临床生化检验 第四章 脂蛋白的测定

脂蛋白脂酶
≥4 000U/L
甘油激酶
≥40 U/L
磷酸甘油氧化酶
≥500 U/L
过氧化物酶
≥2 000U/L
ATP
2.0mmol/L
硫酸镁
15mmol/L
4-AAP
0.4mmol/L
4-氯酚
4.0mmol/L
2. 三油酸甘油酯标准液
操作
加入物 血清(μl) 标准液(μl) 蒸馏水(μl) 酶试剂(μl)
这些显色反应须用强酸试剂，干扰因素多，准确 测定有赖于从标本中抽提、皂化、纯化过程，因而操 作较繁，不适于分析大批量标本，且不适于自动分析。
1．Liberman-Burchard反应
1885年Liberman发现胆固醇在硫酸、醋酐溶液中显色， 1890年Burchard用此反应测定胆固醇称为L-B反应。
操作
加入物 血清(μl) 标准液(μl) 蒸馏水(μl) 酶试剂(μl)
空白管 － － 10
1000
标准管 － 10 －
1000
测定管 10 － －
1000
混匀后37℃水浴5 min，用分光光度计比色，以空白管调 零，于500 nm波长处测各管的吸光度。
评价
具有简便、快速、微量且试剂较稳定等优点，适用于手工 和自动化测定；其主要缺点是所测TG值包括了血清中游离 的甘油。
第二节 血清总胆固醇（TC）的测定
化学法：高铁——硫酸显色法 酶法：胆固醇氧化酶法
一、异丙醇抽提，高铁——硫酸显色法测TC （理解） 原理
试剂
1.异丙醇 2.氧化铝 3.三氯化铁贮存液 4.显色剂 FeCl3贮存液与浓硫酸混合 5.胆固醇标准液
操作
1.制备上清：吸取血清及标准液200ul，放入离心管，向吹 入异丙醇5．0ml，冲散血清，使蛋白沉淀成细颗粒，加塞混 匀后放在60℃水浴中1min，加入氧化铝1g，加塞，将试管横 卧固定在震荡器上摇10min，离心。
2．Zak反应
1953年Zak提出用硫酸、醋酸和Fe3+等与胆固醇作用 生成紫红色化合物来测定胆固醇，称为Zak反应。
(二)酶测定法
特点：
常规测定中现已广泛应用酶法，酶法具有特异性好，精密度 和灵敏度都能很好地满足临床实验室的要求，既可以手工操作， 也适合自动分析，但酶法测定中出现了不同程度的基质效应。
③本法具有氧化酶反应途径的共同缺陷，易受到一些还原性物质如尿酸、 胆红素、维生素C和谷胱甘肽等的干扰。
【参考值】
血清总胆固醇合适范围： ≤5.20mmol/L (200mg/dl)，
边缘升高：5.23～5.69mmol/L(201～219mg/dl)，
升高：≥5.72mmol/L (220mg/dl)。
肾脏疾病：如肾病综合症等。
(二)低脂蛋白血症
1．家族性 2．长期饲喂不足
第一节 血清甘油三酯（TG）的测定
化学法：乙酰丙酮显色法 酶法：磷酸甘油氧化酶法
一、乙酰丙酮显色法测TG （了解）
原理
试剂
1．抽提液 正庚烷、异丙醇 2．40 mmol/L H2SO4溶液 3．皂化剂 氢氧化钾，异丙醇 4．氧化剂 过碘酸钠、醋酸铵、冰醋 酸 5．显色剂 乙酰丙酮、异丙醇 6．三油酸甘油酯标准液
12~16%
FC
4~7%
Apo
6源自文库10%
VLDL
Ch－rich Lipoprotein
LDL
5~6% TG
~7%
35~45% CE 10~20%
PL
22~26%
FC
6~15%
22~25% Apo
25%
~5%
~45% HDL
（三）载脂蛋白 定义：
脂蛋白的蛋白部分称为载脂蛋白(apolipoprotein，Apo)
采用酶反应原理的干化学法颇为实用，其缺点是价格高， 精密度差。胆固醇的酶测定法始于70年代。由于操作简便，试 剂无腐蚀性，特别适用于自动生化分析，目前已成为测定胆固 醇的主要方法。
CEH-COD-PAP法
原理：
胆固醇酶测定法的试剂中，除了上述三种酶、酚和4-氨基安替比林 外，还有维持pH恒定的缓冲液、胆酸钠、表面活性剂以及稳定剂等。 胆酸钠是为了提高胆固醇酯酶的活性，表面活性剂的作用是促进胆固醇 从脂蛋白中释放出来
常规方法:
1．磷钨酸-镁法
2．HDL直接测定法
HDL直接测定法大致分三类，分别是: 聚乙二醇/抗体包裹法 酶修饰法 选择性抑制法，又称掩蔽法，
【参考值】
HDL-C合适范围： ≥1.04mmol/L (40mg/dl), ＜0.91mmol/L (35mg/dl)为减低。
【临床意义】
流行病学与临床研究证明，HDL-C与冠心病发病呈负相关， HDL-C低于0.9 mmol/L 是冠心病危险因素。HDL-C大于 1.55mmol/L被认为是冠心病的“负”危险因素。 HDL-C下降 还多见于脑血管病、糖尿病、肝炎、肝硬化病人。高TG血症往 往伴以低HDL-C，肥胖者的HDL-C也多偏低。吸烟可使HDLC下降，适量饮酒、长期体力劳动和运动会使HDL-C升高。
分别准确吸取上清液于另外 3 支试管中
0.3
0.3
0.3
1.0
1.0
1.0
加入皂化剂后，充分混匀各管，56℃水浴保温
5min，然后再分别加入下列试剂
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
混匀，56℃水浴保温25 min，冷却，于415 nm波长 处，以空白管调零，测出各管的吸光度。
计算
血清
TG(mmol/L)＝
临床上比较常用的是预染法电泳。
【参考值】
血清脂蛋白琼脂糖凝胶电泳： α-脂蛋白：0.30-0.40， 前β-脂蛋白：0.13-0.25， β-脂蛋白：0.50-0.60， 乳糜微粒：阴性。
（二）高密度脂蛋白测定
常以测定HDL-C含量代表HDL水平。
参考方法:
超速离心分离HDL，然后用化学法（ALKB法）或 酶法测定其胆固醇含量，此法需特殊设备，而且不易 常握。
脂蛋 白的
脂蛋白（a）[Lp(a)] 高密度脂蛋白（HDL)
分类
乳糜微粒
电泳法
前- -脂蛋白 -脂蛋白

CM
前
♁
-脂蛋白
（二）血浆脂蛋白的组成与结构
结构：
TG－rich Lipoprotein
CM
TG
90~95%
50~65%
2~4%
2~6% ~1% 1~2%
CE
8~14%
PL
2.比色
加入物 血清上清液(ml) 标准液上清液(ml) 异丙醇(ml) 显色剂(ml)
空白管 － － 1.0 3.0
标准管 － 1.0 － 3.0
测定管 1.0 － － 3.0
充分混匀后继续60℃水浴15min，然后置室温冷却后530～ 550nm比色。
计算
血清
TG(mmol/L)＝
测定管吸光度 标准管吸光度
× 标准液浓度
参考值 犬：3.50-
?
意义 。?
?
评价
本法测定范围较宽，干扰因素多，准确测定有赖于 从标本中抽提、皂化、纯化过程，操作较繁，不适于 大批量标本分析及自动分析，一般很少用。
二、磷酸甘油氧化酶法（GPO-PAP法）
原理
试剂
1. 甘油三酯液体稳定酶试剂组成
GOODs缓冲液(pH7.2) 50mmol/L
（六）脂代谢有关酶
脂蛋白脂肪酶 (lipoprotein lipase, LPL) 卵磷脂-胆固醇酰基转移酶 (LCAT) HMG CoA还原酶(HMGCoA reductase)
(七)血浆脂蛋白代谢
外源性代谢
L
CM代谢：饮食摄入的Ch和TG 在小肠中合成CM及其代谢过程
P
代 谢
VLDL-IDL-LDL代谢：由肝合成 VLDL, 再转变为IDL和LDL,并被肝 或其它器官代谢的过程
测定管吸光度 标准管吸光度
× 标准液浓度
参考值（TG）
犬:0.43mmol/L
?
猫：0.40mmol/L
评价
本法测定范围较宽，干扰因素多，准确测定有赖于 从标本中抽提、皂化、纯化过程，操作较繁，不适于 大批量标本分析及自动分析，一般很少用。
二、磷酸甘油氧化酶法（GPO-PAP法）
原理
试剂
测定管 0.2 － － 2.5 0.5
边加边摇，使之充分混匀，静置分层后，
分别准确吸取上清液于另外 3 支试管中
0.3
0.3
0.3
1.0
1.0
1.0
加入皂化剂后，充分混匀各管，56℃水浴保温
5min，然后再分别加入下列试剂
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
混匀，56℃水浴保温25 min，冷却，于415 nm波长 处，以空白管调零，测出各管的吸光度。
1. 甘油三酯液体稳定酶试剂组成
GOODs缓冲液(pH7.2) 50mmol/L
脂蛋白脂酶
≥4 000U/L
甘油激酶
≥40 U/L
磷酸甘油氧化酶
≥500 U/L
过氧化物酶
≥2 000U/L
ATP
2.0mmol/L
硫酸镁
15mmol/L
4-AAP
0.4mmol/L
4-氯酚
4.0mmol/L
2. 三油酸甘油酯标准液
计算
血清
TG(mmol/L)＝
测定管吸光度 标准管吸光度
× 标准液浓度
参考值
评价
本法测定范围较宽，干扰因素多，准确测定有赖于 从标本中抽提、皂化、纯化过程，操作较繁，不适于 大批量标本分析及自动分析，一般很少用。
（一）化学测定法
特点：
化学测定法通常需抽提纯化。显色剂主要有两类： ①醋酸-醋酐-硫酸 ②高铁硫酸。
种类：
分为ApoA、B、C、D、E、F、G、H、J等。
（四）脂蛋白受体
主要有LDL受体、残粒受体（remnant receptor）及清道 夫受体（scavenger receptor）。
（五）胆固醇酯转运蛋白
组成：
胆固醇酯转运蛋白（CETP） 磷脂转运蛋白（PTP） 甘油三酯转运蛋白（TTP）
第四章 脂蛋白的测定
概述
一、血脂及血浆脂蛋白
定义： 血脂：是血浆中的中性脂肪和类脂的总称
脂蛋白：脂类难溶于水，正常血浆脂类物质 与蛋白质结合成脂蛋白的形式存在。
（一）血浆脂蛋白的分类
乳糜微粒（chylomicron,CM）
极低密度脂蛋白（VLDL)
超速离心
中间密度脂蛋白（IDL) 低密度脂蛋白（LDL）
高TC血症：原发和继发
低TC血症：原发和继发
四、血清（浆）脂蛋白测定
(一)血清脂蛋白电泳
脂蛋白电泳分析可分为预染法和电泳后染色法两大类。
预染法的操作比较简单，分离效果直观。其操作过程是先 将待测血清和苏丹黑染料按一定比例混合进行预染处理，离心后 取上清液进行电泳分析。
电泳后染色法为用电泳方法先将血浆脂蛋白各成份分开，再 用苏丹黑或油红O进行染色。
【临床意义】
TC除了作为高胆固醇血症的诊断指标之外，不能作为其它任何疾病的诊断 指标，对于动脉粥样硬化和冠心病而言，TC是一个明确的危险因子，与冠心 病的发病率呈正相关。
影响TC水平的因素
①年龄与性别； ②长期的高胆固醇、高饱和脂肪酸和高热量饮食可使TC增高； ③遗传因素； ④其它：如缺少运动、脑力劳动、精神紧张等可能使TC升高。
操作
加入物 血清(ml) 标准液(ml) 蒸馏水(ml) 抽提剂(ml) 40mmol/L H2SO4(ml)
上清液(ml) 皂化剂(ml)
氧化剂(ml) 显色剂(ml)
空白管 － － 0.2 2.5 0.5
标准管 － 0.2 － 2.5 0.5
测定管 0.2 － － 2.5 0.5
边加边摇，使之充分混匀，静置分层后，
一、高铁——硫酸显色法测TC （理解）
原理
操作
加入物 血清(ml) 标准液(ml) 蒸馏水(ml) 抽提剂(ml) 40mmol/L H2SO4(ml)
上清液(ml) 皂化剂(ml)
氧化剂(ml) 显色剂(ml)
空白管 － － 0.2 2.5 0.5
标准管 － 0.2 － 2.5 0.5
评价：
➢优点：本法灵敏度高、准确度高、精密度好，线性范围宽。
➢主要缺点是：
①某些胆固醇酯酶对胆固醇酯的水解不完全，不能用纯胆固醇结晶以有机 溶剂配制的溶液作为TC分析的校准液，而应以准确定值的血清作为标准， 此校准液（品）相当于三级标准。 ②表面活性剂，如吐温-40可以干扰胆固醇酯酶的作用，而聚乙烯醇6000 可使结果提高1％～2％；
内源性代谢
HDL代谢：胆固醇逆转运(RCT)
二、脂蛋白代谢紊乱
（一）高脂蛋白血症
高脂血症:血浆中胆固醇或/ 和甘油三酯水平升高 的现象。
原发性
原因
不合理饲喂：高糖、高脂饲料 代谢性疾病和内分泌疾病：糖尿病、
肥胖、甲状腺机能减退、皮质醇增 继发性 多症等
肝、胆、胰疾病：肝炎、肝硬化、胆 道阻塞、胰腺炎等
空白管 － － 10
1000
标准管 － 10 －
1000
测定管 10 － －
1000
混匀后37℃水浴5 min，用分光光度计比色，以空白管调 零，于500 nm波长处测各管的吸光度。
评价
具有简便、快速、微量且试剂较稳定等优点，适用于手工 和自动化测定；其主要缺点是所测TG值包括了血清中游离 的甘油。