制备色谱技术

制备薄层色谱
展开槽
条状上样
处理样品量 1mg~ 1g
薄层制备 活化 点样 展开 检测/收集
离心薄层
上个世纪60年代Dalcortivo 提出， 又称旋转薄层 特点： 操作简便、分离时间短、可重复使用
Harrison
Hitachi
Centrifugal Thin-Layer Chromatograph
径向柱
特点： 外表面大，样品上样量多； 增加色谱柱长度，可成线性增大制备量； 样品保留时间短，可保留活性
应用： 生物活性样品制备（离子交换和亲和色谱）
峰接触法
柱色谱中分离、实验条件选择
峰重叠法
微量组分的分离
难分离物质对的分离
正相色谱系统
制备柱上柱量 分析柱上柱量 ( dP )2 LP
制备分离的五要素
样品性质： 组成、基体、含量、价值等
产品纯度： 天然产物、测试样、生物活性等 (70%) (95%) (活力)
制备量：mg, g, kg, t
时间和成本：科学研究 工业生产
分离的影响因素
Rs N ( a 1)( k ) 4 a k 1
固定相、 流动相选择 固定相颗粒直径、上样量、流动相等 适当增加有利于制备分离
HSCCC 原理示意图
1.聚四氟乙烯管中的固定相不需要载体，因而消除了常规色谱中由于使用载体而 带来的吸附现象，特别适用于分离极性物质和具有生物活性的物质 。
2. 由于其与一般色谱的分离方式不同，使其特别适用于制备性分离。
最近的研究结果表明：一台普通的高速逆流色谱仪一次进样可达几十毫升， 一次可分离近10g的样品。
优点：薄层色谱条件可直接套用到干柱色谱
分离效果比湿装柱高 样品带可切割，避免各成分交叉 溶剂消耗少，操作简单
缺点：装填技术要求高
柱样品容量较小
方法建立：
分离类型选择
色谱柱选择 ： 材料 （玻璃、聚乙烯薄膜柱等） 尺寸 （内径：柱长=1：10~1：20）
填充剂选择： 粒度（200~400目） 用量（1：20~1：500） 预处理
检测器： 示差折光、 紫外 （分流器）
特殊形式色谱柱 色谱饼
优点：
样品处理量大 流动相流速高 节省分析时间
生物样品： 蛋白质、多肽、核酸
大直径柱
d 10cm
Novasep
Waters
径向压缩
轴向压缩
用于石油化工、食品工业、药物工业等
环型压缩
轴向压缩技术
尺寸：41.6 填料：4000kg 重量： 36 000kg
制备凝胶-上样-电泳-活性染色-脱色-制干胶
Pharmacia公司的SE250 小型夹心式垂直板电泳装置
1
2
3
4
LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1
心肌乳酸脱氢同工酶(LDH)的电泳分离
四、展望
新的高性能色谱分离材料
设备性能、工艺优化
低成本、环保、实用
理论模型的深入研究
参考文献
1 周同惠等。纸色谱和博层色谱。北京：科学出版社，1989 2 霍斯泰特曼K， 马斯顿A，霍斯泰特曼 M 著，赵维民，张
dA
LA
制备柱流量 分析柱流量 ( dP )2 dA
反相色谱系统
三、其它制备色谱技术
Simulated Moving Bed Chromatography (SMB) Preparative Gas Chromatography Preparative Electrophoresis
HSCCC 原理及应用
制备色谱技术及方法建立
内容
1 、概述 2、常用制备色谱技术 3、其它制备色谱技术 4、展望
一、 概
述
制备LC与 分析LＣ比较
制备HPLC 分析HPLC
目的 样品中特定成 分的高纯度获 取，大量、廉 价的制备
定性分析： 检测的灵敏度 定量分析：分 离度、再现性
填料
流量
20μ以上为 10-
佳
150ml/min
制备电泳技术
▪ 电泳： 带电离子在电场的作用下，向着与其电性相反的电极方向移动，这种 现象称之为电泳。
▪ 聚丙烯酰胺凝胶： 是由单体丙烯酰胺(Acr)和交联剂N,N’-亚甲基双丙烯酰胺 (Bis)在催化剂过硫酸铵(AP)和加速剂N,N,N’,N’-四甲基乙二胺(TEMED)作用下 聚合交联而成的三维网状结构的凝胶，通过改变凝胶浓度及交联度来调节凝胶 的孔径，具有良好的分子筛效应。它已成为目前生化实验室最常用的支持介质。 以它为支持物发展起来的各种聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，不仅能分离、小量制 备生物大分子，而且可以用来研究生物大分子的性质如电荷、相对分子质量、 等电点以及构象等。
制备色谱操作条件优化一般步骤 选择最佳TLC 、HPLC 分离条件 分析型TLC 或HPLC 上进行半制备性分离
放大到制备规模 分析型TLC 或HPLC 上进行产品纯度检验
如不符合要求，重新进行上述实验
二、常用制备色谱技术
1 、制备薄层色谱 2、经典柱色谱 3、低压、中压制备色谱 4、高压制备液相色谱 5、特殊形式色谱柱 6、柱色谱中分离、实验条件选择
Dr．Ito，1966： 运动螺旋管内两液相对流分配的现象。 北京新技术研究所张天佑：19Baidu Nhomakorabea0年，第一台逆流色谱仪器
操作过程：
一根100多米长的螺旋空管，注入互不相溶的两相溶剂中的一相作为固定相，然后用进样器进样； 最后用恒流泵不断注入另一相（流动相），同时启动主机部分运转。由于行星运动产生的离心 力场使得固定相保留在螺旋管内，流动相则不断穿透固定相；这样两相溶剂在螺旋管中实现高效 的接触、混合、分配和传递。由于样品中各组分在两相中的分配比不同，因而能使样品中各组分 得到分离。
鞍山科技大学林炳昌 教授研制的 模拟移动床色谱仪器
应用
1 石油化工 领域： 对二甲苯与间二甲苯分离；对甲苯酚与间甲苯 酚；蒎烯混合物中分离蒎烯。
2 糖醇分离： 万吨果糖生产设备（蔗糖水解产物果糖与葡萄糖分离）
3 手性分离： 氨基酸、布洛芬、troger碱等的分离。
制备气相色谱技术
预热
氮气
填充柱
应用
中草药及天然产物有效成分的分离纯化：目前香豆素， 内酯类，黄 酮，类黄酮，生物碱
类，蒽醌，木质素，多酚类，苷类，萜类，有机 酸、酸酐及酯类等领域都实现了高纯度 的制备分离，纯度等达到99％ 以上 。
大分子生物活性物质的分离：蛋白质、多糖、多肽等生物大分子的分离 。
发酵产物纯化领域：福建微生物研究所成功的分离纯化环孢菌素，得到纯 度98.5%以上的 环抱菌素A,B,C,D单组分,收率达 8 5 %以上 。
经典柱色谱
类型：
吸附柱色谱： 硅胶、 氧化铝、聚酰胺等
分配柱色谱：载体（硅胶、硅藻土、纤维粉等）吸附一层液体构成 固定相，用另一种不相溶的溶剂洗脱
离子交换柱色谱：交联聚苯乙烯离子交换树脂
凝胶柱色谱： 琼脂糖、交联葡聚糖
亲和柱色谱：载体（琼脂糖、交联葡聚糖、聚丙烯酰胺、硅胶等） 表面键合配基
干柱色谱：填充剂按干法装在柱中,欲分离的混合物吸着在干柱的顶端,用溶剂洗 脱,待溶剂达到柱底为止.以荧光定性或以化合物在薄层上的Rf值推定 位置,根据各个成分的位置进行分割,各段以有机溶剂提取.
3-5μ
0.0019.999ml/mi n
流通池
联系
最大允许流速可 为150mL/min
最大允许流速仅 为5 mL/min，或 者10mL/min
在进行制备 HPLC之前， 常先进行分 析HPLC实 验，对分析 方法进行优 化、放大应 用到制备 HPLC中。
线性色谱和非线性色谱
制备分离的目标和策略
天佑译。制备色谱技术。北京：科学出版社，2000 3 师治贤，王俊德。生物大分子的液相色谱分离和制备。北
京：科学出版社，1992 4 张天佑。逆流色谱技术。北京：北京科学技术出版社，
1991 5 袁黎明等。制备色谱技术及应用。北京：化学工业出版社，
2006
SMB 原理及应用
20世纪60年代UOP， 应用于石油化学工业
生产能力 提高60倍 溶剂耗量 减少80倍
不能连续操作 柱材料利用率底 溶剂耗量大
连续进样、连续出料 提高生产能力，降低生产成本
移动床色谱示意图
分离材料磨损
大型 模拟移动床色谱示意图
刚进样
初步分离
稳定状态
法国Separex (Novasep)公司LicoSep 6-800系统
洗脱剂选择： 薄层色谱筛选
上样方式： 净试样法、溶液法、涂覆法
后处理： 旋转蒸发、重结晶等
低压及中压制备色谱
提高压力，增大流速
低压（ 几个大气压）
中压 （几十个大气压）
减压柱色谱
低压制备色谱
加压柱色谱
双链球
空气泵
蠕动泵
中压制备色谱
高压制备色谱
特点： 1 柱长： 20~50CM 2 内径：1~100CM 3 颗粒小，流速高