大肠杆菌基因组DNA提取及荧光定量PCR试验设计

大肠杆菌基因组的提取

一、传统法提取大肠杆菌基因组。

1、实验原理

提取的一般过程是将分散好的组织细胞在含十二烷基硫酸钠（）和蛋白酶

K的溶液中消化分解蛋白质，再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质，得到的溶

液经乙醇沉淀使从溶液中析出。

的作用机理是由于其能结合蛋白，中和蛋白的电性，使蛋白质的非共价键

受到破坏，失去二级结构，从而变形失活，蛋白酶K或链霉蛋白酶E均为光谱

蛋白酶，其重要特性是能在和（乙二胺四乙酸二钠）存在的情况下保持很高的

活性。在匀浆后提取的反应体系中，可通过失活蛋白破坏细胞膜、核膜，并使

组织蛋白和分离；而蛋白酶K可将蛋白质降解成小肽或氨基酸，使分子完整地

分离出来。用酚、酚/氯仿抽提除去蛋白质，最后用无水乙醇沉淀。为获得高纯度，操作过程中常加入除去。（十六烷基三乙基溴化铵）是一种去污剂，可溶

解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（0.7 ）是可溶的，当降低

溶液盐浓度到一定的程度（0.3 ）时，从溶液中沉淀，通过离心就可将核酸的

复合物与蛋白，多糖物质分开。最后通过乙醇或异丙醇沉淀，而溶于乙醇或异

丙醇而除去。

2、实验试剂与仪器

1）实验材料：大肠杆菌

2）实验试剂：

液体培养基，溶液，10，蛋白酶K，5 ，溶液，酚/氯仿/异戊醇，异丙醇，70%

乙醇

3）实验仪器：恒温摇床、低温离心机、微量移液器、水浴锅

3、溶液配制

1）液体培养基：细菌培养用胶化蛋白胨10 ，细菌培养用酵母提取物5 ，10，去离子水。

(搅拌溶解后，用5调至7.0.用去离子水定容100，用20/50摇瓶分装5瓶，包扎好，在121℃，1.034×105 高压下蒸汽灭菌20.)

2）缓冲液：

1M 溶液（取242.2g，加2O至1600，加热溶解）

1M 8.0 溶液（取 1M 溶液160用分析纯盐酸调至8.0（需浓盐酸约8.5），加2O定容至200，高压灭菌备用）

缓冲液（10 1 8.0，1M 8.0 5

0.5M =8.0 1向烧杯中加入约400 H2O均匀混合;将溶液定容到500后，高

温高压灭菌，室温保存）

3）蛋白酶K：（20蛋白酶K溶于1无菌双蒸水，-20℃备用）

4）溶液：（5% ，5溶于100 0.5M 溶液中，需加热到65℃使之溶解，然后室温

保存）

4、实验方法步骤

1、将大肠杆菌接种到灭菌好的培养基中，一级培养过夜，以10%的接种量进行二级培养，培养至对数期（4-6h）。

2、取菌液1.5置于离心管中，以5000冷冻离心1，弃上清液

3、加190 悬浮沉淀，并加10 10,摇匀直至溶液变粘稠

4、加入1蛋白酶K（20），混匀，37℃保温1小时。

5、加30 5 ,混匀。

6、加30 溶液，混匀，65℃保温20

7、加入300酚/氯仿/异戊醇抽提（25：24:1），5000离心10

8、取上清液，加入300氯仿/异戊醇（24:1）抽提，5000离心10

9、取上清液，加入300的异丙醇，颠倒混匀，室温下静止10，沉淀，5000离心10

10、加500 70%乙醇洗沉淀，5000离心10

11、弃上清液，待酒精挥发尽后加30溶解

12、溶解于20 中，-20℃保存。

二、试剂盒法提取大肠杆菌基因组。

细菌基因组提取试剂盒：

1、细菌基因组提取试剂盒

302-02 50次 420元

2、细菌基因组小量纯化试剂盒

810A 50 650元

3、细菌基因组提取试剂盒

2411-01 50次 423元

2411-02 250次 1798元

4、细菌基因组提取试剂盒

12S1 50次 400元

12M1 100次 750元

5、细菌基因组提取试剂盒

D3350-00 5 210元

D3350-01 50 980 元

D3350-02 200 3350元

荧光定量试验（标准曲线法）

定量实验是一种实时实验，用于在聚合酶链反应() 的每个扩增循环期间测定靶核苷酸序列（靶）数量。其中靶可以是、或。

【实验原理】

在实时定量实验中，反应是在产物的扩增达到固定荧光水平时的循环期间时间点来描述的，而不是在固定循环次数后累积的产物最终数量来描述。扩增曲线以图形形式显示在执行的循环次数中检测到的荧光。在的最初几次循环中，荧光信号没有明显变化。该预定义的循环范围称为基线。首先，软件通过计算归一化报告荧光信号强度（与基线循环相对应的值）的数学趋势，生成一个基线简化扩增曲线。然后，算法将搜索扩增曲线上基线校准后归一化报告荧光信号强度（[∆] 值）与阈值交叉的点。∆值与阈值交叉的分数循环定义为。

一、试验设计

使用软件中的（设计导向）创建新实验

1、定义实验属性

在（实验属性）屏幕上，输入实验的标识信息，然后选择要设计的实验类型。

1）（实验名称）。

2）（条码），然后输入您的反应板上的条码。（可不填）

3）（用户名）。

4）（注释）。（可不填）

5）选择（定量）实验类型

6）> （下一步）

2、定义方法和材料

在& （方法和材料）屏幕上，选择用于实验的定量方法、试剂、升降温速度和模板。

1）将（标准曲线）选为定量方法。

将（标准曲线）选为定量方法。标准曲线实验确定样本中靶序列的绝对量。从已知量的稀释序列中构建的标准曲线用于归档结果。当设置反应板时，标准曲线方法需要靶、标准品和样本。

用于标准曲线实验的反应包括以下组分：

• 样本－其中靶数量未知的样本。

• 标准品－数量已知的样本。

• 标准品稀释序列－一组用于构建标准曲线的标准品稀释液（例如，1:2、1:4、 1:8、 1:16、 1:32）。

• 重复数－含有相同组分和量的相同反应数。

• 阴性对照－含有水或缓冲液的样本，不含模板；也称为“无模板对照

()”。阴性对照应不会扩增。

2）为试剂选择 ® （试剂）（包括两个引物一个探针）。

–如果使用试剂以检测扩增并定量样本中靶的数量，则选择® （试剂）。试剂包括两个引物和一个® 探针。引物设计用于扩增靶。探针设计用于杂交靶，并在扩增靶时产生荧光信号。

切记！不建议将染料随系统用作荧光报告基团或淬火基团。

–如果使用试剂以检测扩增并定量样本中靶的数量，则选择® （试剂）。试剂包括两个引物和染料。引物设计用于扩增靶。染料可在结合到双链时产生荧光信号。染料通常是添加到反应的母液的一部分。如果使用染料：选择（包括解链曲线）以执行扩增靶的解链曲线分析。