棉花叶片硝酸还原酶活性的测定方法_刘洁
实验报告 硝酸还原酶活性的测定word文档良心出品
首都师范大学生命科学学院实验报告实验题目硝酸还原酶活性的测定一、实验原理硝酸还原酶是植物氮素作用中的关键性酶，硝酸还原酶作用于NO 使之还原为NO 。
NO -+ NADH + H +— NO 2- + NAD ++ H 2O产生的NO 可以从植物组织渗透到外界溶液中，积累在溶液中。
因此，测定反 应液中NO 含量的增加即表明酶活性的大小。
NO 含量的测定----磺胺法NO 2-与磺胺和-萘胺在酸性条件下生成粉红色化合物，用比色法在520nm 下读 取光密度值。
—、实验用品1. 材料：完全营养的小麦苗，缺氮培养的小麦苗2. 仪器和用具：722型分光光度计，剪刀，真空泵，电子天平，温箱，烧杯，移液 枪，tip 头(两种规格：1000卩I ，200卩I ) 三、实验步骤1. 分别配制反应液于小烧杯中(1) 0.1M 磷酸缓冲液5ml +蒸馏水5ml(2) 0.1M 磷酸缓冲液 5ml + 0.2MKNQ 5ml 2. NO 2-的获得(1) 称取新鲜叶片0.5g 共四份,剪成小片，分别置于小烧杯内的反应液中。
(2) 在真空干燥器中抽气20min,使叶片沉于溶液底部，溶液即可渗入组织内取代其 中的空气，内部产生的NO 可渗透到外部溶液中。
3.将小烧杯转到30 r 温箱,使其不见光,保温20min 。
4.用5卩g/ml NaNQ 母液配制标准梯度溶液 5、4、3、2、1、0.5、0.1、 0 卩 g/ml 。
5.吸取不同浓度的NaNOmI 于试管中，加入磺胺试剂2ml 及a -萘胺试剂2ml ，混 合均匀，在60r 水浴中保温20min ，于比色杯中，在520nm 下进行比色，读取光 密度，然后做出光密度一浓度曲线，以光密度为纵坐标， 体步骤及结果如下表和下图所示。
课程名称植物生理实验 实验时间2010331成绩姓名唐倪文班级_3学号 1090800032NaNO 浓度为横坐标。
具试剂管号12 3 4 5 6 7 8 NaNO 母液(ml)0 0.02 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸馏水（ml ） 1 0.98 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0 1%磺胺(ml)22 2 2 2 2 2 2 0.2 %a -萘胺 (ml) 22 2 2 2 2 2 2 每管亚硝酸氮含 量（卩g ） 0 0.1 0.5 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 每管NaNO 浓度 （卩 g/ml ） 0 0.1 0.5 1.02.03.04.05.0 光密度0.0150.0520.1040.2020.3020.3960.493小麦幼苗完全培养液缺N 培养液KNOHO KNO HO 小麦鲜重（g ） 0.51 0.51 0.49 0.48 光密度0.178 0.176 0.065 0.039 亚硝酸钠浓度 （卩 g/ml ） 1.791 1.7710.6540.392亚硝态氮含量 （卩g ） 1.791 1.771 0.654 0.392 酶活性105.39104.1840.0424.505.吸取反应液各1 ml 于试管中加入磺胺和粉红色化合物.用比色法在520nm 下读取光密度值，从标准曲线上查得NO 的含量, 结果如下表。
硝酸还原酶活性测定
实验八硝酸还原酶活性测定一、目的硝酸还原酶是植物氮素代谢中的关键酶之一，它与作物吸收利用氮肥有关，对作物的产量和品质有影响。
因而可以把硝酸还原酶的活力当作植物营养或农田施肥的指标之一，也可作为品种选育的指标之一。
通过本实验可初步掌握测定硝酸还原酶活性的原理与方法。
二、原理硝酸还原酶能将NO3－还原成NO2－产生的NO2－的量与硝酸还原酶的活性相关。
通过测定反应液中产生的NO2－含量，即可确定酶活性大小。
NO2－含量可用磺胺显色法测定。
NO2－与磺胺及a－萘胺在酸性条件下生成红色偶氮化合物其反应如下：酶活性可用单位鲜重组织在单位时间内产生的亚硝酸量来表示：亚硝酸态氮微克数/克鲜重组织1小时。
三、实验材料、仪器和试剂1．实验材料植物的根、茎、叶，本实验选用白萝卜叶片2．仪器（1）分光光度计（2）离心机（3）真空泵和真空干燥器（4）恒温水浴锅（5）恒温箱（6）刻度吸管（lml、2ml、5ml）（7）试管（8）天平（9）三角瓶（50ml）3．试剂（1）亚硝酸钠标准液：称取0.1000g亚硝酸钠（AR），用蒸馏水溶解并定容至100ml。
然后吸取5ml再用蒸馏水定客至1000m1。
即为浓度5μg／ml的亚硝酸钠标准液。
（2）0.lmol·L－1pH7.5磷酸缓冲液（3）0.2 mol·L－1的硝酸钾溶液（4）1％对氨基苯磺磷酸（5）2％α－萘胺（6）30％三氯乙酸四、操作步骤1．标准曲线的制作操作项目管号1 2 3 4 5 6NaNO2淀标准液(ml) 0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 蒸馏水(ml) 2.0 1.6 1.2 0.8 0.4 0 NaNO2含量（μg）0 2 4 6 8 10 磺胺(ml) 各4α－萘胺各4摇匀在30℃水浴中保温20分钟。
然后在520ml波长下比色测定消光值。
以亚硝酸钠含量为横坐标，消光值为纵坐标绘制标准曲线。
2．酶反应和酶活性测定将白萝卜叶片洗静，剪成0.5cm2h的小片，混匀后称三份，每份0.5－1.0g，分另放人50ml的三角瓶中，编号按下表加试剂摇匀，置真空于燥器中，抽气10分钟。
实验二 植物体内硝酸还原酶活力的测定
实验二 植物体内硝酸还原酶 活力的测定
NO3-和NH4+是能被植物利用的最主 要的氮源。在一般田间条件下， NO3- 是植物吸收的主要形式。
硝酸盐的还原
硝酸盐
硝酸还原酶
亚硝 酸盐
亚硝酸还原酶
氨
硝酸还原酶是一种诱导酶，在植酸还原酶。
V3——与磺胺等发生颜色反应的总体积（mL）； 5-1g 鲜样（诱导组和非诱导组分别进行），剪碎置冰箱冰冻30min，取出置研钵中，冰浴研磨成匀浆，转移入离心管中，洗研钵2-3次， 将液体转入离心管中，共用提取液6 mL，4℃ 8000rpm离心15min，上清液即为粗酶提取液。 植物生物学实验-植物生理部分 根据标准曲线计算出反应液中亚硝态氮浓度（µg/mL ）。 小麦的新鲜叶片（诱导组和非诱导组）
W ——样品质量（g）； 取7支洁净烘干的15ml刻度试管按下表顺序加入试剂，配成0-0.
取7支洁净烘干的15ml刻度试管按下表顺序加入试剂，配成0-0.
NR的测定可分为活体法和离体法。活体法步 植物生物学实验-植物生理部分
NR的测定可分为活体法和离体法。
⑼移液管(5、2、1mL) ；
骤简单，适合快速、多组测定。离体法复杂， NO3- +NADH + H+
【实验步骤】
标准曲线制作
取7支洁净烘干的15ml刻度试管按下表顺 序加入试剂，配成0-0.20µg/mL的系列标准亚 硝态氮溶液。摇匀后在25℃下保温30min，然 后在540nm下比色测定。以亚硝态氮浓度 （µg/mL）为横坐标（X），吸光值为纵坐标 （r）建立回归方程。
管号
1234567
试剂 取量 mL
样品中酶活性（µg ·g-1·h-1）=
硝酸还原酶活性的测定.
硝酸还原酶活性的测定一、原理硝酸还原酶是植物氮素作用中的关键性酶，与作物吸收和利用N肥有关的不同品种，年龄、器官组织以及环境条件对硝酸还原活性都有影响，硝酸还原酶作用于NO3使还原为NO2NO3⎯+NADH+H→NO2⎯+NAD+H2O产生的NO2⎯可以从组织内渗到外界溶液中，并积累在溶液中因此测定反应溶液中NO2⎯的含量的增加，即表明酶活性的大小。
NO2⎯含量的测定用对氨基苯磺酸化比色法，亚硝酸对氨基苯磺酸和α-萘胺在酸性条件下生成红色化合物，颜色在2-3小时稳定，可用比色法定量，该法非常灵敏，能测定每毫升0.5微克的Na NO2。
二、仪器和药品721型分光光度计（或其他型号比色计），剪刀，真空泵（或注射器），小天平，温箱，烧杯，移液管，小烧杯（50ml）0.2MKNO3：将20、22克KNO3溶于100ml蒸馏水中。
0.1M磷酸缓冲液（PH=7.5）：将85.2%ml 1/15M磷酸氢二钠与14.8ml 1/15M磷酸二氢钾混合均匀。
1/15MNa2HPO4溶液：1000ml中含Na2HPO4•2H2O11.878克。
1/15M溶液：1000ml中含KH2PO49.078克。
对氨基苯磺酸试剂：1克对氨基苯硝酸加加25ml浓HCl，用蒸馏稀释至100ml.。
α–萘胺试剂，0.2克α–萘胺加25ml浓HCl，用蒸馏稀释至100ml。
NaNO2标准溶液：1克NaNO2用蒸馏水溶解至1000ml，然后吸取5ml，再加蒸馏水稀释成1000ml，该溶液每毫升含有NaNO2 5微克，用时稀释之。
三、实验步骤：1、将新鲜叶片（蓖麻、向日葵、小麦、棉花等），用水冲洗净，并用吸水纸吸干，用剪刀剪成小块(注意块小为宜)，然后在小天平上称取等重的两份叶片，每份约0.5克。
分别置于含有下列溶液的小烧杯中。
（1）1M磷酸缓冲溶液5ml+蒸馏水5ml（2）0.1M磷酸缓冲溶液5ml+0.2M KNO35ml然后将小烧杯置于真空干燥器中，接上真空泵抽气，放气后叶片便沉于底部（如没有真空泵，也可以20ml注射器代替，将反应液及叶片一起倒入注射器使之真空，如此进行抽气、放气反复多次，溶液即可渗入叶组织内取代了叶片内的空气，叶片便沉于溶液底部），取出小烧杯置于30℃温箱中，使不见光保温作用30分钟。
植物体内硝酸还原酶活性的测定
植物体内硝酸还原酶活性的测定目的意义：硝酸还原酶是植物氮代谢中十分重要的一个酶，植物从土壤吸收硝酸盐后，首先催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐，才能进一步转化变成有机含氮化合物。
在生产中可根据植物体内硝酸还原酶的活性变化，来确定氮肥的合理用量以及植物的氮素营养状况。
一、实验原理在酸性条件下，亚硝酸盐与重氮试剂对—氨基苯磺酸（或对—苯磺酰胺）及偶联试剂α-萘基乙烯二胺反应生成红色偶氮化合物。
红色偶氮化合物的颜色在2~3h内稳定，并在540nm有最大吸收峰，可用分光光度法测定。
二、材料、设备及试剂1、材料川芎叶片、根茎和根。
2、设备冷冻离心机、分光光度计、天平、冰箱、恒温水浴锅、研钵、移液管、剪刀、离心管。
3、试剂(1) 0.1mol/L PH7.5磷酸缓冲液称取30.0905g Na2HPO4·12H2O和2.4965g NaH2PO4·2H2O 加去离子水溶后，定至1L；0.1mol/L KNO3溶液称取2.5275g KNO3溶于250mL 0.1mol/L PH7.5磷酸缓冲液中；（避光保存）0.025mol/L PH 8.7的磷酸缓冲液称取8.8640g Na2HPO4·12H2O和0.0570g K2HPO4·3H2O（很易吸水变潮）溶于1L去离子水中；(2) 亚硝酸钠标准溶液：准备称取分析纯NaNO20.9857g 溶于无离子水后定容至1000mL，然后再吸取5ml 定溶至1000mL，即为含亚硝态氮的1μg/mL的标准液。
(3) 1%磺胺溶液：1.0g无水对氨基苯磺酸溶于100mL 3mol/L HCl 中(25mL浓盐酸加水定容至100mL即为3mol/L HCl)；（注：磺胺比较难容，定容后最好用超声波促进溶解。
应避光保存！）(4) 0.02%萘基乙烯胺溶液：0.02g萘基乙烯胺溶于100mL无离子水中，贮于棕色瓶中。
(5) 提取缓冲液：0.1211g半胱胺酸、0.0372g EDTA溶于100mL 0.025mol/L PH 8.7的磷酸缓冲液中。
活体法测定植物硝酸还原酶活性[整理文档]
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活体法测定植物硝酸还原酶活性一、试剂1、亚硝酸钠标准液：称取分析纯NaNO20.1000g溶于水，然后用蒸馏水定容至100ml然后吸取5ml上述溶液，定容到1000ml，即为每ml含NaNO25ｕg 的标准液。
2、0.1mol/L的磷酸缓冲液：称取K2HPO419.24g,KH2PO42.2g，用水溶解后，用蒸馏水定容到1000ml。
3、1%的磺胺：1.0g磺胺溶于25ml浓HCL中，用蒸馏水定容到100ml。
4、0.2%的α-萘胺：称取0.2g萘胺溶于25ml冰醋酸中，用蒸馏水定容到100ml。
5、30%的三氯乙酸：75.0g三氯乙酸定容到250ml6、KNO3(0.1mol/L)异丙醇（1%V/V）磷酸缓冲液（0.1mol/L）混合液：称取3.03gKNO3溶于300ml0.1mol/L的磷酸缓冲液中，再加3ml异丙醇混匀。
二、步骤1、标准曲线制作取7支洁净烘干的15ml刻度试管按表加试剂，即配成系列标准液，摇匀后在30℃保温箱中或水浴中保温30分钟，然后在540nm比色，以亚硝态氮（μg）为横坐标，光密度值为纵坐标。
试管编号标准液00.20.40.81.21.62.0蒸馏水2.01.81.61.20.80.40磺胺4444萘胺4444每管含00.20.40.81.21.62.0NO2-2、测定（1）取样：取叶片，用水洗净，再用蒸馏水冲洗，用滤纸吸干，剪碎混匀，称取0.5g，放入试管。
（2）反应：加混合液9ml，其中一管加1ml三氯乙酸做对照，放入真空泵中反复抽气，直至叶片沉至管底，将各试管置于30℃暗处保温30分钟，分别加1ml三氯乙酸，摇匀终止酶反应。
（3）比色：静置2分钟，然后吸取上清液2ml，加4ml磺胺试剂，4ml萘胺试剂，摇匀后静置30分钟，然后在540nm处比色。
三、计算样品中酶活性（μg·g-1·h-1）=C×V1/V2W×tC——反应液催化产生的亚硝态氮总量（μg ）由曲线查得V1——提取酶液时加入的混合液体积（ml）V2——酶反应时加入的粗酶液体积（ml）W——样品重t——反应时间（h）。
硝酸还原酶活力的测定
实验 6 植物体内硝酸还原酶活力的测定硝酸还原酶（ nitrate reductase,NR ），是植物氮素同化的关键酶，它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐（ NO 3 ˉ +NADH+H ＋→ NO 2 ˉ +NAD ＋ +H 2 O ）。
产生的亚硝酸盐与对–氨基苯磺酸（或对–氨基苯磺酰胺）及α - 萘胺（或萘基乙烯二胺）在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物。
其反应如下：生成的红色偶氮化合物在 540 nm 有最大吸收峰，可用分光光度法测定。
硝酸还原酶活性可由产生的亚硝态氮的量表示。
一般单位鲜重以 N μg ／（ g · h ）为单位。
NR 的测定可分为活体法和离体法。
活体法步骤简单，适合快速、多组测定。
离体法复杂，但重复性较好。
Ⅰ离体法二、实验材料、试剂与仪器设备（一）实验材料水稻、小麦叶片、幼穗等。
（二）试剂1 ．亚硝酸钠标准溶液：准确称取分析纯 NaNO 20.9857 g 溶于无离子水后定容至 1000 mL ，然后再吸取 5 mL定容至 1000 mL ，即为含亚硝态氮的 1 μg ／ mL 的标准液。
2 ． 0.1 mol/L pH 7.5 的磷酸缓冲液： Na 2HPO 4· 12H 2O 30.0905 g与 NaH2PO4· 2H2 O 2.4965 g加无离子水溶解后定容至 1000 mL 。
3 ． 1 ％磺胺溶液： 1.0 g 磺胺溶于 100 mL3mol/L HCl 中（ 25 mL 浓盐酸加水定容至 100 mL 即为 3 mol/L HCl ）。
4 ． 0.02 ％萘基乙烯胺溶液： 0.0200 g 萘基乙烯胺溶于 100 mL 无离子水中，贮于棕色瓶中。
5 ． 0.1 mol/L KNO 3 溶液： 2.5275 g KNO 3 溶于 250 mL 0.1 mol/L pH7.5 的磷酸缓冲液。
6 ． 0.025 mol/L pH8.7 的磷酸缓冲液： 8.8640 g Na 2 HPO 4· 12H 2 O ， 0.0570 g K2 HPO 4· 3H 2 O 溶于 1000 mL 无离子水中。
硝酸还原酶活力的测定
硝酸还原酶活力的测定一、试剂：（1）亚硝态氮标准溶液称取1 g分析纯NaNO2溶于无离子水并定容至1000mL，然后再吸取1mL定容至1000mL,即为1μg/mL亚硝态氮的标准液。
（2）0.1mol/L pH 7.5的磷酸缓冲液称取30.0905 g Na2HPO4·12H2O与2.4965 g NaH2PO4·2H2O，加无离子水溶解后定容至1000mL。
（3）10 g/L磺胺溶液称取1.00 g磺胺溶于100mL 3mol/L HCl中（取25mL浓盐酸加无离子水定容至100mL，即为3mol/L HCl）。
（4）0.2 g/L萘基乙烯胺溶液称取0.0200 g 萘基乙烯胺溶于100mL无离子水中，贮于棕色瓶中。
（5）0.1mol/L KNO3溶液称取2.5275 g KNO3溶于250mL 0.1mol/L pH 7.5的磷酸缓冲液。
（6）0.025mol/L pH 8.7的磷酸缓冲液称取8.864 g Na2HPO4·12H2O和0.057 g K2HPO4·3H2O，溶于1000mL 无离子水中。
（7）提取缓冲液称取0.1211 g半胱氨酸和0.0372 g EDTA，溶于100mL 0.025mol/L pH 8.7的磷酸缓冲液。
（8）2 mg/mL NADH溶液称取2 mg NADH溶于1mL 0.1mol/L pH7.5的磷酸缓冲液(临用前配制)。
二．实验步骤（一）标准曲线制作取7支15mL干净的试管按表1顺序加入试剂，配成每管含0~2.0μg 亚硝态氮的系列标准溶液，摇匀后在25℃下保温30 min，然后在540nm下比色测定，以每管中亚硝态氮的量（μg）为横坐标（x），吸光度值（y）为纵坐标绘制标准曲线或建立回归方程。
（二）硝酸还原酶活力测定1.酶液提取取10mL藻液，在4500r/min离心15分钟，去掉上清液，加4mL酶提取液，超声波破碎10min，4℃,4000r/min离心15min,上清液即为粗酶提取液2.酶反应取粗酶液0.4mL加入10mL试管中，再加入1.2mL 0.1mol/L KNO3磷酸缓冲液和0.4mL NADH溶液，在25℃水浴中准确保温30 min。
硝酸还原酶测定 (2)
实验5 硝酸还原酶活性的测定【实验目的】掌握硝酸还原酶活性测定的两种方法，加深对硝酸还原酶在植物体氮素代谢中作用的理解。
【实验原理】硝酸还原酶（nitrate reductase,NR）是植物氮素同化的关键酶，它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐，（NO3-+NADH + H+→NO2-+NAD ++H2O）。
产生的亚硝酸盐与对-氨基苯磺酸（or 对-氨基苯磺酰胺）及α-萘胺（or 萘基乙烯二胺）在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物。
其反应如下：生成的红色偶氮化合物在540nm有最大吸收峰，可用分光光度法测定。
硝酸还原酶活性可由产生的亚硝态氮的量表示。
一般单位鲜重以Nμg/（g﹒h）为单位。
NR的测定可分为活体法和离体法。
活体法步骤简单，适合快速、多组测定。
离体法复杂，但重复性较好。
Ⅰ离体法【材料设备】（三）试剂1、NaNO2标准溶液：准确称取分析纯NaNO20.1g溶于无离子水后定容至100ml，然后再吸取1ml用蒸馏水稀释成1000ml，该溶液每毫升含有NaNO21μg，用时稀释之。
2、0.1mol/L PH7.5的磷酸缓冲液，Na2HPO4·12H2O 30.0905g与NaH2PO4·2H2O 2.4965g加去离子水溶解后定容至1000mL。
3、1%（m/V）对氨基苯磺酸（磺胺酸）溶液：1.0g 对氨基苯磺酸溶于100ml 3 mol/L的HCL中（25ml浓盐酸加水定容至100ml 即为 3 mol/LHCL）。
4、0.02%（m/V）萘基乙烯胺溶液：0.0200g萘基乙烯胺溶于100mL 去离子水中，贮于棕色瓶中。
5、0.1mol/L KNO3溶液：2.5275g KNO3溶于250mL 0.1mol/L Ph7.5的磷酸缓冲液中.6、0.025mol/L Ph 8.7 的磷酸缓冲液：8.8640g Na2HPO4·12H2O，0.0570g KH2PO4.3H2O，溶于1 000ml去离子水中。
实验七、硝酸还原酶活性测定
根据实验数据得出结论，分析硝酸还原酶活性的影响因素
影响因素分析
根据实验数据，分析影响硝酸还原酶活性的因素，如温度、pH值、底物浓度等。通过对比不同条件 下的活性数据，评估各因素对酶活性的影响程度。
结论得出
基于数据分析结果，得出硝酸还原酶活性测定的结论，总结实验结果，阐述实验中得出的规律和趋势 。
对比不同样品之间的硝酸还原酶活性差异
问题与改进
在实验过程中，我们也遇到了一些问题，如操作 不规范导致的误差、数据波动等。针对这些问题 ，我们应加强操作规范性，提高实验的准确性和 可重复性。
对未来实验的展望与改进建议
拓展实验内容
未来我们可以进一步研究硝酸还原酶活性在不同生长阶段、不同环境 条件下的变化，以更全面地了解其在植物生长和发育中的作用。
硝酸还原酶通常由两个组成部分：血红素蛋白和铁硫蛋白，它们共同作用将硝酸盐 还原为亚硝酸盐。
硝酸还原酶对环境条件敏感，如温度、pH值和抑制剂等，这些因素会影响酶的活性。
硝酸还原酶活性测定的基本原理
硝酸还原酶活性测定的基本原理 是通过测量一定时间内亚硝酸盐 的生成量来计算硝酸还原酶的活
性。
在实验条件下，加入一定量的硝 酸盐作为底物，酶促反应一段时 间后，测定亚硝酸盐的生成量。
实验七、硝酸还原酶 活性测定
目录
• 实验目的 • 实验原理 • 实验步骤 • 数据分析与结论 • 实验总结与展望
01
实验目的
了解硝酸还原酶活性测定的原理
硝酸还原酶是植物体内一种重要的酶， 负责将硝酸盐还原成亚硝酸盐，进而 参与植物的氮代谢过程。了解硝酸还 原酶活性测定的原理有助于深入理解 植物的氮代谢机制。
02
确保所有溶液的浓度和比例符合 实验要求。
硝酸还原酶活性的测定
实验二、硝酸还原酶活性的测定-活体法[原理]：硝酸还原酶（NR）是植物氮素同化的关键酶，它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐，产生的亚硝酸盐与对-氨基苯磺酸（或对-氨基苯磺酰胺）及α-萘胺（或萘基乙烯胺）在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物。
生成的红色偶氮化合物在540nm有最大吸收峰，可用分光光度法测定。
硝酸还原酶活性可由产生的亚硝态氮的量表示。
一般以每克鲜重含氮量表示，即以ug.g-1.h-1为单位。
NR 的测定可分为活体法和离体法。
活体法步骤简单，适合快速、多组测定。
离体法复杂，但重复性较好。
[试剂]1．亚硝酸钠标准溶液：准确称取分析纯NaNO20.9857g溶于去离子水后定容至1 000ml，然后再吸取5ml定容至1000ml，即为含亚硝态氮1ug.ml-1的标准液；2．0.1molpH7.5的磷酸缓冲液：Na2HPO4.12H2O30.0905g与NaH2PO4.2H2O 2.4965g加去离子水溶解后定容至1 000ml；3．1%（W/V）溶液：1.0g 对氨基苯磺酸溶于100ml 3 mol.L-1HCL中（25ml浓盐酸加水定容至100ml 即为 3 mol.L-1HCL）；4．0.02%（W/V）萘基乙烯胺溶液：0.020g萘基乙烯胺溶于100ml 去离子水中，贮于棕色瓶中；5．0.1mol.L-1KNO3溶液：2.5275g KNO3溶于250Ml 0.1mol.L-1Ph7.5的磷酸缓冲液中；6．0.025mol.L-1Ph 8.7 的磷酸缓冲液：8.864 0g Na2HPO4.12H2O，0.0570g KH2OP4.3H2O，溶于1 000ml去离子水中；7．30%三氯乙酸溶液：30g三氯乙酸。
水溶后定容至100ml。
[方法]摇匀后在25度下保温30min，然后在540nm下比色测定。
以亚硝态氮（ug）为横坐标（X），吸光值为纵坐标（Y）建立回归方程。
2.样品中硝酸还原酶活力测定1.在取材的前一天加50mmol/L KNO3或NaNO3到培养苗的水中就可以诱导酶的产生。
NO对生长发育中棉花叶片NO含量及其对抗氧化物酶的影响
作物学报ACTA AGRONOMICA SINICA 2011, 37(10): 1828−1836/zwxb/ ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9E-mail: xbzw@DOI: 10.3724/SP.J.1006.2011.01828NO对生长发育中棉花叶片NO含量及其对抗氧化物酶的影响孟艳艳范术丽宋美珍庞朝友喻树迅*中国农业科学院棉花研究所 / 农业部棉花遗传改良重点实验室, 河南安阳455000摘要: 以早衰性状不同的棉花栽培品种为材料, 在自然条件下和外施一氧化氮(nitric oxide, NO)的条件下, 调查早熟棉花植株真叶和子叶衰老过程中NO含量变化和抗氧化酶活性及相关基因的表达。
结果表明, 大田条件下, NO含量在幼嫩叶片中最高, 随着叶片的衰老含量逐渐降低; 在叶片发育后期早衰材料的NO含量下降快, 并且显著低于不早衰材料。
室内条件下, 植株发育过程中, NO含量在幼嫩子叶中最高在生长后期最低; 外施硝普纳(SNP)溶液后的植株, 其NO含量在子叶的整个生育期都比对照组高, 且两者差异显著。
对照组和处理组的过氧化氢酶(CAT)和抗坏血酸过氧化物酶(APX)的活性及相关基因的表达第7天较低, 第14天最高, 随后逐渐下降; 在同一时期, 处理组显著高于对照组, 在生育后期表现的更为明显。
外施SNP可显著降低参试品种过氧化物酶(POD)的活性和相关基因的表达。
在子叶发育初期, 外源NO对超氧化物歧化酶(SOD)的活性有抑制作用, 随着叶片衰老, 处理组的SOD活性又高于对照组。
不同类型的SOD对NO的反应不同, Cu/Zn SOD最敏感, 其中又以cCu/Zn SOD基因的作用更突出。
NO通过调控植株体内CAT、APX、POD和SOD等氧化/抗氧化系统, 延缓叶片的衰老进程。
关键词: 棉花; 叶片衰老; 一氧化氮; 抗氧化物酶Effects of NO on NO Contents and Anti-oxidative Enzymes in Cotton Leaf at Growth StageMENG Yan-Yan, FAN Shu-Li, SONG Mei-Zhen, PANG Chao-You, and YU Shu-Xun*Cotton Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences / Key Laboratory of Cotton Genetic Improvement, Ministry of Agriculture, Anyang 455004, ChinaAbstract: Under natural condition and spraying exogenous NO, cotton cultivars with different senescence traits were used to in-vestigate changes in NO contents, anti-oxidative enzymes and related gene expression during the aging process of euphylla and cotyledons. The results indicated that, under field condition, the NO contents showed the highest level in the young leaf and de-clined gradually with the progression of leaf senescence. The NO content in presenescent cultivar decreased faster and was sig-nificantly lower than that of non-presenescent cultivar at the late stage of leaf senescence. Under laboratory condition, the NO content of cotyledons was the highest in young leaf and the lowest at late growth stage. After application of SNP solution, the NO content was significantly higher in the treatment group than that of control group during the whole period of cotyledon develop-ment. The activities of catalase (CAT) and ascorbate peroxidase (APX) and their genes expressions were comparatively lower at the seventh day and reached the highest level at the fourteenth day both in the control and treatment groups, then declined with leaf development; at the same stage, the activities of CAT and APX in treatment group were significantly higher than control group, especially at the late stage of cotyledons. The activity of peroxidase (POD) and its gene expression declined significantlyby spraying exogenous SNP. Although exogenous NO could inhibit the activity of superoxide dismutase (SOD) at early stage of cotyledon development, the treatment group demonstrated greater SOD activity than that of control group in the process of leaf senescence. The responses of different types of SOD to NO varied, and the Cu/Zn SOD was the most sensitive isoforms, among which cCu/Zn SOD’s genes played a more potent role. The physiological and molecular mechanism underlying the delaying effectof NO on leaf senescence is thus revealed by fine coordination of the activity of oxidation and anti-oxidation systems (CAT, APX, POD, and SOD) in plant.本研究由国家转基因生物新品种培育科技重大专项(2008ZX08005-002, 2009ZX08005-020B)资助。
硝酸还原酶的测定
一、实验目的和要求掌握体内法测定植物组织中的硝酸还原酶原理和方法，明确诱导酶含义。
二、实验内容和原理硝酸还原酶（NR）是植物氮素同化的关键酶，与作物吸收和利用氮肥有关。
它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐：产生的NO2-可以从组织内渗透到外界溶液中，并积累在溶液中，测定NO2-含量的增加，即表示该酶活性的大小。
NO2-含量的测定用磺胺比色法。
在酸性溶液中产生的亚硝酸盐与对–氨基苯磺酸（或对–氨基苯磺酰胺）反应产生重氮，再与α–萘胺（或萘基乙烯二胺）偶联形成紫红色的偶氮化合物。
生成的红色偶氮化合物在540nm波长下有最大吸收峰，可用分光光度法测定，利用标准曲线确定溶液中NO2-含量。
三、主要仪器设备1、实验仪器分光光度计，真空泵，温箱，天平，2个烧杯，移液管若干，试管3支，剪刀。
2、实验试剂0.1mol/L pH7.5的磷酸缓冲液，对-氨基苯磺酸溶液，α-萘胺溶液，亚硝酸钠标准液3、实验材料在15-25℃蒸馏水培养一周的大麦苗两组，一组加KNO3，一组加NH4Cl，在白天置光照下处理。
四、操作方法和实验步骤1、剪取新鲜的叶片两组，一组是处理苗0.51g，另一组是对照苗0.50g，叶片各剪为0.5~1cm的碎片，压实。
2、两组中各加入15ml的酶促反应液。
3、真空抽取10min，充分交换细胞内外液。
4、加盖在30℃的保温箱中保温20min。
5、去除材料，用移液管取4ml反应液，加入2ml磺胺，加入2ml苯基，放置15min。
6、比色：在540nm的波长下分光光度测定亚硝酸的OD值。
7、空白管：4mlH2O +磺胺溶液2ml+萘基乙烯二胺溶液2ml 室温放置15min同样在540nm的波长下分光光度测定亚硝酸的OD值。
五、实验数据记录和处理称重：处理苗0.51g；对照苗0.50gOD值：处理苗0.513A；对照苗0.050ANO2- 含量标准曲线：Y=257.29X-4.8262（X=OD值；Y=NO2含量（nmol））有标准曲线得出NO2-的含量：处理苗：C NO2-=127.16nmol 对照苗：C NO2-=8.038nmlo硝酸还原酶活力(nmol NO2-·g-1·h-1)= 根据OD值从标准曲线上查得的NO2（nmol）×3 ×15/4/m硝酸还原酶活力：处理苗=2805 nmol NO2-·g-1·h-1对照苗=180.855 nmol NO2-·g-1·h-1六、实验结果与分析1、实验结果分析：实验表明用硝酸钾处理的苗比用氯化铵处理的苗硝酸还原酶活力更强，而且根据测出的亚硝酸的含量，处理苗是对照苗的10倍左右，远比旁边几组的高，因为可能是因为在取材的时候，取了粘有培养液的根部，但并没有用蒸馏水洗去吸附在上面的硝酸根、亚硝酸根，或者根部的硝酸还原酶活性更多（猜测）。
植物生理学实验实验三 硝酸还原酶活性测定
当磺胺与α-萘胺均过量时，所生成的红色深浅与NO2-含量成 直线关系。
NO2-含量标准曲线： [ NO2- ](µmol/ml) = 0.0026＋0.359OD540
NR活性(NO2- , µmol/h•gfw)
=
[NO2-] (µmol/ml)×稀释倍数 鲜重(g)×时间(h)
硝酸还原酶活性测定
⑥ 取A液和B液1ml代替反应液，加入2ml磺胺试剂和2mlα-萘胺试剂，作 为对照管，在540nm测定样品的吸光值（以蒸馏水为对照） 。
5. 结果与分析
分析硝酸盐对硝酸还原酶活性的影响。
处理
H2O KNO3 对照
A液
B液
吸光度 [ NO2- ] NR活性
吸光度 [ NO2- ] NR活性
（uMol/ml）（uMol/h•gfw）
（uMol/ml）（uMol/h•gfw）
[ NO2- ] （uMol/ml）= 0.0026＋0.359OD540 NR活性（ NO2- , uMol/h•gfw）= [ NO2- ] ×10ml/1ml ÷（鲜重g×0.5h）
6. 注意事项
① 抽真空放气后，摇晃直至ห้องสมุดไป่ตู้段沉于溶液中； ② 硝酸还原过程应在黑暗中进行； ③ 磺胺试剂和α-萘胺试剂加入时，注意顺序； ④ 正确使用分光光度计； ⑤ 避免移液管使用交叉感染。
1. 实验目的意义
硝酸还原酶（EC.1.6.6.1，缩写NR）是硝酸盐同化中第一 个酶，也是限速酶，处于植物氮代谢的关键位置。它与植 物吸收利用氮肥有关，对农作物产量和品质有重要影响， 因而硝酸还原酶活性被当作植物营养或农田施肥的指标之 一，也可作为品种选育的指标之一。
➢掌握硝酸还原酶活性的测定方法 ➢了解硝酸还原酶的特性
硝酸还原酶活性的测定(活体法)
主要试剂
• 0.1mol/L pH7.5磷酸缓冲液 • 0.2mol/L KNO3 • 磺胺试剂 • α-萘胺试剂 • 亚硝酸钠标准液
实验器材
• 天平 • 真空泵 • 分光光度计 • 恒温箱 • 剪刀 • 试管 • 小烧杯 • 移液管
取材
1. 取十棵小麦，称量叶片1.2克，用剪刀将叶片剪成0.2-0.5cm 小段，在A4纸上混匀。
9 ml
10-3 10-4 10-5
9ml蒸馏水作对照
步骤
在每一皿中放一张滤纸→整齐放入 20粒种子→中缝朝向滤纸，加盖→ 放入25℃温箱中→三天后测定不同 处理中的平均根数。（3勺种子）
意义
盐类或有机物从细胞中渗出，进入周围环 境中。通过电导度的测量，可以测知物质 的外渗，表明植物受害的情况。
实验器材
电导仪，冰 箱, 恒温箱，恒温 水浴器，量筒， 烧杯，镊子，玻 棒等。
实验步骤
1. 豆芽30株，切取中段1－2cm 长（用刀片），10株一组，分 三组，分别放于小烧杯内。
2.处理 60℃ 温箱、 -20 ℃ 冰箱（放在白瓷盘内，
在520nm波长下读取光密度。
用什么溶液调100%？
对比标准曲线，查出亚硝态氮的含量。
• 以亚硝酸钠量（ µg ）为横坐标，以光密度为纵坐标， • 绘制光密度-含量标准曲线。
根据标准曲线计算反应液中所产生的亚硝态氮量。
X × V1/V2
样品中酶活性 （ug / g·h）＝
反应时间（0.5hr）×样品重量（g）
硝酸还原酶活性的测定（活体法） 不良环境对植物的伤害
生长素类物质对根芽生长的影响
张晓燕
中国农业大学生物学院
1. 每 两 组 取 十 株 小 麦 ， 用 剪 刀 将 叶 片 剪 成 小 于 0.5cm小段，在A4纸上混匀。
棉花叶片硝酸还原酶活性的测定方法
棉花叶片硝酸还原酶活性的测定方法刘洁;王省芬;张桂寅;吴立强;李志坤;马峙英【期刊名称】《河北农业大学学报》【年(卷),期】2010(033)004【摘要】本研究应用磺胺比色法测定棉花叶片硝酸还原酶活性(NRA),探讨了体内法测定棉花叶片NRA的最适条件.通过分析比较硝酸盐诱导、2,4-二硝基苯酚、三氯乙酸及煮沸等因素对NRA测定结果的影响,建立了体内法测定棉花叶片NRA的最佳条件,即用50 mmol/L的KNO3溶液诱导棉花叶片48 h、抽气前后分别加入2,4-二硝基苯酚和1,6-二磷酸果糖、暗保温35 min后煮沸10 min可以使NRA 的活性达到最高.棉花叶片NRA测定方法的建立为进一步研究棉花的氮素代谢奠定了基础.【总页数】4页(P1-4)【作者】刘洁;王省芬;张桂寅;吴立强;李志坤;马峙英【作者单位】华北作物种质资源研究与利用省部共建实验室,河北省作物种质资源重点实验室,河北农业大学,河北,保定,071001;华北作物种质资源研究与利用省部共建实验室,河北省作物种质资源重点实验室,河北农业大学,河北,保定,071001;华北作物种质资源研究与利用省部共建实验室,河北省作物种质资源重点实验室,河北农业大学,河北,保定,071001;华北作物种质资源研究与利用省部共建实验室,河北省作物种质资源重点实验室,河北农业大学,河北,保定,071001;华北作物种质资源研究与利用省部共建实验室,河北省作物种质资源重点实验室,河北农业大学,河北,保定,071001;华北作物种质资源研究与利用省部共建实验室,河北省作物种质资源重点实验室,河北农业大学,河北,保定,071001【正文语种】中文【中图分类】S562【相关文献】1.喜树叶片硝酸还原酶活性的测定方法 [J], 孙世芹;阎秀峰2.玉米叶片硝酸还原酶活性测定方法的优化 [J], 宋月;崔婷婷;武丽娟;张战凤;刘建超3.两种海洋微藻硝酸还原酶活性测定方法的比较研究 [J], 唐洪杰;王修林;祝陈坚;李雁宾;张传松4.聊红国槐叶片硝酸还原酶活性测定方法的研究 [J], 邱艳昌;段祖安;李道强;强薇5.教学实验中硝酸还原酶活性测定方法的改进 [J], 刘亚丽;赵喜婷因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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第33卷第4期2010年7月河北农业大学学报J OU RNAL OF AGRICU LTU RAL UNIVERSITY OF H EBEIVol.33No.4Jul.2010文章编号:1000-1573(2010)04-0001-04棉花叶片硝酸还原酶活性的测定方法刘洁,王省芬,张桂寅,吴立强,李志坤,马峙英(华北作物种质资源研究与利用省部共建实验室,河北省作物种质资源重点实验室,河北农业大学,河北保定071001)摘要:本研究应用磺胺比色法测定棉花叶片硝酸还原酶活性(NR A),探讨了体内法测定棉花叶片NR A的最适条件。
通过分析比较硝酸盐诱导、2,4-二硝基苯酚、三氯乙酸及煮沸等因素对N RA测定结果的影响,建立了体内法测定棉花叶片N RA的最佳条件,即用50mmol/L的KN O3溶液诱导棉花叶片48h、抽气前后分别加入2,4-二硝基苯酚和1,6-二磷酸果糖、暗保温35min后煮沸10min可以使N RA的活性达到最高。
棉花叶片N RA测定方法的建立为进一步研究棉花的氮素代谢奠定了基础。
关键词:棉花;硝酸还原酶;酶活性测定中图分类号:S562文献标志码:ADetermination method of nitrate reductase activity in cotton leavesLIU Jie,WAN G Xin g-fen,ZHAN G Gu-i yin,WU L-i qian g,LI Zh-i kun,MA Zh-i ying(No rth China Key Labor ator y fo r Cro p G ermplasm Resources of M inistry of Educatio n,Key L abo rato ry o f Crop Ger mplasm Reso urces o f Hebei,Ag r icultural U niversit y of H ebei,Baoding071001,China)Abstract:T he method o f sulfonam ides color im etry w as used to deter mine the nitr ate reductase activity(NRA)in cotto n leaves.T he optim um factors fo r determ inatio n of NRA in cotton leav es by in vivo method w ere discussed.Thro ug h com parativ e analysis of several m ain factors of in vivo method such as nitrate induction,2,4-dinitr opheno l,3-chlor oactic acid and boiling etc.,the optimum condition w as identified for deter mination metho d o f NRA in co tto n leaves.The induction o f50mm ol/L KN O3solutio n fo r48h,appendment of2,4-dinitrophenol befo re elicitting air and of1,6-dipho sphate fructose after elicitting air,boiling10min after incubated fo r35m in at30e in the dark could o btain the highest NR activity.T he results sho w ed that in vivo method w as r eliable and easy to determine the NR activity of co tton leaves,and this meth-od lays the foundatio n fo r further study on nitro gen metabolism of co tton.Key words:cotton;nitr ate reductase;determination of enzym e activity硝酸盐是植物重要的氮素来源,在其代谢过程中通过硝酸还原酶的作用转变为亚硝酸盐,然后再通过亚硝酸还原酶的作用转变成氮循环的重要原料-铵。
植物吸收利用环境中的NO3-,需经过2个¹收稿日期:2010-05-01基金项目:河北省科技支撑计划重大项目(06220113D);河北省自然科学基金重大项目(C2006001034).作者简介:刘洁(1984-),女,河北省廊坊市人,在读硕士生,主要从事分子遗传及其育种应用研究.通讯作者:马峙英,教授,主要从事棉花育种研究.E-mail:mzhy@河北农业大学学报第33卷同化反应步骤:首先由硝酸还原酶(Nitrate reduc-tase,NR)把NO3-还原为亚硝态氮(N O2-),然后再由亚硝酸还原酶(Nitrite r eductase,NiR)把NO2-还原为NH4+,才能进一步参与氨基酸及蛋白质的合成[1]。
1952年Evans和N ason在红色链孢霉中最早发现硝酸还原酶(NR),次年又在高等植物中发现[2]。
硝酸还原酶是高等植物氮素同化的限速酶,可直接调节硝酸盐还原,从而调节氮代谢,并影响到光合碳代谢[3]。
硝酸还原酶活性(NRA)的高低不仅表明了植物体内硝酸盐的吸收、积累水平,也反映着植物对氮素的利用水平[4]。
在绿色器官中NR mRNA的表达水平在光下是增加的。
在黑暗中虽然施加了硝,但NR mRNA也是持续的低水平[5]。
NR对环境条件十分敏感,光、NO3-含量、CO2浓度等均会影响其活性[6]。
在植物氮代谢的研究中,硝酸还原酶活性是研究重点之一。
目前报道的硝酸还原酶活性的测定方法主要有体外法和体内法[7-9]。
体外法操作流程复杂、要求条件较高,相比之下体内法简便、快速,在研究中应用较多。
有报道认为,体内法存在NRA测定值偏低、重复性不够理想的缺点,因而需要针对不同的测定材料,确定最佳的测定条件[9]。
但有关棉花氮代谢中硝酸还原酶活性测定的方法还未见报道。
本研究深入探讨了体内法测定棉花叶片硝酸还原酶活性的最佳条件,为进一步研究棉花的氮素代谢奠定基础。
1材料与方法1.1供试材料供试棉花品种为陆地棉品种/邯2080,由河北农业大学棉花遗传育种研究室提供。
1.2试验方法1.2.1棉花无菌苗的培养种子经浓硫酸脱绒后晾干,用011%升汞处理8~10min,无菌水冲洗3~4次,无菌水浸泡过夜至露白,将处理好的种子接种于无菌苗培养基上,(25?2)e下培养,待棉苗长到4~ 5片真叶时,摘取真叶用于硝酸还原酶活性测定。
1.2.2试验材料的KNO3诱导处理硝酸还原酶是一种诱导酶,有报道指出用KN O3溶液诱导可以提高材料中的硝酸还原酶活性[10-11]。
根据报道,本研究利用KNO3溶液进行了诱导处理。
具体操作是:取棉花无菌苗叶片,用蒸馏水洗净、吸干,用直径为1cm的打孔器制成叶盘,随机取50个称重,置入50mmo l/L KN O3溶液中室温下进行诱导处理(为防止水分蒸发,将叶片用透明薄膜包被),处理时间为12、24、36和48h,每天的光、暗周期各12h,并以未诱导处理的棉苗作为对照。
1.2.3硝酸还原酶活性测定参照周树等的体内测定法,测定棉花叶片中硝酸还原酶活性[9]。
将KNO3诱导处理后的棉花叶片置于50mL三角烧瓶中,加入10mL含012mol/L KNO3的磷酸缓冲液(011m ol/L,pH715),空白对照选用不含KNO3的磷酸缓冲液。
将三角烧瓶放入真空干燥器中抽气,反复数次,使叶片完全沉于液面下,取出三角烧瓶置于30e温箱中,暗保温30min,保温结束后取1mL反应液于试管中,加入2mL1%对氨基苯磺酸溶液、2mL012%A-萘胺溶液,30e静置30min,用DU800型分光光度计于520nm波长下测定吸光值,每个处理重复3次。
将1g鲜重材料每小时催化生成NO2-的微摩尔数定义为1U[8]。
在上述基本流程基础上,设置以下几种处理:¹显色液配方处理:本试验中分别用3mo l/L H Cl、H2SO4、H3PO4和H Ac配制对氨基苯磺酸和A-萘胺显色液。
º2,4-二硝基苯酚处理:分别在抽气前和抽气后向三角烧瓶中加入2mL1mm ol/L的2,4-二硝基苯酚,以阻止NO2-被进一步还原,比较抽气前和抽气后加入2,4-二硝基苯酚对NRA的影响。
»1,6-二磷酸果糖处理:在抽气后向三角烧瓶中加2m L215mm ol/L的1,6-二磷酸果糖溶液,为硝酸还原酶的诱导合成提供能量。
¼三氯乙酸处理:暗保温结束后,加入015mL 1%三氯乙酸,使酶钝化。
½暗保温处理:设置20、30、35、40min3个处理时间。
¾煮沸处理:将暗保温35m in后的反应液分别煮沸2、5、10、15m in,并与未煮沸的进行比较[13-14]。
2结果与分析2.1显色液配方处理对NRA的影响从表1可以看出,随着酸强度的增加,A520值呈现逐渐下降的趋势,具体表现为H Ac>H3PO4> H Cl>H2SO4,而且以3mol/L H Ac为溶剂配制的显色液与NO2-反应经过15m in即可在520nm获得最大吸光值,而其余3种需显色30m in A520才能达到最大值,并且它们的A520值均小于H Ac作为溶剂的显色剂。
2第4期 刘 洁等:棉花叶片硝酸还原酶活性的测定方法表1 几种配方显色液对NO 2-显色速度和灵敏度的影响Table 1 The influence of several solution formulationson NO 2-developing speed and sensitivity配方Fo rmula A 520显色15min 显色30min 3mo l/L H Cl 0.795?0.042 1.37?0.0123mo l/L H 2SO 40.512?0.021 1.159?0.0083mo l/L H 3PO 40.975?0.035 1.421?0.0103mo l/LH A c1.575?0.0091.585?0.011注:表中数据为平均值?标准误(n =3),以下同。
2.2 KNO 3诱导处理对NRA 的影响从图1可以看出,经过硝酸盐诱导的棉花叶片中NRA 明显高于未经诱导处理的叶片。