细胞固定及常用的固定液

细胞固定及常用的固定液

•取材后的组织需立刻投于固定剂中

–固定使组织和细胞的蛋白质凝固，终止内源性或外源性酶反应，防止组织自溶或异溶，以保持原有结构和形态；

–对免疫组化而言更有原位保存抗原的作用，避免抗原失活或弥散。

•常用固定液：固定剂品种很多，但大多属于醛类和醇类。其固定原理不同，各有优缺点。

–醛类（常用甲醛、戊二醛和多聚甲醛）

–醇类（常用乙醇）

–其它（丙酮）

(1) 醛类

•甲醛(福尔马林)应用最广

–原理：形成分子间的交联，影响蛋白构型而使之固定。

–优点：形态结构保存好，且穿透性强，组织收缩少。

–缺点：

•甲醛放置过久可氧化为甲酸，使溶液pH降低，影响染色；

•醛基与抗原蛋白的氨基交联形成羧甲基，使抗原决定簇的三维构象出现空间障碍；

•分子间交联形成的网格结构可能部分或完全掩盖某些抗原决定簇，使之不能充分暴露。可造成假阴性的染色结果。

–注意事项：

• C)，为此组织块不宜过厚。 缩短固定时间，降低固定温度

•改用中性缓冲福尔马林，以pH值7.2～7.4 0.01mol/L的磷酸盐缓冲液配制成10％甲醛固定液，减少固定液pH的变化。

•固定后充分水洗以减少分子间交联。

•切片在作免疫组化染色前，先经预处理使抗原再现(抗原修复)。

•戊二醛：

–穿透性强，微细结构保存好，但对抗原有一定影响，常与其他固定剂联合用作免疫电镜固定液。

•多聚甲醛(常用4%)：

–可用于免疫电镜；也可用于免疫荧光染色。

•主要检测组织内一些性能娇弱的抗原特别是细胞表面抗原，例如各类淋巴细胸分化决定簇(CD)、主要组织相容性抗原等。

(2) 醇类

•最常用的醇类固定剂是乙醇。

–其固定作用：使细胞内蛋白、糖类发生沉淀。

–优点：穿透性强、抗原性保存好。

–缺点：

•脱水性强，易引起组织收缩、变硬，影响切片质量，因而乙醇固定时间不宜过长(2h内)。

•乙醇使蛋白变性的作用轻，固定后可再溶解；染色过程中，温育时间长，抗原可流失而减弱反应强度。

(3) 其它固定剂

•丙酮：

–对抗原性的保存好，但脱水性更强，较少用于组织标本，但细胞爬片常用丙酮固定。

抗原修复——原因

•常规的石蜡切片标本均用甲醛固定，结果使得：

–抗原性物质形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇；

–蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。

•要求：在染色时，需要先进行抗原修复或暴露，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态。