制备色谱技术

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制备薄层色谱
展开槽
条状上样
处理样品量 1mg~ 1g
薄层制备 活化 点样 展开 检测/收集
离心薄层
上个世纪60年代Dalcortivo 提出, 又称旋转薄层 特点: 操作简便、分离时间短、可重复使用
Harrison
Hitachi
Centrifugal Thin-Layer Chromatograph
径向柱
特点: 外表面大,样品上样量多; 增加色谱柱长度,可成线性增大制备量; 样品保留时间短,可保留活性
应用: 生物活性样品制备(离子交换和亲和色谱)
峰接触法
柱色谱中分离、实验条件选择
峰重叠法
微量组分的分离
难分离物质对的分离
正相色谱系统
制备柱上柱量 分析柱上柱量 ( dP )2 LP
制备分离的五要素
样品性质: 组成、基体、含量、价值等
产品纯度: 天然产物、测试样、生物活性等 (70%) (95%) (活力)
制备量:mg, g, kg, t
时间和成本:科学研究 工业生产
分离的影响因素
Rs N ( a 1)( k ) 4 a k 1
固定相、 流动相选择 固定相颗粒直径、上样量、流动相等 适当增加有利于制备分离
HSCCC 原理示意图
1.聚四氟乙烯管中的固定相不需要载体,因而消除了常规色谱中由于使用载体而 带来的吸附现象,特别适用于分离极性物质和具有生物活性的物质 。
2. 由于其与一般色谱的分离方式不同,使其特别适用于制备性分离。
最近的研究结果表明:一台普通的高速逆流色谱仪一次进样可达几十毫升, 一次可分离近10g的样品。
优点:薄层色谱条件可直接套用到干柱色谱
分离效果比湿装柱高 样品带可切割,避免各成分交叉 溶剂消耗少,操作简单
缺点:装填技术要求高
柱样品容量较小
方法建立:
分离类型选择
色谱柱选择 : 材料 (玻璃、聚乙烯薄膜柱等) 尺寸 (内径:柱长=1:10~1:20)
填充剂选择: 粒度(200~400目) 用量(1:20~1:500) 预处理
检测器: 示差折光、 紫外 (分流器)
特殊形式色谱柱 色谱饼
优点:
样品处理量大 流动相流速高 节省分析时间
生物样品: 蛋白质、多肽、核酸
大直径柱
d 10cm
Novasep
Waters
径向压缩
轴向压缩
用于石油化工、食品工业、药物工业等
环型压缩
轴向压缩技术
尺寸:41.6 填料:4000kg 重量: 36 000kg
制备凝胶-上样-电泳-活性染色-脱色-制干胶
Pharmacia公司的SE250 小型夹心式垂直板电泳装置
1
2
3
4
LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1
心肌乳酸脱氢同工酶(LDH)的电泳分离
四、展望
新的高性能色谱分离材料
设备性能、工艺优化
低成本、环保、实用
理论模型的深入研究
参考文献
1 周同惠等。纸色谱和博层色谱。北京:科学出版社,1989 2 霍斯泰特曼K, 马斯顿A,霍斯泰特曼 M 著,赵维民,张
dA
LA
制备柱流量 分析柱流量 ( dP )2 dA
反相色谱系统
三、其它制备色谱技术
Simulated Moving Bed Chromatography (SMB) Preparative Gas Chromatography Preparative Electrophoresis
HSCCC 原理及应用
制备色谱技术及方法建立
内容
1 、概述 2、常用制备色谱技术 3、其它制备色谱技术 4、展望
一、 概

制备LC与 分析LC比较
制备HPLC 分析HPLC
目的 样品中特定成 分的高纯度获 取,大量、廉 价的制备
定性分析: 检测的灵敏度 定量分析:分 离度、再现性
填料
流量
20μ以上为 10-

150ml/min
制备电泳技术
▪ 电泳: 带电离子在电场的作用下,向着与其电性相反的电极方向移动,这种 现象称之为电泳。
▪ 聚丙烯酰胺凝胶: 是由单体丙烯酰胺(Acr)和交联剂N,N’-亚甲基双丙烯酰胺 (Bis)在催化剂过硫酸铵(AP)和加速剂N,N,N’,N’-四甲基乙二胺(TEMED)作用下 聚合交联而成的三维网状结构的凝胶,通过改变凝胶浓度及交联度来调节凝胶 的孔径,具有良好的分子筛效应。它已成为目前生化实验室最常用的支持介质。 以它为支持物发展起来的各种聚丙烯酰胺凝胶电泳技术,不仅能分离、小量制 备生物大分子,而且可以用来研究生物大分子的性质如电荷、相对分子质量、 等电点以及构象等。
制备色谱操作条件优化一般步骤 选择最佳TLC 、HPLC 分离条件 分析型TLC 或HPLC 上进行半制备性分离
放大到制备规模 分析型TLC 或HPLC 上进行产品纯度检验
如不符合要求,重新进行上述实验
二、常用制备色谱技术
1 、制备薄层色谱 2、经典柱色谱 3、低压、中压制备色谱 4、高压制备液相色谱 5、特殊形式色谱柱 6、柱色谱中分离、实验条件选择
Dr.Ito,1966: 运动螺旋管内两液相对流分配的现象。 北京新技术研究所张天佑:19Baidu Nhomakorabea0年,第一台逆流色谱仪器
操作过程:
一根100多米长的螺旋空管,注入互不相溶的两相溶剂中的一相作为固定相,然后用进样器进样; 最后用恒流泵不断注入另一相(流动相),同时启动主机部分运转。由于行星运动产生的离心 力场使得固定相保留在螺旋管内,流动相则不断穿透固定相;这样两相溶剂在螺旋管中实现高效 的接触、混合、分配和传递。由于样品中各组分在两相中的分配比不同,因而能使样品中各组分 得到分离。
鞍山科技大学林炳昌 教授研制的 模拟移动床色谱仪器
应用
1 石油化工 领域: 对二甲苯与间二甲苯分离;对甲苯酚与间甲苯 酚;蒎烯混合物中分离蒎烯。
2 糖醇分离: 万吨果糖生产设备(蔗糖水解产物果糖与葡萄糖分离)
3 手性分离: 氨基酸、布洛芬、troger碱等的分离。
制备气相色谱技术
预热
氮气
填充柱
应用
中草药及天然产物有效成分的分离纯化:目前香豆素, 内酯类,黄 酮,类黄酮,生物碱
类,蒽醌,木质素,多酚类,苷类,萜类,有机 酸、酸酐及酯类等领域都实现了高纯度 的制备分离,纯度等达到99% 以上 。
大分子生物活性物质的分离:蛋白质、多糖、多肽等生物大分子的分离 。
发酵产物纯化领域:福建微生物研究所成功的分离纯化环孢菌素,得到纯 度98.5%以上的 环抱菌素A,B,C,D单组分,收率达 8 5 %以上 。
经典柱色谱
类型:
吸附柱色谱: 硅胶、 氧化铝、聚酰胺等
分配柱色谱:载体(硅胶、硅藻土、纤维粉等)吸附一层液体构成 固定相,用另一种不相溶的溶剂洗脱
离子交换柱色谱:交联聚苯乙烯离子交换树脂
凝胶柱色谱: 琼脂糖、交联葡聚糖
亲和柱色谱:载体(琼脂糖、交联葡聚糖、聚丙烯酰胺、硅胶等) 表面键合配基
干柱色谱:填充剂按干法装在柱中,欲分离的混合物吸着在干柱的顶端,用溶剂洗 脱,待溶剂达到柱底为止.以荧光定性或以化合物在薄层上的Rf值推定 位置,根据各个成分的位置进行分割,各段以有机溶剂提取.
3-5μ
0.0019.999ml/mi n
流通池
联系
最大允许流速可 为150mL/min
最大允许流速仅 为5 mL/min,或 者10mL/min
在进行制备 HPLC之前, 常先进行分 析HPLC实 验,对分析 方法进行优 化、放大应 用到制备 HPLC中。
线性色谱和非线性色谱
制备分离的目标和策略
天佑译。制备色谱技术。北京:科学出版社,2000 3 师治贤,王俊德。生物大分子的液相色谱分离和制备。北
京:科学出版社,1992 4 张天佑。逆流色谱技术。北京:北京科学技术出版社,
1991 5 袁黎明等。制备色谱技术及应用。北京:化学工业出版社,
2006
SMB 原理及应用
20世纪60年代UOP, 应用于石油化学工业
生产能力 提高60倍 溶剂耗量 减少80倍
不能连续操作 柱材料利用率底 溶剂耗量大
连续进样、连续出料 提高生产能力,降低生产成本
移动床色谱示意图
分离材料磨损
大型 模拟移动床色谱示意图
刚进样
初步分离
稳定状态
法国Separex (Novasep)公司LicoSep 6-800系统
洗脱剂选择: 薄层色谱筛选
上样方式: 净试样法、溶液法、涂覆法
后处理: 旋转蒸发、重结晶等
低压及中压制备色谱
提高压力,增大流速
低压( 几个大气压)
中压 (几十个大气压)
减压柱色谱
低压制备色谱
加压柱色谱
双链球
空气泵
蠕动泵
中压制备色谱
高压制备色谱
特点: 1 柱长: 20~50CM 2 内径:1~100CM 3 颗粒小,流速高
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