大肠杆菌基因组测序
30株大肠杆菌的泛基因组学特征分析
了３ ０株 已经 完成测 序 的大肠杆 菌 的基 因、基 因组 成及其 进 化特征 ， 结果 表 明核 心基 因只 占 每株 大肠 杆菌全 据 部 基 因数 目的 ５％左右 ，而平均 每个 菌株 有 １６ 特 有基 因， 果表 明 随着 更 多大肠 杆菌 菌株 的基 因组被 测序 ， ０ ４个 结
将 会不间基 因的保 守性 与基 因的 ＧＣ含 量 以及选 择压 力
之 间的关系 ， 现越保 守 的基 因其 Ｇ 含 量 变化 范围越 窄，同 时在 进化 中受 到 的选择压 力也越 大 。这 些结果 将 发 Ｃ 有 助 于深 入 了解 大肠 杆 菌基 因组 的进 化特 征及 其 基 因组 成 的动 态 变化 ， 为 预 防和控 制 由致 病性 大肠杆 菌 ５ 并 ｌ
Ｇｕ ｎ ｚ ｏ ０ ０１ Ｃｈｉ ａ ａ ｇ ｈ ｕ ５１ ３ ， ｎ；
２ Ｇｒｄ ａｅＵ ｉ ｒｉ ｈ ｈｎｓ ｃ ｄｍ ｃｅ ｃｓＢｅ＇ｇ １０ ４ ， ｈｎ ． ａ ｕ ｔ ｎｖ ｓｔｏ ｅＣ ｉｅｅ ａ ｅ ｙｏ ｉ ｅ， ｏｎ ０ ０ ９ Ｃ ｉａ ｅ ｙ ｆｔ Ａ ｆＳ ｎ ｉ
Ａｂｓ ｒ ｃ ： Ａ ａ — ｅ ｏ ｅｄ ｓ ｒ ｅ ｈ ｕ ｌｃ ｍｐｅ ｎ ｆｇ ｎ ｓｉ ｐ ｃｅ． ｔｉ ｕ ｅｓｔｏ ｌ ｔｅｇ ｎ ｓｉ ｌ ｔｅ ｔａ ｔ ｐ ｎ ｇ ｎ ｍ ｅ ｃｉ ｓｔｅ ｆｌ ｏ ｌｍｅ ｔ ｅ ｅ ｎ ｓ ｅ ｉｓ Ｉ ｓａ ｓｐ ｒｅ ｆａｌ ｈ ｅ ｅ ｎ ａｌ ｈ ｂ ｏ
ｉ ｄ ｖ ｄ ａ ｓｏ ｅ ｉ ｓ ｗｈ ｃ ｏ ｏ ｅ ｆ ｃ ｒ ｅ ｏ ’ ｏ ｔ ｉ ｉ ｇ ｇ ｎ ｓｐ ｅ ｅ ｔｉ ｌ ｉ ｄ ｖ ｄ ａｓ ａ ｄ ａ‘ ｉｐ ｎ ａ ｎ ｉ ｉ ｕ ｌ ｆａｓ ｃ ｅ ， ｉ ｈ ｉ ｃ ｍｐ ｓ ｄ ｏ ｏ ｅｇ ｎ ｍｅ ｃ ｎ ａｎ ｎ ｅ ｅ ｒ ｓ ｎ ａ ｌ ｎ ｉ ｉ ｕ ｌ， ｎ ｄ ｓ ｅ ｓ － ｐ ｓ ａ‘ ｎ ｂ ｅ ｇ ｎ ｍｅ ｃ ｎ ａｎ ｎ ｅ ｅ ｒ ｓ ｎ ｎ ｙ ｉ ｏ ｎ ｉ ｉｕ ｌ ｎ ｎ ｉ ｉ ｕ ｌｓ ｅ ｉ ｃ ｇ ｎ ｓ Ｆ ｏ ｐ ｎ ｇ ｎ ｍｅ ｓｇ ｔ ３ ｌ ｅ ｏ ’ ｏ ｔ ｉ ｉ ｇ ｇ ｎ ｓｐ ｅ ｅ ｔｏ ｌ ｓ ｍｅ ｉ ｄ ｖ ｄ ａ ｓａ ｄ ｉ ｄ ｖ ｄ ａ —ｐ ｃ ｆ ｅ ｅ ． ｒ ｍ ａ － ｅ ｏ ｉ ｈ ， ０ ｎ ｉ ｉ ｓ ｅ ｅ ｏ ｓｆ ｍ ｃ ｅ ｉｈ ａ ｃ ｌ ｗｅ ｅｅ ｌ ｙ ｄ ｔ ｎ ｌｚ ｈ ｉ ｅ ｅ ａ ｄ ｇ ｎ ｍ ｏ ｏ ｉ ｏ ｓａ ｄ ｅ ａｕ ｔ ｆ ｉｈ ｄ ｇ ｎ ｍｅ ｏ Ｅｓ ｈ ｒｃ ｉ ｏ ｉ ｒ ｍｐ ｏ ｅ ｏ ａ ａｙ ｅｔ ｅｒｇ ｎ ｎ ｅ ｏ ｅｃ ｍｐ ｓｔ ｎ ｎ ｖ ｌ ａｉ ｎ ｉ ｎ ｒ ｉ ｏ ｎ ｔ ｉ ｔ ｄ ． ｈ ｅ ｕ ｔ ｉ ｄ ｃ ｔ ｄ ｔ ａ ｅ ｃ ｒ ｅ ｅ ｃ ｏ ｎ ｅ ｏ ｂ ｕ ０ ｏ ｅ ｔｔ ｌ ｕ ｅ ｆｇ ｎ ｓ ｗｈ ｌ ｂ ｕ ４ ｈ ｓｓ ｙ Ｔ ｅｒ ｓ ｌ ｎ ｉ ａｅ ｔ ｈ ｏ ｅｇ ｎ ｓａ ｃ ｕ ｔ ｄ ｆ ｒａ ｏ ｔ５ ％ ｆｔ ａ ｍｂ ｒ ｅ ｅ ， ｉ ａ ｏ ｔ１ ６ ｕ ｓ ｈ ｔ ｈ ｏ ｎ ｏ ｅ ｓｒ ｉ —ｐ ｃ ｆ ｅ ｅ ｘ ｓｅ ｎ ｔ ｅ ｅ ｃ ｔａｎ ｔ ｓ ｄ ｈ ａａ ｓ ｇ ｅ ｔ ｈ ｔｔ ｅ Ｅ ｏ ｉｐ ｎ ｇ ｎ ｍｅ ｉ ａ ｔ ｎ ｎ ｑ ｅ ｔａｎ ｓ ｅ ｉ ｃ ｇ ｎ ｓ ｅ ｉｔ ｄ ｉ ｈ ａ ｈ ｓ ｉ ｅ ｔ ．Ｔ ｅ ｄ ｔ ｕ ｇ ｓｓｔ ａ ｈ ｃ ｌ ａ — ｅ ｏ ｓｖ ｓ．ａ ｄ ｕ ｉ ｕ ｉ ｒ ｅ
实验一 大肠杆菌基因组提取
实验一大肠杆菌基因组提取简介大肠杆菌(Escherichia coli)是一种常见的肠道菌，其基因组结构简单，可以用于实验室中的基因工程。
本实验将介绍如何从大肠杆菌中提取基因组DNA，并进行后续的测序和分析。
材料- 大肠杆菌菌株- SDS（1%）- NaCl(5M)- EDTA(0.5M)- 三氯乙酸(CTAB)细胞裂解缓冲液（含Tris-HCl,pH8.0、NaCl、CTAB和EDTA）- 氯仿- 异丙醇- TE缓冲液（pH8.0）- 75%酒精- 100%酒精步骤1. 建立大肠杆菌沙门氏菌联合培养通过将大肠杆菌菌株与沙门氏菌菌株联合培养，可以使大肠杆菌更具韧性，可以在更苛刻的条件下生存。
因此，在进行基因组提取前，可以将大肠杆菌与沙门氏菌一同培养。
具体步骤如下：1.1 从大肠杆菌与沙门氏菌培养基中选择处于对数生长期的菌株；1.2 筛选出同步菌种进行接吻结合；1.3 将大肠杆菌沙门氏菌接种于 LB 培养基中，进行生长，收集状态良好的菌落。
2. 细胞裂解收集培养的大肠菌细胞，经过洗涤后，加入细胞裂解缓冲液中。
在催化剂SDS的作用下，细胞质膜溶解，使DNA释放到缓冲液中。
2.1 用洗液洗细菌达到OD600为0.6时离心6000g， 10分钟；2.2 将上清液倒掉，沉淀用NaCl水洗涤后，离心6000g， 10分钟；2.3 将沉淀重悬于 Tris-HCl 缓冲液中，加入 SDS 、 NaCl和 EDTA，并在65℃下进行快速震荡混匀，直到完全均匀混合。
3. 蛋白酶和RNA酶的处理使用丙酮和氯仿的混合物沉淀DNA，过滤掉蛋白酶和RNA酶。
3.1 向上清液中加入等体积异丙醇，避免产生气泡，盖紧座析管盖，冰上静置10min 。
3.2 离心12000g 10min，弃取上清层。
将沉淀重悬于 TE 缓冲液中，加入20ug/ml RNase 处理，65℃将体系涡旋5min；3.3 加入等体积氯仿，振荡10min，然后离心12000g 10min ，弃取上清液。
牛源乳腺致病性大肠杆菌JL05全基因测序及毒力和耐药基因分析
中国预防兽医学报Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine第42卷第12期2020年12月V ol.42No.12Dec.2020doi ：10.3969/j.issn.1008-0589.202010002牛源乳腺致病性大肠杆菌JL05全基因测序及毒力和耐药基因分析曲星霖1，肖丹2，吴健2，马晓媛3，白翠3，王妍1*，王楠3*（1.延边大学农学院，吉林延吉133000；2.吉林省农业科学院，吉林长春130033；3.吉林省动物疫病预防控制中心，吉林长春130062）摘要：为研究一株从奶牛乳样中分离到的乳腺致病性大肠杆菌（MPEC ）JL05的进化分群情况、耐药表型和耐药基因之间的相关性、毒力因子分布情况，本研究采用PCR 法、微量肉汤稀释法和高通量测序法对其进化分群、16种抗菌药物的最小抑菌浓度（MIC ）、毒力基因、耐药基因的检测和分析。
PCR 检测结果表明，MPEC JL05属于B2群。
MIC 检测结果表明，MPEC JL05除对磺胺异恶唑中介、对呋喃妥因敏感外，对β-内酰胺、头孢菌素、氨基糖苷、抗叶酸、喹诺酮、大环内酯、四环素、苯丙醇类等8类14种抗菌药物均耐药。
全基因测序结果表明，MPEC JL05编码基因中存在MPEC 特有的fec 基因座；VFDB 数据库分析表明MPEC JL05具有黏附、侵袭、转运、铁摄取、分泌系统、细菌毒素6类80个毒力基因，并发现了耶尔森菌强毒力岛（HPI ）；CARD 数据库分析表明MPEC JL05菌株具有参与抗生素外排、抗生素失活、抗生素靶点改变、降低对抗生素的渗透性等4类耐药机制的53个耐药基因，且在质粒的耐药基因上下游发现了多个转座酶及整合酶基因。
本研究揭示了MPEC JL05复杂的进化史，为更全面的认识MPEC 基因组特征、致病力及耐药传播机制提供了参考。
关键词：大肠杆菌；进化分群；全基因组测序；耐药基因；毒力基因中图分类号：S852.61文献标识码：A文章编号：1008-0589（2020）12-1220-06Whole genome sequencing reveals the distribution of resistance and virulence genes of mammary pathogenicEscherichia coli JL05from bovineQU Xing-lin 1,XIAO Dan 2,WU Jian 2,MA Xiao-yuan 3,BAI Cui 3,WANG Yan 1*,WANG Nan 3*(1.Agricultural College of Yanbian University,Yanij 133000,China;2.Jilin Academy of Agricultural Sciences,Changchun 130033,China;3.Animal Disease Control Center of Jilin Provincal,Changchun 130062,China)Abstract :The aim of this study was to analyze the phylogenetic groups,virulence factor distribution,and the correlation between drug resistance phenotype and resistance genes of Escherichia coli JL05isolated from milk samples of dairy cows.The PCR,microdilution method and high-throughput sequencing were used to investigate the phylogenetic groups,MIC of 16antibacterial drugs,virulence genes and resistance genes.PCR results showed that E.coli JL05belonged to group B2.MIC results showed that E.coli JL05was sensitive to sulfamethoxazole and nitrofurantoin,but resistant to 14of Class 8antibacterial drugs,including β-lactam,cephalosporin,aminoglycoside,folic acid,quinolone,macrolide,tetracycline and phenylpropanol.The results收稿日期：2020-10-11基金项目：吉林省科技发展计划项目（20180623033TC ）作者简介：曲星霖（1997-），男，吉林长春人，硕士研究生，主要从事分子遗传研究.*通信作者：E-mail ：*****************；***************Corresponding author曲星霖，等.牛源乳腺致病性大肠杆菌JL05全基因测序及毒力和耐药基因分析第12期乳腺致病性大肠杆菌（Mammary pathogenic E.coli，MPEC）是奶牛乳房内感染（Intramammary infection，IMI）的主要病原体，因存在fec基因座可使细菌从柠檬酸盐中捕获铁而具有在牛乳腺中定植的能力[1]，其导致的急性乳腺炎不仅影响奶牛产奶量，同时也影响牛奶品质，增加了治疗费用，给奶牛业造成了严重的经济损失[2]。
比较基因组学鉴定大肠杆菌致病因子的教学分析
比较基因组学鉴定大肠杆菌致病因子的教学分析比较基因组学是一门研究不同物种之间基因组差异的学科，通过比较基因组分析，可以深入了解不同物种在遗传层面的差异，从而揭示各种生物的遗传特性和进化规律。
在微生物领域，比较基因组学被广泛应用于致病菌的研究，通过对比病原微生物与非致病微生物的基因组差异，可以揭示其致病机制和病原性因子，有助于深入了解病原微生物的致病机理，为防控和治疗提供重要的科学依据。
本教学分析将以大肠杆菌为例，介绍如何利用比较基因组学鉴定大肠杆菌的致病因子。
一、大肠杆菌简介大肠杆菌（Escherichia coli），是一种革兰氏阴性细菌，属于肠杆菌科，是人和动物肠道中的常见菌群之一。
大肠杆菌广泛存在于自然界中，既是人体的共生菌，又是一种重要的病原微生物。
其中某些菌株具有致病性，能够引起人畜的肠道感染，甚至引发严重的肠道疾病，如腹泻、肠炎等。
对大肠杆菌的致病性进行深入研究，对于预防和控制相关疾病具有重要意义。
二、大肠杆菌的致病因子大肠杆菌的致病性主要由其特有的毒力因子和致病因子所决定，其中的毒力因子主要包括毒素、细菌毛和附着因子等。
毒素是大肠杆菌最主要的毒力因子，包括肠毒素、血清素、肠毒素和淀粉酶等，它们能够对宿主细胞产生毒性作用，引起细胞损伤和炎症反应。
细菌毛是大肠杆菌附着和入侵宿主细胞的重要结构，它能够使细菌更容易附着于宿主细胞表面，引发感染。
附着因子是大肠杆菌在宿主肠道黏膜上附着和定植的重要因子，通过附着因子，大肠杆菌能够有效地抵抗肠道黏膜的清洁作用，长时间存在于肠道内，引发感染和疾病。
三、基因组学鉴定大肠杆菌的致病因子利用比较基因组学分析，可以揭示大肠杆菌致病因子的基因组遗传特征，为深入研究其致病机制提供重要的科学依据。
比较基因组学鉴定大肠杆菌的致病因子主要包括以下几个步骤：1. 基因组序列比对：利用测序技术对不同菌株的基因组进行测序并获得其基因序列信息；然后，将所获得的基因组序列进行比对分析，从而找出菌株间的差异和共同点。
大肠杆菌中的基因组结构和功能研究
大肠杆菌中的基因组结构和功能研究大肠杆菌是一种广泛存在于环境中和人体肠道内的细菌。
它的基因组结构和功能一直是分子生物学和微生物学研究的热门领域。
随着基因测序技术的发展，我们对大肠杆菌的基因组结构和功能的认识也越来越深入。
基因组结构大肠杆菌的基因组属于革兰氏阴性菌，它是一个圆形的DNA分子，大约有4.6兆碱基对。
它的基因组包含了大约4500个基因，其中有许多基因是与宿主细胞的生长和代谢相关的。
大肠杆菌的基因组还具有多个质粒，这些质粒通常含有一些与环境适应和抗药性相关的基因。
大肠杆菌的基因组中还有许多重复序列和转移元件。
这些序列包括了IS元件、转座子、整合子等等。
它们都能够影响基因表达和基因组稳定性，并在细菌进化中具有重要的作用。
功能研究大肠杆菌中的基因组结构和功能研究主要包括以下几个方面。
基因功能注释随着大肠杆菌基因组测序的完成，相应的基因功能注释也日益完善。
目前已有大量的基因在数据库中被标注了功能和注释信息，这对于后续的基因调控、表达和功能研究提供了重要的数据支持。
转录调控在大肠杆菌中，转录调控是一种重要的基因调控机制。
研究者发现大肠杆菌基因组中存在大约350个调控因子。
这些调控因子通常能够识别特定的DNA序列，在特定条件下调控相应基因的表达。
研究发现，其中的一些调控因子还具有重要的作用，如lac重pressor、trp重pressor等。
新基因鉴定随着转录组和蛋白质组学技术的发展，大肠杆菌中的新基因鉴定越来越重要。
许多研究者利用这些技术，鉴定出了大量的新基因，其中包括了一些与代谢途径、抗药性和环境适应有关的基因。
基因组稳定性在细菌进化中，基因组稳定性是非常重要的。
大肠杆菌中的基因组稳定性与它的保护性随机DNA修复系统、R-质粒的结构和核苷酸代谢等多个方面有关。
研究人员对这些方面进行了深入探究，为我们对细菌基因组稳定性的了解提供了一定程度的帮助。
结论大肠杆菌是一个重要的微生物模型生物，它的基因组结构和功能一直是分子生物学和微生物学研究的热门领域。
细菌基因组测序方法
细菌基因组测序方法
细菌基因组测序方法主要有以下几种：
1. 整体基因组测序（Whole Genome Sequencing，WGS）：将
细菌的整个基因组进行测序，并通过比对参考基因组或组装建立一个完整的基因组序列。
2. 目标区域测序（Targeted Sequencing，TS）：针对特定基因、基因组区域或有意义的变异位点进行测序。
3. 细胞单体测序（Single-cell Sequencing，SCS）：将细胞单
体进行测序，通过技术手段将单个细胞的DNA扩增到足够浓
度后进行测序。
4. 转录组测序（RNA Sequencing，RNA-Seq）：将细菌转录产物测序，包括mRNA、ncRNA等，可以了解细菌的转录水平
和转录后调控。
5. 甲基化测序（Methylation Sequencing，Methyl-Seq）：对细
菌基因组进行甲基化修饰位点的检测以获得表观遗传信息。
6. 大肠杆菌的测序方法还包括平滑野百合花青素基因组测序（PacBio）和人工合成DNA 和4D核磁共振测序。
第五章基因组测序技术(共118张PPT)
断裂产物分 别在4个泳 道电泳
G G+A T+C C
化学法测序实例
哌啶
改进的特异化学切割反应
1.基本原理
与链终止法测序原理相同,只是用不同 的荧光色彩标记ddNTP,如ddATP标记红 色荧光,ddCTP标记蓝色荧光, ddGTP标 记黄色荧光, ddTTP标记绿色荧光.由于 每种ddNTP带有各自特定的荧光颜色,而 简化为由1个泳道同时判读4种碱基.
②该酶能够用2‘，3’--双脱氧核苷三磷酸作底物并将 其聚合到新生寡核苷酸链的3‘-末端，从而终止其延 伸反应。
在DNA测序反应中，加入模板DNA，引物（特异 性引物），DNA聚合酶，dA，dT，dG，dC和一 种ddNTP。常用Klenow大片段，无5'→3'外切酶 活性。
制备单链模板
A 克隆于质粒中DNA→用碱或热变性 B M13克隆单链DNA C 噬粒克隆DNA D PCR产生单链DNA
C 参考人类基因组图,特别是大量的STS位标作为基点,进行
序列组装，排成重叠克隆群.
基于克隆群(contig-based)
鸟枪法策略
指导测序策略
遗传、物理图谱
人们对感兴趣的基因或与疾病相关的 基因优先测序.
如:人类主要组织相容性复合区位于第6号 染色体,与人类免疫系统有关，因而优先 测序.
EST是一种重要的基因组图分子标记,以EST为探针很 容易从 cDNA中筛选全基因,又可从BAC克隆中找到其
2. 人类基因组草图的完成
2000年6月26日是人类 上值得纪念的一天。人 类基因组的工作草图已 经绘制完毕并于这天向 全世界公布。最终完成 图要求测序所用的克隆 能忠实地代表常染色体 的基因组结构，序列错 误率低于万分之一。
大肠杆菌中的基因表达
PL 和 PR 表达系统
宿主菌中没有 cI 基因产物，PL、PR 启动子的高强度直接转录，带有PL
或 PR 启动子的表达载体在普通大肠杆菌中相当不稳定。
对宿主菌的要求
用溶源化 l 噬菌体的大肠杆菌作 PL、PR 启动子表达载体的宿主菌
N4830-1，POP2136 等菌株已经溶源化 cI 857(ts) l 噬菌体， 可用作表达外源基因时的宿主菌。 把 cI 857(ts) 基因组装在表达载体上 宿主菌选择范围更大
cAMP激活CAP，CAP–cAMP复合物与 lac 操纵子上专一位点结合
后，能促进 RNA 聚合酶与 –35、–10 序列的结合，进而促进 Plac
介导的转录。
基因工程中使用的 lac 启动子均为抗葡萄糖代谢阻遏的突变型，即 Plac UV5
cAMP
CAP lacI
RNRANA 聚聚合合酶酶
Plac
二、大肠肝菌中的基因表达
2. 影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素
（3）表达产物的稳定性： 组建融合蛋白； 利用信号肽； 特异性突变； 位点特异突变，改变二硫键位置； 宿主蛋白酶缺陷。
二、大肠肝菌中的基因表达
2. 影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素
（4）细胞的代谢负荷： 细胞大量生长时，抑制外源基因的表达； 宿主细胞的生长与重组质粒的复制分开；
二、大肠肝菌中的基因表达
2. 影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素
（1）外源基因的拷贝数：与载体在宿主中的拷贝数直接相关。 （2）外源基因的表达效率：启动子的强弱，SD序列和ATG的间距等。
A、启动子的强弱：目的基因插入表达载体启动子的下游，可增加
基因的表达。lac、trp、 tac、bla。
B、核糖体结合位点的有效性 C、SD与ATG的间距：影响非融合蛋白的合成水平 D、密码子组成：设计引物或合成基因时选择大肠杆菌“偏爱”的密码
大肠杆菌的基因组大小是多少bp
问答题：1、大肠杆菌的基因组大小是多少bp？原核生物复制叉的速度是多少？正常情况下大肠杆菌是多长时间繁殖一代？为什么在营养丰富的情况下20min繁殖一代？4.6X106 bp；1kb/s; 40min; 上一次复制没有完成下一代就开始了2、真核细胞与原核细胞在基因转录、翻译及DNA的空间结构方面存在以下几个方面的差异①在真核细胞中，一条成熟的mRNA链只能翻译出一条多肽链，很少存在原核生物中常见的多基因操纵子形式②真核细胞DNA与组蛋白和大量非组蛋白相结合，只有一小部分DNA是裸露的。
③高等真核细胞DNA中很大部分是不转录的，大部分真核细胞的基因中间还存在不被翻译的内含子④真核生物能够有序地根据生长发育阶段的需要进行DNA片段重排，还能在需要时增加细胞内某些基因的拷贝数。
⑤在真核生物中，基因转录的调节区相对较大，它们可能远离启动子达几百个甚至上千个碱基对，这些调节区一般通过改变整个所控制基因5’上游区DNA构型来影响它与RNA聚合酶的结合能力。
在原核生物中，转录的调节区都很小，大都位于启动子上游不远处，调控蛋白结合到调节位点上可直接促进或抑制RNA聚合酶与它的结合⑥真核生物的RNA在细胞核中合成，只有经转运穿过核膜，到达细胞质后，才能被翻译成蛋白质，原核生物中不存在这样严格的空间间隔。
⑦许多真核生物的基因只有经过复杂的成熟和剪接过程，才能顺利地翻译成蛋白质。
简答题1、DNA复制的保真性至少要依赖三种机制1. 遵守严格的碱基配对规律；2. 聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能；3. 复制出错时DNA-pol的即时校读功能2、表观遗传学的特点1.可遗传的，即这类改变通过有丝分裂或减数分裂，能在细胞或个体世代间遗传；2.可逆性的基因表达调节，也有较少的学者描述为基因活性或功能的改变；3.没有DNA序列的改变或不能用DNA序列变化来解释。
3、中心法则（图示）4、遗传印迹的特点：基因组印迹依靠单亲传递某种性状的遗传信息，被印迹的基因会随着其来自父源或母源而表现不同，即源自双亲的两个等位基因中一个不表达或表达很弱。
细菌基因序列研究报告
细菌基因序列研究报告细菌基因序列研究报告细菌基因序列研究报告是利用高通量测序技术对细菌基因组进行测序和分析的报告。
本报告以大肠杆菌（Escherichia coli）为研究对象，通过对其基因组序列的测定和分析，揭示了细菌基因组的结构、功能和演化等方面的信息。
一、研究目的本研究的目的是通过对大肠杆菌基因组的测序和分析，探索细菌基因组的特征和功能，为进一步的细菌基因研究提供参考和依据。
二、实验方法1. 样本处理：从培养的大肠杆菌中提取基因组DNA，并通过PCR扩增得到足够数量的DNA样本。
2. 基因组测序：采用Illumina高通量测序平台对样本进行测序，得到海量的短读序列。
3. 数据处理和拼接：使用适当的软件对测序数据进行预处理、质控和拼接，得到完整的基因组序列。
4. 基因组注释和分析：将得到的基因组序列与已知数据库进行比对和注释，如基因预测、基因功能注释、基因家族分类等。
5. 演化分析：通过多序列比对和系统发育树构建等方法，分析大肠杆菌与其他相关物种之间的演化关系。
三、结果与讨论1. 基因组结构：通过测序和拼接，我们得到了大肠杆菌的完整基因组序列，并发现其具有单个的圆形染色体。
基因组大小为4.6兆碱基对，含有大约4000个基因。
2. 基因功能和注释：通过对基因组进行注释和功能预测，我们发现其中包含多个致病性因子和抗生素抗性基因。
此外，还发现了许多调控基因和代谢酶基因，这些基因对大肠杆菌的生长和适应环境起着重要作用。
3. 演化关系：通过与其他相关物种进行比较和分析，我们发现大肠杆菌与其他肠道细菌存在较高的相似性，这可能说明它们具有共同的起源和进化历史。
综上所述，本研究通过细菌基因序列的测定和分析，揭示了大肠杆菌基因组的结构、功能和演化等方面的信息。
这对于进一步理解细菌基因组的特征和功能具有重要的意义，也为生物医学研究和药物开发提供了新的线索与依据。
大肠杆菌的基因型-概述说明以及解释
大肠杆菌的基因型-概述说明以及解释1.引言1.1 概述大肠杆菌是一种常见的革兰氏阴性杆菌，属于肠道菌群中的重要成员。
它在自然界和人体内广泛存在，并且具有广泛的基因型多样性。
这使得大肠杆菌成为了微生物遗传学和进化生物学领域的研究模型。
在大肠杆菌中，基因型是指该菌株拥有的基因组合和基因的分布情况。
大肠杆菌的基因型可以通过不同的方法进行分类和鉴定。
目前主要的分类方法包括单核苷酸多态性分析、基因片段分析和全基因组测序等。
通过这些方法，我们可以更全面地了解大肠杆菌的基因型组成和种群结构。
大肠杆菌的基因型在其功能和特点方面具有重要意义。
大肠杆菌是一种典型的益生菌，它在人体内具有多种有益作用，包括帮助消化吸收、维持肠道稳定性和参与免疫调节等。
不同基因型的大肠杆菌可能具有不同的功能特点，比如某些基因型可能携带耐药基因或致病因子，导致感染和疾病的发生。
因此，对大肠杆菌基因型的研究有助于我们深入了解其功能机制和生态适应能力。
总之，大肠杆菌作为一种常见的菌株，其基因型具有多样性和重要性。
通过研究大肠杆菌的基因型，我们可以深入探索其功能特点和生态适应能力，进一步促进微生物遗传学和进化生物学的研究。
未来，我们可以通过结合多样的研究方法和技术，进一步挖掘和解析大肠杆菌基因型的奥秘，并探索其在人体健康和疾病中的作用。
文章结构是指文章部分之间的逻辑关系和组织，它有助于读者理解文章的内容和思路。
本文的结构如下：1. 引言1.1 概述1.2 文章结构1.3 目的2. 正文2.1 大肠杆菌的基因型分类2.2 大肠杆菌基因型的功能和特点3. 结论3.1 大肠杆菌基因型的重要性3.2 未来研究的方向文章结构部分是为了描述本文的组织结构，它有助于读者了解文章的内容安排和逻辑关系。
在本文中，我们首先介绍引言部分，包括概述、文章结构和目的。
在概述中，我们简要介绍了大肠杆菌的基因型。
在文章结构中，我们明确了本文的结构和章节安排，帮助读者理解文章的整体框架。
基因工程实验
实验一大肠杆菌基因组DNA的提取及电泳鉴定一、琼脂糖凝胶电泳注意的问题：1. 缓冲系统：在没有离子存在时，电导率最小，DNA不迁移，或迁移极慢，在高离子强度的缓冲液中，电导很高并产热，可能导致DNA变性，因此应注意缓冲液的使用是否正确。
长时间高压电泳时，常更新缓冲液或在两槽间进行缓冲液的循环是可取的。
2. 琼脂糖：不同厂家、不同批号的琼脂糖，其杂质含量不同，影响DNA的迁移及荧光背景的强度，应有选择地使用。
3. 凝胶的制备：凝胶中所加缓冲液应与电泳槽中的相一致，溶解的凝胶应及时倒入板中，避免倒入前凝固结块。
倒入板中的凝胶应避免出现气泡，影响电泳结果。
4. 样品加入量：一般情况下，0.5cm宽的梳子可加0.5ug的DNA量，加样量的多少依据加样孔的大小及DNA中片段的数量和大小而定，过多的量会造成加样孔超载，从而导致拖尾和弥散，对于较大的DNA此现象更明显。
5. 电泳系统的变化会影响DNA的迁移，加入DNA标准参照物进行判定是必要的。
6. DNA样品中盐浓度会影响DNA的迁移率，平行对照样品应使用同样的缓冲条件以消除这种影响。
7. DNA迁移率取决于琼脂糖凝胶的浓度，迁移分子的形状及大小。
采用不同浓度的凝胶有可能分辨范围广泛的DNA分子，制备琼脂糖凝胶可根据DNA分子的范围来决定凝胶的浓度。
小片段的DNA电泳应采用聚丙烯酰胺凝胶电泳以提高分辨率。
二、如果提取的DNA中含有蛋白质和RNA污染,应如何解决?蛋白污染可以考虑用酚氯仿多抽提几次,记得吸上清的时候小心点,宁可浪费也别吸到界面.一般后续还需要用氯仿/异戊醇抽提来去除酚.这样基本蛋白污染就可以去干净.实在不行,抽提一次后,就用蛋白酶K消化30min,再抽提.如果DNA多,RNA污染就添加RNase A消化,你可以中途取少量跑胶检测,RNA去干净了再抽提,再沉淀DNA.三、如果提取的DNA产量较低，分析原因并提出解决办法。
1）样本材料老化或反复动容导致DNA含量下降。
大肠杆菌的分子生物学研究
大肠杆菌的分子生物学研究大肠杆菌是一种常见的肠道细菌，也是一种广泛应用的模式生物。
在分子生物学研究中，大肠杆菌常常被用作基因工程、蛋白质表达、靶标鉴定等方面的实验材料。
本文将从大肠杆菌分子生物学的视角出发，讲解大肠杆菌相关研究的现状和未来发展方向。
一、大肠杆菌基因组分析对大肠杆菌基因组的分析是分子生物学研究的重要方向之一。
大肠杆菌的基因组长度约为5.5Mb，含有4140个基因。
这些基因可以分为两类：编码蛋白质的基因和编码RNA的基因。
编码蛋白质的基因中，有大约20%的基因是没有已知的功能的，这也是当前研究的重点之一。
大肠杆菌基因组的分析可以通过多种方法实现，包括测序、比较基因组学和功能基因组学研究等。
测序技术是目前最常用的方法，可以得到大肠杆菌基因组的序列信息。
比较基因组学研究则是通过比对大肠杆菌与其他物种的基因组序列，找出它们之间的相同点和不同点，从而了解它们的进化关系。
与之相对应的是功能基因组学研究，它主要关注在基因组层面揭示组织和细胞的功能，包括基因表达分析、蛋白质互作网络研究、代谢通路分析等等。
二、大肠杆菌基因工程研究大肠杆菌基因工程研究是分子生物学研究的另一大方向。
大肠杆菌可以通过基因工程方式来改变其基因结构，从而实现一系列人工合成目的。
例如，利用大肠杆菌来表达蛋白质，就是目前最常用的方法。
首先在大肠杆菌中克隆目标基因，然后将其引入大肠杆菌，最终通过大肠杆菌自身的蛋白质合成机制来合成目标蛋白质。
在基因工程研究方面，重要的工具是质粒。
质粒是一种小而独立的DNA分子，自己携带一些基因，以此与大肠杆菌分子结合，将需要改变的DNA分子或遗传信息被“载入”到大肠杆菌中。
质粒大小一般为1-200kb，基因工程中，通常先将目标基因插入质粒中，再将质粒通过易于使用的接种操作引入大肠杆菌菌体中。
这种基因工程技术可被应用于许多生物医学领域或工业制造方案。
三、大肠杆菌蛋白质结构研究大肠杆菌蛋白质结构研究也是目前分子生物学研究的热点之一。
第十四章：大肠杆菌基因工程资料
突变碱基对，其活性比野生型Plac启动子更强，而 且对葡萄糖及分解代谢产物的阻遏作用不敏感，但 仍为受体细胞中的Lac阻遏蛋白阻遏，因此可以用
乳糖或IPTG进行有效诱导。人工构建的Ptac启动子
由于含有lac操作子区域，所以其阻遏诱导性质与
PlacUV5相同。
cI857 控制 PλL ， cI857 阻遏蛋白在 42℃时失
活脱落， PL 便可介导目的基因的表达，但
在大型细菌培养罐中迅速升温很难，故常
使用双质粒的控制系统，用色氨酸间接控
制目的基因表达。
当培养基中缺少色氨酸时，Ptrp启动子打开，CI 阻遏蛋白合成，由Pl启动子介导的外源基因转录 关闭；相反，当色氨酸大量存在时，Ptrp启动子 关闭，CI阻遏蛋白不再合成，Pl启动子开放并激 活外源基因表达。从整体上来看，外源基因虽然 处于Pl启动子控制之下，但却可用色氨酸取代温 度进行诱导表达。
第十四章
大肠杆菌基因工程
第一节、大肠杆菌作为受体菌的特征
一．大肠杆菌表达外源基因的优势 1.全基因组测序，遗传背景清楚 ， 共有4405个开放阅读框架。 2.基因克隆表达系统成熟完善。
3.繁殖迅速，培养简单，操作方便， 遗传稳定。 4.被美国FDA批准为安全的基因工程 受体生物。
5.成本低
二．大肠杆菌表达外源基因的劣势 1.缺乏对真核生物蛋白质的加工系统。 2.内源性蛋白酶易降解空间构象不正 确的异源蛋白。 3.不具备真核生物的蛋白质复性系统。 4.其细胞膜间隙含有大量的内毒素，
构。将这个区域的DNA片段次级克隆在启动子探针
质粒上，测定其所含有启动子的转录活性。
③滤膜结合法分离
原理是双链 DNA 不能与硝酸纤维素薄膜有效结合，而 DNA-
各论中以大肠杆菌为宿主菌的产品中菌种检定项目
各论中以大肠杆菌为宿主菌的产品中菌种检定项目大肠杆菌是一种常见的宿主菌，广泛应用于食品加工、制药和生物工程等领域。
在产品的生产过程中，菌种检定是一个非常重要的环节，可以确保产品的质量和安全性。
本文将通过深入探讨大肠杆菌作为宿主菌的产品中的菌种检定项目，以全面了解该过程的重要性和实施方法。
首先，菌种检定是指通过对产品中的菌种进行鉴定和鉴别，以确定其属于大肠杆菌或其他细菌。
这对于监测产品质量和防止细菌污染起着至关重要的作用。
常见的菌种检定项目包括形态学观察、生理生化特性检测、蛋白质分析和分子生物学鉴定等。
首先，形态学观察是菌种检定的基本项目之一。
通过显微镜观察菌落形态、结构和颜色等特征，可以初步判断菌种属于大肠杆菌还是其他菌种。
大肠杆菌菌落通常呈灰白色，表面呈平坦或隆起状，直径在1-2mm左右。
同时，大肠杆菌的形态呈短杆状或者长杆状，长度约为1-3μm，宽度约为0.5-1μm。
其次，生理生化特性检测也是菌种检定的重要项目。
大肠杆菌具有多种独特的生理生化特性，如革兰氏染色反应阳性，能氧化葡萄糖，产生大量气体，产生酸性环境等。
这些特性可以通过一系列的生化试验来检测和鉴定，如氧化发酵反应、亚硝酸盐还原反应、大肠杆菌鉴定培养基等。
蛋白质分析是菌种检定中的关键项目之一。
通过对菌种中的蛋白质进行分析和鉴定，可以确定其属于大肠杆菌还是其他细菌。
蛋白质分析主要包括两个方面：一是蛋白质电泳，通过蛋白质电泳的分离和检测，可以确定菌种中的蛋白质种类和数量；二是蛋白质鉴定，通过比对菌种蛋白质序列数据库，可以确定菌种的身份。
最后，分子生物学鉴定是菌种检定的最新方法之一。
通过分子生物学技术，可以检测和鉴定菌种的基因组序列，以确定其属于大肠杆菌还是其他细菌。
分子生物学鉴定的方法主要有PCR技术、DNA测序和序列比对等。
这些方法具有高灵敏度、高准确度和高特异性，可以有效地鉴定菌种并防止细菌污染。
总之，菌种检定是以大肠杆菌为宿主菌的产品生产过程中的重要环节。
大肠杆菌基因组DNA的提取及荧光定量PCR试验设计
大肠杆菌基因组DNA的提取及荧光定量PCR试验设计大肠杆菌是一种常见的细菌，其基因组DNA的提取非常重要，可以用于进一步的分子生物学研究。
本文将介绍如何提取大肠杆菌基因组DNA以及如何设计荧光定量PCR试验。
一、大肠杆菌基因组DNA的提取基因组DNA的提取是分子生物学实验的基础步骤之一、下面是一种常规的大肠杆菌基因组DNA的提取方法：1. 培养大肠杆菌：从冻存的大肠杆菌液体培养物中取出1 mL，加入含有适量抗生素（如氨苄青霉素或巴龙霉素）的LB培养基中。
以250 rpm的速度在37℃下培养12-16小时，直到菌体适量生长。
2.收集菌体：离心培养物，将上清液去除，保留细胞沉淀。
3.溶菌：使用适当的溶解液（如0.2MNaOH/1%SDS溶液），彻底悬浮菌体，并在65℃下孵育5分钟。
4.中和反应：向菌液中加入3M的钾酸溶液，通过中和作用将菌体中的DNA中和沉淀出来。
6.洗涤：用70%乙醇洗涤DNA沉淀。
去除乙醇，使菌体中的盐等杂质完全去除。
7. 溶解：用 TE溶液（10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0）或纯水溶解DNA沉淀。
如果需要更高浓度的DNA，可使用低TE溶液（10 mM Tris-HCl, pH 8.0）。
荧光定量PCR（qPCR）是一种通过实时监测PCR反应的荧光强度来定量分析PCR产物的技术。
下面是一种针对大肠杆菌基因组DNA的定量PCR试验设计：试验目的：测定大肠杆菌基因组DNA中一些特定基因的拷贝数。
试验步骤：1.制备PCR反应体系：根据需要测定的基因和引物的特异性设计引物。
将PCR反应体系组分按照以下配方进行调配：- 模板DNA：5 ng-引物（正向和反向）：0.2μM-qPCR反应缓冲液：根据厂家推荐的浓度加入适量-dNTP混合液：0.2mM-热启动酶：根据厂家推荐的浓度加入适量- ddH2O：适量2.设计合适的PCR程序：-预热：95℃，5分钟-循环：95℃，30秒；55℃，30秒；72℃，30秒（重复30-40个循环）-最终延伸步骤：72℃，10分钟-保存在4℃下待用3.实施定量PCR试验：-根据样本中DNA浓度的不同，选择适当的试管和引物。
大肠杆菌表达原理(很好)
E.Coli （CE6）
T7 启动子
目的基因
热诱导
T7 RNA 聚合酶
PL 启动子 T7 RNA 聚合酶基因
cI857
T7 表达系统
转录调控的机理 双质粒系统 一个质粒带有 T7 RNA 聚合酶 基因，另一个质粒带有 T7 启 动子和目的基因
对宿主菌的要求
用溶源化 l 噬菌体的大肠杆菌作 PL、PR 启动子表达载体的宿主菌
N4830-1，POP2136 等菌株已经溶源化 cI 857(ts) l 噬菌体， 可用作表达外源基因时的宿主菌。 把 cI 857(ts) 基因组装在表达载体上 宿主菌选择范围更大
PL 和 PR 表达系统存在的问题
外源基因在大肠杆菌中的表达
外源基因在大肠杆菌中的表达
大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征
大肠杆菌表达外源基因的优势 全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架 基因克隆表达系统成熟完善 繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定 被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物
外源基因在大肠杆菌中的表达
大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征
整合到染色体后，均能使 lac 和 tac 启动子的转录受到温度严紧调控 在较低温度（30℃）时抑制，在较高温度（42℃）时开放。
用乳糖替代 IPTG 诱导 lac 和 tac 启动子的转录 乳糖在 b-半乳糖苷酶作用下生成异乳糖，异乳糖具有诱导剂的作用 这一过程涉及乳糖的转运和转化，其效率受到多种因素的影响和制约 因此乳糖诱导的有效剂量大大高于IPTG。 乳糖本身作为一种碳源可以被大肠杆菌代谢利用，较多的乳糖存在也 会导致菌体生理及生长特性变化。乳糖替代 lPTG 作为诱导剂的研究 要与发酵工艺结合起来，才能显示其良好的前景。
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循环阵列测序—焦磷酸测序
循环阵列测序—碱基读取
Hale Waihona Puke 几种不同生物基因组的测序1) 大肠杆菌基因组测序----图位法 2) 流感嗜血杆菌基因组测序---鸟枪法 3) 果蝇基因组测序---鸟枪法 4) 人类基因组测序---图位法和鸟枪法 4) 拟南芥基因组测序—图位法 5) 水稻基因组测序---图位法和鸟枪法
流感嗜血杆菌基因组鸟枪法测序结果预测
1) 流感嗜血杆菌基因组总长: 1.8 Mb 2) 测序覆盖率计算, P定义为丢失的概率.
P0=e-m, m为覆盖面, 即当量数 若m=1 P0=e-1=0.37 若m=5 P0=e-5=0.0067=0.67% 若m=10 P0=e-10=4.5 x 10-5=0.000045=0.0045%
high signal density, geometric uniformity, strong feature separation, and a size that is small but still resolvable by inexpensive optics.
循环 阵列 测序
富集
与 测序 芯片 制作
基因组测序的策略
1) 随机测序 2) 限定序
随机测序原理
基因组测序的方法
1) 测序的DNA多聚酶; 2) 测序标记; 3) 电泳装置; 4) 测序难点.
测序的DNA多聚酶
目前普遍采用的测序酶为Sequenase, 来自T7噬菌体
序数)=100 bp. 7) 空隙数为:1.25 x 104bp/100 bp=128
测序结果略高于预计结果, 即42个物理间隙和98个顺序间隙.
间隙的类型
测序后将DNA顺序进行组装, 会发现存在不 连续的区段. 它们产生于: 1) 因覆盖率的原因而留下克隆载体自身的限制或DNA顺序特殊 的组成等原因造成某些顺序丢失或未能 克隆, 这类间隙称为物理间隙.
ATP 产 生荧光信号与dNTP 和ATP 的降解等化
学
循环阵列测序--滚环扩增建库 cyclic-array sequencing
测
滚环复制
序
拷贝扩增
文
库
构
建
循环阵列测序-PCR建库
Polymerase colony, or polony,technologies perform multiplex amplification while maintaining spatial clustering of identical amplicons. In emulsion PCR (ePCR), a waterin-oil emulsion permits millions of noninteracting amplifications within a milliliter-scale volume . Amplification products of individual compartments are captured via inclusion of 1-mm paramagnetic beads bearing one of the PCR primers . Any single bead bears thousands of single-stranded copies of the same PCR product, whereas different beads bear the products of different compartmentalized PCR reactions . The beads generated by ePCR have highly desirable characteristics:
3) 两端测序, 每次有效的可读顺序为460 bp, 每个克隆为920 bp. 4) 随机挑选质粒载体克隆9600个, λ载体克隆500个. 两端测序
共获得测序总长为8.84 x 106, 覆盖面约5, P0=e-5=0.67%. 5) 预计丢失的顺序为L x e-m=1.8 Mb x 0.0067=1.25 x 104 bp. 6) 空隙长度为: L/n=1.8 Mb /(9600 x 2) (L为基因组总长, n为测
顺序间隙缝合
物 理 间 隙 缝 合
流感嗜血杆菌基因组测序结果
1) 两端测序的结果称为读序(read), 每个读序 长约400 bp.
2) 在DNA顺序组装前,由自动测序仪给出的每个读 序都必须经PhredII软件处理, 以确定给出的 顺序质量与可靠性.这一步为顺序认可 (calling for).
Sanger测序法: 同位素标记电泳测序
荧光标记电泳测序
毛 细 管 电 泳 测 序
毛 细 管
第一代 和
第二代 DNA测序
中断测序 连续测序
焦磷酸测序技术
pyrosequencing
焦磷酸测序技术是一 种新的实时DNA 测
序 技术。它在DNA 聚
合 酶、三磷酸腺苷硫酸 化酶、荧光素酶和三 磷酸腺苷双磷酸酶 4 种酶的协同作用 下，使引物延伸聚合 脱氧核糖核酸. dNTP 释放焦磷酸盐PPi、 PPi转换为三磷酸腺 苷（ATP）、
注: 线虫为单性(X或Y)或雌雄同体(XX), Y染色体未测序.
流感 嗜血 杆菌 基因 组鸟 枪法 测序 时的变异率. 此外, 2 kb大小 降低了克隆片段含有完整基因的可能性,有 些完整基因的表达产物对宿主菌是有克隆测序均为两端 测序.
大肠杆菌基因组测序（1）
大肠杆菌基因组（C区）测序
大肠杆菌C区测序采取了分割染色体DNA 的技术, 将切离的一段染色体DNA与人工插 入的复制载体整合, 获得可独立扩增的克隆 片段用于鸟枪法测序.
LoxP
Cre
重 组 系 统
大肠杆菌基因组C区测序步骤(1)
大肠杆菌基因组C区测序步骤(2)
线虫基因组测序策略---图位法