肉制品中志贺氏菌DNA快速提取方法的探讨

道的方法加以改良。沉淀悬浮于 100 µL 无菌 ddH2O 中，加入 400 µL GTP 溶液（6 mol/L 异硫氰酸胍；50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.3； 等体积 Tris 酚）混匀，100℃水浴 5 min，自然冷却。加入 200 µL 氯仿：异戊醇（24：1） 溶液，颠倒混匀，4℃ 13000 r/min 离心 10 min。取上清转入另一离心管中，加入 1/10 体积 的 3 mol/L 醋酸钠（pH 5.2）、2 倍体积的无水乙醇、0.01 g/L 的糖原，冰浴 20 min，4℃ 13000 r/min 离心 10 min，吸取上清，加入 70％乙醇洗涤一次，4℃ 13000 r/min 离心 10 min，弃 上清，室温下放置数分钟。将沉淀溶于 50 µL 无菌 ddH2O，-20℃保存备用。
灵敏度不同。其中，改良的碱性异硫氰酸胍法是最为有效的 DNA 提取方法，其 PCR 检测 的灵敏度可达到 5×100 CFU/g，可提高约 2 个数量级，明显优于其它方法提取 DNA 后的 PCR 检测结果。
2.3 市售猪肉样品的验证
在市场上采集不同来源的猪肉共5份，均按照国标（GB 4789.5）验证不含志贺氏菌。将 志贺氏菌人工污染到肉制品中，利用经改良的碱性异硫氰酸胍法提取人工污染肉制品中志贺 氏菌的DNA进行PCR验证，其最低检出限均小于10 CFU/g。表明该法检测效果好，可广泛应 用于肉制品的前处理。
肉 5 g，加 50 mL 无菌生理盐水，无菌条件下研磨成匀浆（每 10 mL 匀浆液相当于 1 g 肉样 品）。将志贺氏菌分别以 5×104 CFU/g，5×103 CFU/g，5×102 CFU/g，5×101 CFU/g，5×100 CFU/g 不同浓度人工接种到肉制品匀浆液中，37℃，250 r/min 振荡培养 4～5 h 后，提取志贺氏菌 的 DNA。
1.2.3 DNA 质量的统计分析 采用 DPS 软件统计，用 ANOVA 进行邓肯氏多重差异分析。
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1.2.4 志贺氏菌的 PCR 检测 用以上不同方法分别提取不同感染浓度下志贺氏菌的 DNA 为模板，进行 PCR 检测。 （1）PCR 引物：根据 GenBank 中 Shigella 的 ipaH 基因序列，利用 Primer 5.0 软件设
（1）沸水浴法：用无菌 ddH2O 悬浮沉淀，4℃ 10000 r/min 离心 5 min，弃上清，如上 述重复 1～2 次。最后将沉淀溶于 100 µL ddH2O 中，100℃水浴 10 min 后，4℃ 10000 r/min 离 心 5 min，取上清作为 DNA 模板，-20℃保存备用。
range test, P<0.05.
从图 1 和表 1 可以看出，在起始菌量（5×104 菌体量污染肉制品后提取志贺氏菌 DNA） 相同的情况下，不同方法提取的肉制品中志贺氏菌 DNA 存在着明显差异。沸水浴法和裂解 液煮沸法提取 DNA 虽然省时简单，但 DNA 质量较差；CTAB/SDS 法提取的 DNA 相对质量 较高，但整个操作过程耗时长，且操作繁琐；利用改良的碱性异硫氰酸胍法操作较为简单省 时，且 DNA 质量高。另外，为了减少抽提时间和提取成本，在试验中没有用 RNAase 酶消 化 RNA，所以样品中还存在少量的 RNA，但这些少量 RNA 并不影响后续工作。
（2）裂解液煮沸法：加入 100 µL 裂解液（50 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA pH 8.0； 5 g/L Tween20）悬浮混匀沉淀，100℃水浴 10 min，加入 20 g/L 蛋白酶 K，65℃保温 40 min， 自然冷却。4℃ 10000 r/min 离心 5 min，取上清作为 DNA 模板，-20℃保存备用。
本课题得到重庆市科委自然基金项目(No. 8479)的资助。
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1.1.3 仪器设备 PCR 仪，电泳仪，凝胶成像系统均为 BIO-RAD 公司产品。
1.2 方法
1.2.1 肉制品人工污染志贺氏菌 肉制品在人工污染志贺氏菌前，均按照国标（GB 4789.5）验证不含志贺氏菌。称取猪
（3）PCR 扩增程序：（A）94℃预变性 4 min；（B）94℃变性 45 s，58℃退火 45 s，72℃ 延伸 1 min，30 个循环；（C）72℃延伸 10 min。
（4）电泳检测：取 5 µL PCR 产物在 1.5％琼脂糖凝胶上进行电泳，然后利用凝胶成像 系统观察结果。
（5）测序：将 PCR 产物进行纯化，送往上海生工测序。
2. 结果与分析
2.1 四种方法提取肉制品中志贺氏菌 DNA 的质量
M. .Marker；1. 沸水浴法；2. 裂解液煮沸法；3. CTAB/SDS法；4. 改良的碱性异硫氰酸胍法； 图 1 四种方法提取肉制品中志贺氏菌 DNA 的琼脂糖电泳图
Fig.1 Agarose eiectrophoresis of the four extracted methods for Shigella in meat
志贺菌属（Shigella）细菌通称痢疾杆菌，是一类具有高度传染性和危害严重的革兰氏 阴性肠道致病菌，每年造成全球约 1.6 亿人患病，近 110 万人死亡，绝大多数为 5 岁以下儿 童[1，2]。据报道，志贺氏菌属在我国感染性腹泻病原菌中居首位，每年因志贺氏菌引起食物 中毒事件十分频繁，尤其以牲畜禽肉和水产品的污染较为严重[3，4]。传统的检测方法通常以 细菌培养计数的方式进行，一般需要 5～7 天，因此迫切需要更为准确快速的检测技术。PCR 技术以其特异性强、灵敏度高等优点而成为检测食品中食源性致病微生物的重要工具[5]。然 而影响 PCR 检测方法灵敏度的因素很多，如样品前处理方法、DNA 模板提取方法、操作过 程中的环境条件、PCR 反应条件和体系等。在肉制品中 PCR 抑制因子（如：脂肪、胶原蛋 白、金属离子以及其它的蛋白质等）的存在大大降低了 PCR 检测的灵敏度[6]。因此如何消 除 PCR 抑制因子有效提取 DNA，对利用 PCR 技术检测肉制品中志贺氏菌具有重要意义。 本文开展了 4 种用于肉制品中志贺氏菌 DNA 提取方法的比较研究，旨在筛选快速、准确、 经济、省时的 DNA 提取方法，为应用 PCR 技术检测肉制品中志贺氏菌及其它病原菌奠定 基础。
1.2.2 肉制品中志贺氏菌 DNA 的提取方法 取 10 mL 匀浆液，500 r/min 离心 3 min，吸取上清，再以 13000 r/min 离心 10 min，弃
上清。用生理盐水悬浮沉淀后，加入 0.25 倍体积的乙酸乙酯，振荡器混匀 2 min，13000 r/min 离心 10 min，弃上清。然后分别采用以下四种方法提取志贺氏菌的 DNA。

肉制品中志贺氏菌DNA快速提取方法的探讨
陈伟，李正国*，杨平，杨迎伍，王国民
重庆大学生物工程学院，重庆（400044）
E-mail：zhengguoli@
摘 要：肉制品中致病菌 DNA 的提取是进行 PCR 检测的基础。以污染志贺氏菌的猪肉为 材料，比较了沸水浴法、裂解液煮沸法、CTAB/SDS 法、改良的碱性异硫氰酸胍法四种 DNA 提取方法对肉制品中志贺氏菌 DNA 的提取效果，并以提取的 DNA 为模板进行了 PCR 检测。 结果表明：利用改良的碱性异硫氰酸胍法可快速有效的从被污染的肉制品中提取志贺氏菌 DNA，通过 PCR 技术检测，对猪肉的最低检出限为 5×100 CFU/g，整个检测时间小于 8 h。 经改良的碱性异硫氰酸胍法提取肉制品中的 DNA 操作简便、经济省时，且 PCR 检测效果 好，具有较强的实际应用价值。 关键词：肉制品，志贺氏菌，DNA 提取，PCR
沸水浴法
1.0252 c
11.249 d
裂解液裂解法
1.0932 c
25.247 c
CTAB/SDS 改良的碱性异硫氰酸胍法
1.7589 b 1.8872 a
25.953 b 31.471 a
注：在 P<0.05 下进行邓肯氏多重差异分析，同一列不同的字母代表差异显著。
Note: In the same column followed by the different letters are significant difference by Duncan's multiple
计引物。其正相引物为：5’－cttgaagggctggctatggctaa－3’，反相引物为：5’－ gcggaaaaggtgttggcgtgct－3’，扩增片段长度为 380 bp。
（2）PCR 反应体系：2.5 µL 10×PCR buffer，2.5 µL MgCl2(25 mmol/L)，0.5 µL dNTP 混 合物（10 mmol/L），0.3 µL 正、反相引物（25 µmol/L）, Taq 酶（2.5U），2 µL 模板，加 ddH2O 至 25 µL。
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表 1 肉制品中志贺氏菌 DNA 质量以及产量的比较
Table 1 Comparison of the quality and quantity of DNA extracted from meat
方法
Ratio（OD260/OD280） DNA 产量（µg）
2.2 PCR 检测结果
A
B
C
D
A.沸水浴法提取DNA；B.裂解液煮沸法提取DNA；C.CTAB/SDS法法提取DNA； D.改良的碱性异硫氰酸胍法提取DNA。
M. Marker D2000；1.阴性对照；2.阳性对照；3～7.志贺氏菌浓度分别为5×104 CFU/g, 5×103 CFU/g, 5×102 CFU/g, 5×101 CFU/g, 5×100 CFU/g.
（3）CTAB/SDS 法[7]：加入 570 µL TE 溶液（10 mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，pH 8.0）悬浮混匀沉淀，加入 10％SDS 30 µL 和 20 g/L 蛋白酶 K 5 µl，37℃温育 1 h。再加入 5 mol/L NaCl 100 µL，CTAB/ NaCl 80 µL，混匀，65℃温育 20min，加入等体积的酚：氯仿：异戊醇 （25：24：1）溶液，颠倒混匀，4℃ 13000 r/min 离心 10 min。取上清液转入另一个离心管 中，加入等体积的氯仿：异戊醇（24：1）溶液，颠倒混匀，4℃ 13000 r/min 离心 10 min。 取上清转入另一离心管中，加入 0.6 倍异丙醇，颠倒混匀，室温放置约 30 min，4℃ 13000 r/min 离心 10 min，弃上清。加入 70％乙醇洗涤一次，4℃ 13000 r/min 离心 10 min，弃上清，室 温下干燥数分钟。将沉淀溶于 50 µL 无菌 ddH2O，-20℃保存备用。