、白细胞和血浆等组分，分装是将血液样本分装成适量的小样本。
保存要求样本保存在低温下，避免血液成分的变化和降解。
3. 血液分离：血液分离是将血液中的细胞、蛋白质等成分进行
分离和提取的过程。
血液分离方法有离心法、凝胶柱法、磁珠法等多种，根据不同的实验要求选择不同的方法。
4. 血清或血浆处理：血清或血浆处理是将血液中的蛋白质进行
分离和提取的过程。
血清或血浆处理的方法有冷沉淀法、加热法、超声处理法等多种，根据不同的样本类型和实验要求选择不同的方法。
5. 血细胞培养：血液细胞培养是将血液细胞进行体外培养的过程，以获得足够数量和纯度的细胞进行后续实验。
血细胞培养的方法有原代培养、传代培养、混合培养等多种，根据实验要求选择不同的方法。
总之，血液样本处理方法是进行血液分析和检测的前提和保障，
不仅要求操作规范、严密，还要根据不同的实验要求选择不同的处理方法，以确保最终得到精确、准确的检测结果。
造血细胞分离、集落培养及表型分析
五、实验结果
脐血的体积
样品
分离出的单个 核细胞液的细
胞密度 9.8625×107 个
/mL
表 1 血球计数板计数结果
脐血中单个核 脐血中单个核 脐血中单个核
细胞液体积 细胞液细胞密 细胞液白细胞
度
密度
30mL
3.15×109 个/mL 3.9625×108 个
分离出的单个 核细胞液的白
收率(总细胞)
/mL 收率(白细胞)
细胞密度
5.1×106 个/mL
0.16%
0.064%
分离出的单个 核细胞液的体
积 1.5mL
纯度
12.26%
1、脐血共稀释 10,000 倍，利用血球计数板计数结果如下
38 28
27 34
40 30
16 39
(38+28+27+34+40+30+16+39)÷8=31.5 31.5×10000×104=3.15×109 个/mL
以总细胞计：9.8625×107×1.5÷(3.15×109×30)=0.16%
以白细胞计：5.1×106×1.5÷(3.9625×108×30)=0.064%
6、纯度
3.15×109×60=12.26%
5.2 流式细胞分析结果
5.2.1 流式细胞分析结果图
图 1 C流式细胞分析结果
33 30
25 32
32 24
(47+40+33+30+25+32+32+24)÷8=32.875 32.875×300×104=9.8625×107 个/mL
4、分离裂解后共稀释 30 倍，利用血球计数板计数结果如下
造血干细胞体外培养
造血干细胞体外培养
在进行造血干细胞体外培养时，首先需要从骨髓、外周血或者
胎盘血等来源中获得含有造血干细胞的细胞样本。
然后，这些细胞
样本会被经过特定的处理和分离步骤，将造血干细胞分离出来。
接
下来，这些分离出来的造血干细胞会被放入含有适当营养物质和生
长因子的培养基中进行培养。
培养基的配方和条件需要精确控制，
以提供细胞增殖和生长所需的理想环境。
在体外培养的过程中，研究人员需要定期检测和评估造血干细
胞的生长状态、纯度和活性。
他们可能会对培养条件进行调整，以
确保造血干细胞能够在体外保持其干细胞特性和功能。
造血干细胞体外培养的成功对于临床移植和疾病治疗具有重要
意义。
通过体外培养，可以获得足够数量和质量的造血干细胞，用
于移植到需要再生造血系统的患者体内，如白血病或骨髓衰竭患者。
此外，体外培养也为研究人员提供了研究和了解造血干细胞生物学
特性的重要工具，有助于深入探究造血系统疾病的发病机制和开发
新的治疗方法。
总的来说，造血干细胞体外培养是一个复杂而重要的过程，它
在临床和科研领域都具有重要意义，对于促进医学进步和治疗疾病具有深远影响。
造血干细胞分离培养方法
一造血干细胞分离（一）小鼠骨髓采集与单个核细胞悬液的制备1 HES(羟乙基淀粉)沉淀法抽取髓液500 m L按4∶1比例加入HES，自然沉降红细胞后，分离上清。
4℃400 g离心10 min得细胞沉淀物，以1 %白蛋白盐水液洗涤细胞2次。
2 percoll液密度梯度离心法①∶1在骨髓液中加入淋巴细胞分离液。
4℃,1 5 00 r / min，离心20 min。
取单个核细胞层，以1%白蛋白盐水液洗涤3次。
②取鼠股骨和胫骨 , 在两头关节处切开骨骼 , 反复用培养基冲洗骨髓腔 , 随后小心地逐滴将细胞悬液加在淋巴细胞分离液上 , 2 000 r / min 离心 20 min。
吸取离心后相交液面处的白色细胞层即为单个核细胞。
3 Ficoll分离法×20min,吸取白细胞层，用RPMI1640液亲清洗后离心2000r/min×10min,取白细胞层加RPMI1640液到10ml制成造血干细胞悬液样本。
方法二取无菌离心管1支，预先添加3mlFicoll(与骨髓细胞悬液体积1:1)，用滴管取单细胞悬液3ml，沿离心管壁小心缓慢叠加于分离液面上，注意保持清楚的界面，室温下水平离心2000rpm×20分钟，（后续在冰上进行）用毛细吸管插到云雾层，小心吸取单个核细胞，置入另一短中管中，加入5倍以上体积的磷酸缓冲液PBS，1500rpm×10分钟，L-DMEM 洗涤细胞两次，每次以1000r/min离心10min，去上清液。
（除第一步的室温离心外，其余为低温离心）。
取骨髓细胞悬液的方法是：取出大鼠腿骨将肌肉尽可能剔除，并用PBS缓冲液冲洗干净。
在超净台中腿骨浸泡在PBS缓冲液中5min，之后在两头关节处切开骨骼 , 反复用PBS缓冲液冲洗骨髓腔，从而得到骨髓细胞悬液。
（二）Linc-- kit+造血干细胞的分离纯化。
去除 Lin+细胞( 负筛选) : 带有生物素的混合抗体标记成熟细胞 ; 抗生物素的磁珠吸附抗体标记的成熟细胞 , 包括 T , B淋巴细胞、粒细胞、巨噬细胞以及它们的定向前体细胞 ; 细胞通过磁场不被柱子吸附的包括造血干细胞和骨髓间质干细胞。
分离培养干细胞的方法分类
分离培养干细胞的方法分类
分离培养干细胞的方法主要可以分为以下几类：
1. 最常见的方法为机械分离法，利用组织或细胞的物理性质进行分离。
例如在骨髓中分离造血干细胞时，可以利用胶体或其他分离物质将骨髓细胞进行分层，然后将不同层次的细胞进行分离。
2. 免疫选择法，利用单克隆抗体的特异性结合，将目标细胞从混合细胞中分离出来。
例如在胎盘组织中分离胚胎干细胞时，可以利用特异性的单克隆抗体识别胚胎干细胞表面的记号分子，然后利用磁性微珠等手段将这些细胞分离出来。
3. 化学处理法，利用化学或药物物质的特性，直接或间接地影响目标细胞的生长与分裂。
例如在胚胎干细胞的培养中，可以利用衍生自自然化合物的小分子化合物，来调控细胞的生长与分裂。
4. 细胞团块培养法，利用干细胞的自我复制和自我更新的特点，在培养基中形成球状细胞团，然后分离出内部细胞团中的干细胞。
例如在胚胎干细胞的分离中，可以将早期发育阶段胚胎的内细胞团分离出来进行培养。
以上是几种干细胞分离与培养方法的分类和简要介绍。
(完整版)DC细胞的分离及培养
DC细胞的分离及培养一、单个核细胞的分离1. 取新鲜脐带血按等体积加血液稀释液或PBS，混合均匀。
2. 将Ficoll-Paque PLUS（GE Healthcare）瓶来回倒置几次，以确保其混合均匀。
使用带注射针头的注射器刺穿隔片，倒置Ficoll-Paque PLUS 瓶并抽取需要量的Ficoll-Paque PLUS。
3. 将Ficoll-Paque PLUS 取3 ml 缓缓加入15 ml离心管中。
4. 轻轻加入稀释血液样品4 ml，使其置于Ficoll-Paque PREMIUM层上。
加入稀释血液时，尽量使样品与Ficoll-Paque PREMIUM分层，二者不得混合。
5. 在18-20 °C 下，离心400 g 30-40 分钟。
6. 使用无菌的吸管或移液器抽出上层液体，使淋巴细胞层在界面处保持原状。
7. 采用一无菌的吸管或移液器将淋巴细胞层移入一清洁的离心管中。
在最小量的情况下移出界面处所有的物质至关重要。
移去多余的Ficoll-Paque PLUS会导致粒细胞污染；而移去多余的上清液则会引起血小板污染。
8. 向装有淋巴细胞的试管中加入至少3倍体积的PBS溶液。
9. 用吸管轻轻地将细胞吹吸，使其悬浮。
在18-20 °C 下，以60-100 g 速度离心10 分钟，丢弃上清液。
10. 重复步骤8-9，至此，淋巴细胞应悬浮于适合CD34阳性细胞分选液中。
二、CD34阳性细胞分选1. 使用含0.5% BSA的PBS（分选buffer）重悬制备好的单个核细胞，加入50~100 μl CD34+ microbeads（Miltenyi公司），4 °C混合半个小时。
2. 选择合适的分选柱，MS柱适合50 ml血量，更多则使用LS柱。
3. 用分选buffer平衡分选柱3个柱体积后，将分选柱至于磁极上。
4. 将步骤1的悬浊液混合物以300 g 速度离心10 分钟，丢弃上清液，并使用2-3 ml的分选buffer重悬。
血管平滑肌细胞分离及培养
血管平滑肌细胞分离及培养血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells, VSMCs）是血管中膜的主要细胞成分。
具有增殖、迁移、合成并释放细胞基质的能力，在血管性疾病的发生进展中有重要作用。
目前已了解到血管平滑肌细胞的增殖和增生是动脉粥样硬化、高血压、冠状动脉腔内成形术后再狭窄等的主要病理表现。
利用体外培养血管平滑肌细胞可了解其正常和病态生物学特性及机制。
体外培养血管平滑肌细胞举行药物药理学方面的讨论。
体外培养血管平滑肌细胞可取材于不同动物及人胚胎或成体的不同部位的血管，按照讨论目的举行挑选。
血管平滑肌细胞分别培养办法较多，主要有簇拥细胞培养法、植块培养法、微血管培养法。
其中植块培养法可得到数量较多的平滑肌细胞而适用于药理讨论。
还可按照讨论需要将分别得到的平滑肌细胞举行蜕变培养、克隆培养、与内皮细胞共培养等。
【材料】 1．动物或人胚胎血管。
2．试剂 0.1%、0.1％,MEM 培养基（含10％新生牛血清，4mmo1/L，10万U/L和l00mg/L）。
Hanks 液（每1000m1含NaCl 8.00g, KCl 0.40g，CaCl 0.14g，MgS04·7H20 0.20g, KH2P04 0.06g, NaHC03 0.35g，glucose 1.00g，0.02g)。
3．器皿及仪器细胞培养用器皿，手术器械，净化工作台、C02孵箱、倒置显微镜、荧光显微镜等。
【办法】 1．簇拥细胞培养法（酶消化法）无菌术取颈或股动脉，于预冷Hanks液中洗涤3次，认真剥除血管表面结缔组织。
将血管纵向剖开移入另一装有0.1％胶原酶(D-Hanks配制）消化液的平皿中。
37℃消化30分钟后，认真剥离外膜及外层中膜并用小刀片轻轻刮除内膜，Hanks液冲洗后移入另一清洁的盛有消化酶平皿中（或剪成1 mm3组织块碎块，置离心管中）37℃消化2～3小时，时常轻晃，至组织呈絮状，收集细胞悬液并与5倍量含10％新生牛血清的培养基混合，终止消化。
人骨髓造血干细胞的分离培养
人骨髓造血干细胞的分离培养是一个复杂而重要的过程，涉及到细胞生物学、分子生物学和生物工程等多个领域。
以下是对该过程的详细描述，共计800字。
一、分离骨髓造血干细胞首先，我们需要从捐献者的骨髓中分离出造血干细胞。
通常，捐献者需要接受全身麻醉，然后在医生的监督下抽取一定量的骨髓。
抽取的骨髓样本经过处理后，会分离出造血干细胞和其他类型的细胞。
这一过程通常需要使用到离心技术，如密度梯度离心法。
二、培养造血干细胞分离出的造血干细胞需要在一个适合它们生长和分化的环境中进行培养。
实验室环境通常需要具备以下几个条件：1. 合适的营养物质：造血干细胞需要特定的营养物质来维持它们的生长和分化。
这些营养物质包括氨基酸、葡萄糖、维生素、矿物质和生长因子等。
2. 适合的pH值和渗透压：造血干细胞对环境的pH值和渗透压非常敏感。
过高的pH值或渗透压可能导致细胞死亡或停止生长。
3. 适合的温度：温度是影响细胞生长和分化的重要因素。
适宜的温度可以使造血干细胞保持最佳的分裂状态。
在培养过程中，造血干细胞会逐渐分裂并形成更多的细胞，同时也会分化为不同类型的血细胞，如红细胞、白细胞和血小板等。
为了确保造血干细胞的生长和分化，通常会使用一些细胞因子，如集落刺激因子（CSF）和红细胞生成素（EPO）等。
这些细胞因子可以刺激造血干细胞增殖并抑制其分化为非造血细胞。
三、观察和记录在培养过程中，我们需要密切关注细胞的生长状况，并定期进行观察和记录。
可以通过显微镜观察细胞的形态变化，测量细胞生长的速度和数量，以及检查细胞分化的程度。
通过这些观察结果，我们可以了解细胞的生长状态，及时调整培养条件，以确保造血干细胞的最佳生长。
四、提取和分析干细胞克隆当造血干细胞在适当的条件下生长和分化时，可能会形成独立的细胞克隆。
这些克隆可以用于进一步的研究和药物开发。
可以通过克隆培养、基因敲除、基因表达分析等方法对干细胞克隆进行深入研究。
这些研究可以帮助我们更好地了解造血干细胞的生理特性，并为相关疾病的治疗提供新的思路和方法。
血液分离原理
血液分离原理血液分离是一种重要的生物分离技术，广泛应用于医学、生物学、生物工程等领域。
它的原理是基于血液成分的差异性，通过适当的分离方法将血液中的各种成分分离开来。
血液是由血细胞和血浆组成的。
血细胞包括红细胞、白细胞和血小板，而血浆则是血液中的液体部分。
血液分离的目的是为了得到纯净的血细胞或血浆，以便进行进一步的研究、诊断或治疗。
血液分离的方法有很多种，根据所采用的原理可以分为离心法、过滤法、沉淀法和电泳法等。
离心法是最常用的血液分离方法之一。
其原理是利用离心力的作用，将血液中的不同成分分离开来。
离心机是实现离心法的主要设备，通过高速旋转的离心机转子，使血液中的重质成分沉积在离心管底部，而轻质成分则悬浮在上层。
通过适当调整离心机的参数，如转速、时间等，可以实现不同成分的分离。
过滤法是另一种常用的血液分离方法。
其原理是利用滤膜的孔隙大小，将血液中的不同成分分离开来。
滤膜通常由聚合物材料制成，具有不同的孔隙大小和分子筛选性。
通过将血液通过滤膜，大分子如血细胞和蛋白质会被滤膜截留，而小分子如溶解的物质和溶解的气体则可以通过滤膜，实现血液的分离。
沉淀法是利用沉淀剂对血液中的一部分成分进行沉淀，从而实现血液分离的方法。
常用的沉淀剂有酸、盐和有机溶剂等。
通过调整沉淀剂的种类和浓度，可以选择性地沉淀出所需的成分。
沉淀后，可以通过离心等方法，将沉淀物与上清液分离开来，从而实现血液的分离。
电泳法是一种利用电场作用对血液中的成分进行分离的方法。
其原理是根据不同成分的电荷、大小和形状的差异，通过电场的作用，使其在电泳介质中移动的速度不同，从而实现分离。
电泳法可以根据需要选择水平电泳、垂直电泳、凝胶电泳等不同类型的电泳方法。
血液分离技术在医学和生物学领域有着广泛的应用。
在临床诊断中，可以通过血液分离获得纯净的血清或血浆，用于各种生化指标的检测和疾病的诊断。
在生物学研究中，血液分离可以获取纯净的细胞，用于细胞培养、细胞分析和细胞实验。
造血细胞分离、集落培养及表型分析
造血细胞分离、集落培养及表型分析动性好，同时也避免了细胞因受力而损伤的情况。
流式细胞仪通过激光束照射细胞，检测细胞表面标记物的荧光强度，进而分析细胞表型，包括细胞表面标志、大小、形态等。
2、集落培养集落培养法是一种常用的检测造血干细胞的方法。
将待测细胞在半固体培养基中培养，待细胞分裂形成集落后，根据集落的形态和数量来判断细胞的分化能力。
常用的集落包括粒-巨嗜细胞集落形成单位（CFU-GM）、红系爆式集落形成单位（BFU-E）、巨核细胞集落形成单位（CFU-MK）等。
集落培养法可以检测细胞的增殖能力和分化潜能，是评估细胞功能的重要方法。
二、实验步骤1、细胞样品制备将待测细胞制成单细胞悬液，使得细胞可以均匀地分布在流式细胞仪的流动室中，方便后续的细胞表型分析。
2、流式细胞仪分析将制备好的细胞悬液加入样品管中，加入特异性荧光染料后，通过流式细胞仪进行细胞表型分析。
根据细胞表面标志物的荧光强度，可以判断细胞的类型和状态。
3、集落培养将待测细胞在半固体培养基中培养，待细胞分裂形成集落后，根据集落的形态和数量来判断细胞的分化能力。
常用的集落包括粒-巨嗜细胞集落形成单位（CFU-GM）、红系爆式集落形成单位（BFU-E）、巨核细胞集落形成单位（CFU-MK）等。
三、实验结果分析通过流式细胞仪和集落培养的结果，可以分析细胞的表型和功能。
例如，CD34+、CD38-、HLA-DR-、Thy-1+、c-kit+、LFA-1-、CD45RA-、CD71-、lin-等标志物被广泛认为是造血干细胞的标志。
同时，集落培养的结果也可以评估细胞的增殖能力和分化潜能。
这些结果对于研究造血干细胞的生物学特性和临床应用具有重要意义。
本实验采用流式细胞仪技术对脐血中的造血干细胞进行分离和检测。
流式细胞仪的测量区利用样品流和鞘流的气压差的层流原理，使细胞依次排列成单行，每个细胞以均等的时间依次通过测量区。
被荧光染料染色的细胞受到强烈的激光照射后发出荧光，同时产生散射光。
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血细胞分离培养以前认为红细胞、粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞等血细胞都属终末分化细胞, 很难在体外培养生长或仅能短期培养而不能传代, 近年来由于细胞培养技术的发展, 已有血细胞培养成功的报道, 正常血细胞在体外培养生长时间短, 只有白血病细胞, 血友病细胞、淋巴瘤细胞可培养成功并建立细胞系, 但多半为EB 病毒等致瘤病毒引起的转化细胞, （EBNA检查阳性）, 二甲基亚砜（DMSO ）处理也可诱导这些细胞分化发生逆转, 表现为正常细胞. 所建立的细胞系多半为单核细胞系、B 淋巴细胞系、T 淋巴细胞系, 只在IL-2 产品问世后,T 细胞才可在体外建系、建株.血细胞可从外周血中用梯度液通过离心分层后分离获得. 也可从脾脏、扁桃体、淋巴结中用机械法切碎过筛分离获得淋巴细胞, 从腹腔刺激后的冲洗液中可获得大量的单核- 巨噬细胞, 从骨髓中可以获得前提血细胞, 并可长期培养生长. 加入生长因子或某些物质有利于细胞纯化并促进分化和生长繁殖, 例如在淋巴细胞中加入IL-2 （TCGF ）, 可促进T 细胞生长, 建立T 淋巴细胞系. 在多发性骨髓瘤细胞（B 细胞）培养中, 加 B 细胞生长因子, 可建立 B 细胞系；加入IL-6 （或正常淋巴细胞培养48h 的培养上清中的IL6 ）可使 B 细胞在体外长期培养, 建立了IL-6 依赖的B9 细胞系. 在骨髓单个核细胞培养中加入二羟基维生素D3, 可使单个核细胞分化为成骨细胞及破骨细胞.（一）外周血细胞分离：外周血中除红细胞外, 还有粒细胞、单核细胞和淋巴细胞及血小板等, 通常是分离这些血细胞的重要来源. 其分离方法有四种：自然沉降法、差异沉降法、氯化铵分离法、Ficoll 分离法.1 、自然沉降法：将无菌抗凝血放入试管中, 在37 ℃水浴中静置, 自然沉降1-2h, 可见到红细胞下沉, 并有明显分层, 上层血浆中富含有大量的和淋巴细胞, 下层主要为红细胞. 此方法简便但各层中的细胞种类多, 不纯. 血浆中虽以粒细胞、淋巴细胞为主, 但也含有血小板, 大单核细胞和少量红细胞. 下层虽以红细胞为主, 但也有上述各种细胞, 此法适用于淋巴细胞转化试验.2 、差异沉降法：用6% 的右旋糖酐或3% 的明胶溶液无菌消毒后, 分装于中试管中, 由于这些物质能使红细胞形成“串状”, 比粒细胞、淋巴细胞沉降速度快, 因而可使红细胞与白细胞、淋巴细胞分离开. 其方法如下：用6% 的右旋糖酐溶液5-10ml, 经抗凝血5ml 加入上层中混合后静置于37 ℃水浴中30-60min, 即可见红细胞下沉, 上层富含大量粒细胞和淋巴细胞, 下层为红细胞, 使两者易于分离开, 取上层可用于粒细胞、淋巴细胞培养和实验, 下层可用于红细胞培养和实验, 经PBS 洗 3 次后即可加入培养基培养, 可用于天然白细胞干扰素的诱生和生产. 此法分离的细胞纯度也不高.3 、氯化铵分离法：0.83% 氯化铵（NH4CL ）可使红细胞破裂, 通常将分离获得的粒细胞. 淋巴细胞中混有的少量的红细胞用0.83% 氯化铵进行裂解, 以排除红细胞的干扰. 另外, 此法也适合大量粒细胞、淋巴细胞的分离制备, 在天然白细胞干扰素诱生和生产中已被广泛应用. 方法如下：将中心血站供应的健康人外周血离心分离白细胞黄层悬液先经2000r/min 离心20min, 吸出上清血浆, 将下层的红细胞、白细胞混合后, 加入0.83 氯化铵, 用量为血细胞悬液液量的 3 倍, 于 4 ℃作用20min 后离心弃去上清.在沉淀层中再加入新鲜0.83 氯化铵混匀后于 4 ℃作用20min, 以便彻底清除红细胞, 离心弃上清.收货下层的细胞用PBS 洗3 次后, 再用含5% 人AB 型血清的（含100U/ml 卡拉霉素）培养基制成悬液, 调整细胞浓度为（8-10 ）x10^9 个/L, 分瓶加塞在37 ℃普通培养箱中旋转培养（12r/h ）.混悬细胞时若加入干扰素诱导剂（NDV-F ）诱导22h, 收货上清就可生产白细胞干扰素. 此法分离的细胞纯度更差.4 、Ficoll 分离法：采用Ficoll 和泛影葡胺配制而成的淋巴细胞分离液, 通过2000r/min 离心后可使血细胞以不同相对密度分离开, 如分离淋巴细胞可选用相对密度1.077 的分离液；若分离血小板可用相对密度 1.090 的分离液, 若分离骨髓中的单核细胞常用相对密度 1.120 的分离液, 现以淋巴细胞分离为例, 方法如下.取中心血站供应的抗凝血细胞或初步分离的白细胞黄层细胞悬液, 用无钙、镁离子的PBS 稀释3-4 倍.将Ficoll 淋巴细胞分离液事先分装于离心管中, 使其沉于管底, 并在37 ℃中预热.用吸管将经稀释的血细胞悬液沿离心管壁缓慢加入, 不让细胞悬液冲破分层液界面, 使其悬于分层液上方.以2000r/min 离心20min 后, 不同细胞可依相对密度不同而分布于各位置上, 由于红细胞在Ficoll 作用下成串下沉, 故在离心管中分布在Ficoll 层下方, 淋巴细胞分布在Ficoll 层上方.收集浑浊带分离获得的淋巴细胞, 用无钙、镁离子的PBS 洗3 次后, 再用培养基洗1 次后计数, 分瓶培养.此法分离获得淋巴细胞纯度高.分离液的制备：9% Ficoll （20 ℃下相对密度约1.020 ）24 份与33.4% 泛影葡胺（用泛影钠或Conray400 也可, 在20 ℃下相对密度约1.200 ）10 份混合后, 将其相对密度调至 1.077 金额可获得淋巴细胞分离液, 于121 ℃高压蒸汽灭菌30min, 室温保存备用. 若配制高相对密度的分离液用加入高浓度泛影葡胺来调整, 若配制低相对密度的分离液用稀释的Ficoll 来调整.（二）淋巴器官中淋巴细胞的分离：从脾脏、淋巴结、扁桃体或胸腺等器官中制备淋巴细胞悬液, 在免疫学研究中是经常用到的. 方法如下.无菌取上述淋巴器官, 若为扁桃体, 应将扁桃体在剥离外表的结缔组织和血块后, 在含高浓度抗生素的洗液中 4 ℃浸泡2-4h, 以防污染.将淋巴器官剪成碎块, 用镊子压挤碎块, 或在金属丝网上研磨, 用洗液冲洗, 或用玻璃匀浆器研磨, 制成悬液.自然下沉10min 后, 吸取上层细胞悬液, 弃去下层沉淀的组织块,1500r/min 离心, 取沉淀物, 用无钙、镁离子的PBS 洗 2 次后, 混悬于培养基中, 分瓶培养.用上述分离法所获得的拎包细胞, 可用于白细胞黏附移动试验、转化试验、细胞毒试验, 同时可用于细胞因子的诱生和制备, 或扩增外周血造血细胞、树突细胞、淋巴因子激活杀伤细胞(LAK 细胞) 、T δ细胞等, 供细胞移植用.（三）人脐带血细胞分离培养：人脐带血来源方便, 采集容易, 对母婴均无伤害. 近年来研究表明, 脐带血的血浆中富含许多高水平的造血活性物质, 具有刺激和促进骨髓造血干/ 祖细胞增殖、分化和再植能力的功能, 是造血生长因子的重要来源.脐带血中富含类似于骨髓的造血干细胞, 其中CFU-G 、BFU-E 、CFU-GM 近似或高于正常成人骨髓和外周血中的造血干/ 祖细胞, 比骨髓更原始, 具有很强的自我复制和再植能力. 脐带血中还含有类似于骨髓的基质细胞, 对骨髓造血具有支持作用, 在体外培养扩增中具有更大的增值能力, 是造血干细胞的理想来源, 已被应用于Fanconi 贫血、某些白血病和恶性肿瘤的治疗, 并容易获得骨髓造血功能的重建.随着脐带血造血功能研究的不断深入, 为体外培养和扩增脐带血干/ 祖细胞建立了切实可行的方法.健康产妇于新生儿娩出后立即断脐, 用含抗凝剂的采血装置无菌采集正常足月顺产儿脐带血, 一般可采集50-80ml.将脐带血用无钙、镁离子的PBS 稀释2-3 倍, 缓慢沿壁轻轻加入含Ficoll-Hypque 淋巴细胞分离液的离心管中, 注意加样时切勿冲破分层界面,2500r/min 离心25min.收集单核- 淋巴细胞层细胞, 先用PBS 洗2 遍, 再用培养基洗 1 次, 活细胞计数, 存活率应大于90% 以上.将分离获得的脐带血单个核细胞（MNC ）, 浓度109 个/L, 用含5%AB 型血清（或10% 脐带血）的RPMI1640 培养基, 外加10mg/ml 干细胞因子（SCF ）、10ng/mlIL-6 和IL-3 、2U/mlEPO 、10ng/ml 的G-CSF 和GM-CSF, 置于37 ℃、5%CO2 下进行培养.每周半量换液一次, 共培养 5 周.10 天左右可传代培养, 不断使脐带血中的单个核下拨进行扩增, 培养 5 周, 可使单个核细胞数增加252 倍, 同时了检测造血干细胞中CD34+ 细胞的比例, 经检测,CD34+ 细胞增加250 倍. 一般脐带血中MNC 体外扩增 2 周即可满足一个成人造血干细胞移植的需求.若在分离获得的脐带血单个核细胞中, 用含20% 小牛血清的ROMI1640 培养基外加二羟基维生素D3 、地塞米松、维生素C 等刺激物, 培养1-2 周后, 可见有贴壁基质细胞的生长形态（呈梭形、多角形）, 说明脐带血中基质细胞可支持造血干细胞生长. （四）巨噬细胞分离培养：巨噬细胞有多种功能, 是免疫应答中重要的抗原递呈细胞, 是研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象. 该细胞易获得, 便于培养. 人巨噬细胞难以长期生长, 多用作初代培养. 目前所建立的无限细胞系大多来自小鼠, 如P388D-1 、J774A-1 、RA W309 、Cr-1 等均以恶性化, 但仍保留原有形态和吞噬功能, 易于传代和脱壁分离.巨噬细胞可来源于人胸水、腹水、血和透析液等, 实验动物多从血液、肺、脾和胸腔、腹腔获取, 通常预先注入刺激物后再采集, 以小鼠腹腔取材法最为实用, 方法如下. 实验前 3 天向每只小鼠腹腔注入肉汤培养基1ml.引颈杀死小鼠, 手提尾将全鼠浸入70% 酒精中浸泡3-5s.置动物于解剖台上, 用针头固定四肢, 剪开腹部毛皮, 双手用镊子撕开皮肤拉向两侧, 暴露出腹膜, 切勿撕破腹膜.用70% 酒精棉球擦洗腹膜后, 用注射器吸10mlEagle 液注入腹腔中, 同时从两侧用手指揉压腹膜壁, 使液体在腹腔内充分流动.用针头轻轻挑起腹壁, 将动物微倾向一侧, 是腹腔中液体集中于针头下吸入针管内.小心拔出头, 将液体注入离心管中,1500r/min 离心10min 去上清, 加10mlEagle MEM 培养基洗2-3 次后计数.每只小鼠可产生（2-3 ）x10^7 个细胞, 其中90% 为巨噬细胞, 以2.5x109 个/L 接种培养.为纯化巨噬细胞, 去除其他白细胞, 接种数小时后, 待巨噬细胞预先充分贴壁, 此时去除原培养基, 并用Eagle 液洗瓶壁1-2 次, 再加入新Eagle MEM 培养基, 置37 ℃、5%CO2 温箱中培养.。