棉花叶片硝酸还原酶活性的测定方法_刘洁

第33卷第4期2010年7月

河北农业大学学报

J OU RNAL OF AGRICU LTU RAL UNIVERSITY OF H EBEI

Vol.33No.4

Jul.2010

文章编号:1000-1573(2010)04-0001-04

棉花叶片硝酸还原酶活性的测定方法

刘洁,王省芬,张桂寅,吴立强,

李志坤,马峙英

(华北作物种质资源研究与利用省部共建实验室,河北省作物种质资源重点实验室,河北农业大学,河北保定071001)

摘要:本研究应用磺胺比色法测定棉花叶片硝酸还原酶活性(NR A),探讨了体内法测定棉花叶片NR A的最适条件。通过分析比较硝酸盐诱导、2,4-二硝基苯酚、三氯乙酸及煮沸等因素对N RA测定结果的影响,建立了体内法测定棉花叶片N RA的最佳条件,即用50mmol/L的KN O3溶液诱导棉花叶片48h、抽气前后分别加入2,4-二硝基苯酚和1,6-二磷酸果糖、暗保温35min后煮沸10min可以使N RA的活性达到最高。棉花叶片N RA测定方法的建立为进一步研究棉花的氮素代谢奠定了基础。

关键词:棉花;硝酸还原酶;酶活性测定

中图分类号:S562文献标志码:A

Determination method of nitrate reductase activity in cotton leaves

LIU Jie,WAN G Xin g-fen,ZHAN G Gu-i yin,WU L-i qian g,

LI Zh-i kun,MA Zh-i ying

(No rth China Key Labor ator y fo r Cro p G ermplasm Resources of M inistry of Educatio n,Key L abo rato ry o f Crop Ger mplasm Reso urces o f Hebei,Ag r icultural U niversit y of H ebei,Baoding071001,China)

Abstract:T he method o f sulfonam ides color im etry w as used to deter mine the nitr ate reductase activity(NRA)in cotto n leaves.T he optim um factors fo r determ inatio n of NRA in cotton leav es by in vivo method w ere discussed.Thro ug h com parativ e analysis of several m ain factors of in vivo method such as nitrate induction,2,4-dinitr opheno l,3-chlor oactic acid and boiling etc.,the optimum condition w as identified for deter mination metho d o f NRA in co tto n leaves.

The induction o f50mm ol/L KN O3solutio n fo r48h,appendment of2,4-dinitrophenol befo re elicitting air and of1,6-dipho sphate fructose after elicitting air,boiling10min after incubated fo r35m in at30e in the dark could o btain the highest NR activity.T he results sho w ed that in vivo method w as r eliable and easy to determine the NR activity of co tton leaves,and this meth-od lays the foundatio n fo r further study on nitro gen metabolism of co tton.

Key words:cotton;nitr ate reductase;determination of enzym e activity

硝酸盐是植物重要的氮素来源,在其代谢过程中通过硝酸还原酶的作用转变为亚硝酸盐,然后再通过亚硝酸还原酶的作用转变成氮循环的重要原料-铵。植物吸收利用环境中的NO3-,需经过2个

¹收稿日期:2010-05-01

基金项目:河北省科技支撑计划重大项目(06220113D);河北省自然科学基金重大项目(C2006001034).作者简介:刘洁(1984-),女,河北省廊坊市人,在读硕士生,主要从事分子遗传及其育种应用研究.

通讯作者:马峙英,教授,主要从事棉花育种研究.E-mail:mzhy@

河北农业大学学报第33卷

同化反应步骤:首先由硝酸还原酶(Nitrate reduc-tase,NR)把NO3-还原为亚硝态氮(N O2-),然后再由亚硝酸还原酶(Nitrite r eductase,NiR)把NO2-还原为NH4+,才能进一步参与氨基酸及蛋白质的合成[1]。

1952年Evans和N ason在红色链孢霉中最早发现硝酸还原酶(NR),次年又在高等植物中发现[2]。硝酸还原酶是高等植物氮素同化的限速酶,可直接调节硝酸盐还原,从而调节氮代谢,并影响到光合碳代谢[3]。硝酸还原酶活性(NRA)的高低不仅表明了植物体内硝酸盐的吸收、积累水平,也反映着植物对氮素的利用水平[4]。在绿色器官中NR mRNA的表达水平在光下是增加的。在黑暗中虽然施加了硝,但NR mRNA也是持续的低水平[5]。NR对环境条件十分敏感,光、NO3-含量、CO2浓度等均会影响其活性[6]。在植物氮代谢的研究中,硝酸还原酶活性是研究重点之一。

目前报道的硝酸还原酶活性的测定方法主要有体外法和体内法[7-9]。体外法操作流程复杂、要求条件较高,相比之下体内法简便、快速,在研究中应用较多。有报道认为,体内法存在NRA测定值偏低、重复性不够理想的缺点,因而需要针对不同的测定材料,确定最佳的测定条件[9]。但有关棉花氮代谢中硝酸还原酶活性测定的方法还未见报道。本研究深入探讨了体内法测定棉花叶片硝酸还原酶活性的最佳条件,为进一步研究棉花的氮素代谢奠定基础。

1材料与方法

1.1供试材料

供试棉花品种为陆地棉品种/邯2080,由河北农业大学棉花遗传育种研究室提供。

1.2试验方法

1.2.1棉花无菌苗的培养种子经浓硫酸脱绒后晾干,用011%升汞处理8~10min,无菌水冲洗3~4次,无菌水浸泡过夜至露白,将处理好的种子接种于无菌苗培养基上,(25?2)e下培养,待棉苗长到4~ 5片真叶时,摘取真叶用于硝酸还原酶活性测定。1.2.2试验材料的KNO3诱导处理硝酸还原酶是一种诱导酶,有报道指出用KN O3溶液诱导可以提高材料中的硝酸还原酶活性[10-11]。根据报道,本研究利用KNO3溶液进行了诱导处理。具体操作是:取棉花无菌苗叶片,用蒸馏水洗净、吸干,用直径为1cm的打孔器制成叶盘,随机取50个称重,置入50mmo l/L KN O3溶液中室温下进行诱导处理(为防止水分蒸发,将叶片用透明薄膜包被),处理时间为12、24、36和48h,每天的光、暗周期各12h,并以未诱导处理的棉苗作为对照。

1.2.3硝酸还原酶活性测定参照周树等的体内测定法,测定棉花叶片中硝酸还原酶活性[9]。将KNO3诱导处理后的棉花叶片置于50mL三角烧瓶中,加入10mL含012mol/L KNO3的磷酸缓冲液(011m ol/L,pH715),空白对照选用不含KNO3的磷酸缓冲液。将三角烧瓶放入真空干燥器中抽气,反复数次,使叶片完全沉于液面下,取出三角烧瓶置于30e温箱中,暗保温30min,保温结束后取1mL反应液于试管中,加入2mL1%对氨基苯磺酸溶液、2mL012%A-萘胺溶液,30e静置30min,用DU800型分光光度计于520nm波长下测定吸光值,每个处理重复3次。将1g鲜重材料每小时催化生成NO2-的微摩尔数定义为1U[8]。在上述基本流程基础上,设置以下几种处理:

¹显色液配方处理:本试验中分别用3mo l/L H Cl、H2SO4、H3PO4和H Ac配制对氨基苯磺酸和A-萘胺显色液。

º2,4-二硝基苯酚处理:分别在抽气前和抽气后向三角烧瓶中加入2mL1mm ol/L的2,4-二硝基苯酚,以阻止NO2-被进一步还原,比较抽气前和抽气后加入2,4-二硝基苯酚对NRA的影响。

»1,6-二磷酸果糖处理:在抽气后向三角烧瓶中加2m L215mm ol/L的1,6-二磷酸果糖溶液,为硝酸还原酶的诱导合成提供能量。

¼三氯乙酸处理:暗保温结束后,加入015mL 1%三氯乙酸,使酶钝化。

½暗保温处理:设置20、30、35、40min3个处理时间。

¾煮沸处理:将暗保温35m in后的反应液分别煮沸2、5、10、15m in,并与未煮沸的进行比较[13-14]。

2结果与分析

2.1显色液配方处理对NRA的影响

从表1可以看出,随着酸强度的增加,A520值呈现逐渐下降的趋势,具体表现为H Ac>H3PO4> H Cl>H2SO4,而且以3mol/L H Ac为溶剂配制的显色液与NO2-反应经过15m in即可在520nm获得最大吸光值,而其余3种需显色30m in A520才能达到最大值,并且它们的A520值均小于H Ac作为溶剂的显色剂。

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