制备液相色谱技术(LC-MS)

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超载(overloading):
纯度(purity)、产量(throughput) 和收益(yield)(PTY)三者的关系
浓度过载和体积过载
浓度过载
决定于流动相中的溶解度;
位于吸附等温线的“制备”区 域; 产量由选择性决定; 固定相颗粒大小影响较低。
体积过载
决定于进样体积;
位于吸附等温线的“分析”区 域; 产量由柱子的直径决定; 固定相颗粒需要小一些。
基于质量(Mass-based)
根据馏分的质量作为指令参数,触发馏 分收集器。 特点: 馏分纯度高、且收益高; 馏分保留时间以及色谱峰峰形改变都不会 影响到馏分的纯度; 参数设置方便; 需配备MS检测器,设备费用投入较大。
Mass-based
当使用按质量进行馏分收集时,只有当 MSD 检测到色谱峰含有目标质量数,且该目 标质量数的强度超出特定的阈值时,馏分收 集才被触发。这就确保了在每次进样中只收 集含目标化合物的馏分。大部分情况下只有 一个馏分。
为了准确地触发馏分收集器的启动和停止, 必须测定后运行时间。后运行时间可以转换成 与流速无关的延迟体积。 后运行时间测定方法之一: 通过在流路内注射一种染料,当馏分收集 器针尖出现该染料时记录时间。 后运行时间=t馏分收集器- t检测器
后运行时间测定方法之二:
在馏分收集器内装入一个检测器,该检 测器称为延迟传感器。将延迟校正物注入流 路,两个检测器都记录信号。两个检测器之 间的时间差就是后运行时间。
高效制备液相色谱技术
高效制备液相色谱的原理:
色谱分离原理无论是分析型色谱还是制备型色谱都是相同的, 那就是色谱理论。 但是在理论的遵循上,制备型有时需打折扣。 这是由于两种类型的色谱最终的目的是不同的。 分析型色谱:分离度高,灵敏度高,以含量测定为目的。 制备型色谱:要求纯度、产量和收益。
经典的制备色谱方法与高效制备液相色谱的异同 及优缺点: 经典制备色谱方法:柱色谱、薄层色 谱…… 相同:目的相同;某些方法原理也相同。
制备液相色谱又称纯化系统,是目前高效 率制备纯化合物最有力的方法,广泛应用于: 1.天然产物的分离与纯化 2.合成药物的纯化 3.合成反应中间产物或副产物的制备 4.手性药物的分离与纯化 5.药物杂质的分离制备 ... ...
重复性
选择性要求
色谱柱吸附等温线
正常载荷(loading):
色谱柱吸附等温线
两个问题:
1、延迟体积校正 2、扩散影响
什么是延迟体积?
理想情况下,当检测器检测到组分信号 时,同一时刻,组分也被馏分收集器收集到。 实际情况下,这是做不到的,因为存在 一个延迟体积。 延迟体积:检测池到馏分收集器之间管 路的体积。
高效制备液相色谱流路示意图
延迟体积校正
后运行时间:是指分析物组分从检测池到 馏分收集器所用的时间。
由分析型色谱如何扩展到制备型色谱?
扩展计 算
扩展计算
扩展计算举例
r1=1.5mm, r2=10.6mm, V1=0.6mL/min
V2=?
计算结果:30mL/min
扩展计算举例
?
=30ml/min
计算结果25mg
0.35mL/min流速下的色谱图
(分析型)
经扩展计算,采用不同的柱径、进样量和流速样品的色谱图
上述五种色谱状态的参数:
在分析型色谱柱上,不同进样量的色谱图
在制备型色谱柱上的色谱图
制备液相馏分收集的三种方式
1. 基于时间(Time-based) 2. 基于峰(peak-based) 3. 基于质量(Mass-based)
基于时间(Time-based)
根据馏分的保留时间及其色谱峰宽, 以时间作为馏分收集器动作的指令参数。 特点: 参数设置方便,样品收益高、损失少。 色谱保留时间的不稳定会影响到馏分 的纯度和收益。
Peak-based
利用正、负斜率按峰进行馏分收集。
正、负斜率和阈值可预先设置。
当色谱信号都超出预先设置的正斜率和阈值两 个参数时,将触发峰的收集信号;
当色谱信号低于阈值或低于预先设置的负斜率 时,将触发停止收集信号。 设置阈值的目的是为了消除噪声的影响。
Peak-based实例(只收集后面这一组分)
不同:自动化程度不同,效率不同,分离复杂化 合物的能力不同。
经典制备色谱方法
优点: 设备简单,投资小,见效快。能满足一般样 品的 纯化要求。
缺点: 效率低下,收率低,对于过于复杂的化合物, 纯化效果不理想。 高效制备液相色谱
优点:效率高,收率相对较高,特别适合复杂样品、 性质接近化合物的纯化。纯化效果理想。 缺点:设备复杂昂贵,投资大,运行费用较高。
各种类型的制备液相展示
应用实例:
人参皂甙Re、Rg1的HPLC制备
结束
根据校正时所用的流速,系统将自动计 算出准确的延迟体积,并保存,同时也能计 算出每个流速下的后运行时间,变宽 ,严重削弱了 色谱的分辨(分离)能力。 谱带变宽与流速成反比,与管线长度 和管线内径成正比。
三种不同管径的扩散影响
所以,制备液相色谱中更应注意缩短管路的长度,减 少不必要的死体积。
不足之处是注入的其他样品组分不能回 收。
按质量数进行馏分收集的结果
三种馏分收集方式的比较
X-Based Time Peak 馏分纯度 不高 高 馏分收益 高 不高
Mass


三种馏分收集方式如何选择?
它们与纯度、产量和收益(PTY)的关 系怎样?
结合实际需求合理选择。
高效制备液相色谱流路示意图
Time-based
用峰的时间分割,按峰收集馏分
色谱峰重叠严重,重叠面积很大,收集到的 两个馏分将明显不纯 。---这时应考虑使用 Time-based。
Time-based
基于峰(Peak-based)
根据色谱峰的正负斜率,触发馏分收集器, 以色谱峰正负斜率作为馏分收集器动作的指令 参数。
特点: 馏分纯度高。 馏分保留时间的不稳定不会影响到馏分的 纯度。 参数设置不方便(斜率参数需计算);受 色谱峰峰形改变的影响较大。 样品收益低。
通常浓度过载和体积过载结合着使用。而由于 产量较高的缘故,因而更喜欢使用浓度过载。
浓度过载和体积过载色谱示意图
什么时候使用浓度过载?
什么时候使用体积过载?
一般情况下,由于需要有较大的 throughput ,所以浓度过载使用较多,但当 样品浓度过稀,又没有合适的方法浓缩时或 流动相溶解样品的能力较弱时,这时就应当 使用体积过载。
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