食品安全检测技术概述(技术服务)

方 法 四
抗 体
样本/标品 （抗原）
抗抗体
“一步法反应”
方法四: 操作简单,方便, 快速.反应灵敏. 固相载体
注意事项
1、实验前检查酶标仪和打印机工作是否正常。
2、试剂盒反应温度为25度或37度，要提前开空调或恒温箱，并调整
好温度。 3、使用之前将所有试剂温度回升至室温25℃。使用之后立即将所有
试剂放回2-8℃冰箱。
排 泄 物
土 壤 兽药及饲料添加剂
鱼、虾等
对生态环境的影响
转 移
降 解
消 除
毒 性
富 集
消 除
三、酶联免疫检测技术的基本原理
ELISA是一种免疫测定（immunoassay，IA） 抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。加 入酶反应的 底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质 的量直接相关，由此进行定性或定量分析。
酶 抗原 酶标记抗原 样本/标 品(抗原)
直接竞争法(包抗体)： 1.将抗体包被在固相载体上。 2.加入样品和酶标记抗原, 两者竞争板上的抗体. 3.酶催化底物并显色。
方 法 一
抗体
方法: 反应步骤少,操作简单; 特异性不如间接竞争法.
固相载 体
间接竞争法(包被抗原)： 酶 抗 抗 体 酶标记 抗抗体 1.将抗原包被在固相载体上。 2.加入样本和抗体后，若样本中 含有抗原，则将和板上抗原竞争结 合加入的抗体。 3.再加入酶标记抗抗体，则结合 为抗原-抗体-酶标记抗抗体复合物。 4.酶催化底物并显色
二、药物残留的危害及控制残留的意义
1.药物残留的危害：对食品安全的影响 （1）急性中毒 “瘦肉精”、“抗球王”中毒事件等 （2）慢性中毒 氯霉素、四环素类、大环内酯类、氨基苷类等 （3）“三致”作用 苯丙咪唑类、雌激素、砷制剂、喹噁啉类、硝基呋喃类和硝基咪唑类 （4）变态反应 青霉素、磺胺类、氨基糖苷类和四环素类等 （5）诱导耐药菌株 四环素类、喹诺酮类等，如喹诺酮类由于是家禽体内空肠弯曲杆菌产生 耐药性并传递到人的空肠弯曲杆菌而被许多国家禁用于食品动物 （6）激素样作用
方 法 二
抗 体 偶联抗 原样本/ 标品 方法二: 二步反应,操作比较简 单,有放大灵敏度和增 强准确度的作用
固相载体
标准品浓度关系
标准1
标准2
标准3
标准4
Hale Waihona Puke Baidu标准5
标准6
微孔板
抗体示意图
酶标二抗
酶
TMB TMB
加入标准品/样本和抗体
先 加
后 加
孵育
洗板过程示意图
未结合的抗体、标准品、 游离态的抗体抗原结合物
热电 MK3或科
氮吹仪操作步骤
• 氮吹仪在市面上主要有二种形式:干锅氮吹仪和水浴氮吹仪.
干锅氮吹仪
水浴氮吹仪
胶体金试纸条检测的基本原理
免疫胶体金技术的检测原理是：硝酸纤维膜为载体，包被已 知抗原和二抗，并使其呈带状分布，作为检测线和质控线，当液体
标本滴加在样本吸收垫上时，液体即向吸水垫处不断扩散，当液体
拍 干 B液 后 加 洗板 拍干
酶酶 酶 酶 酶 酶 酶酶 酶 酶 酶 酶 酶 酶
酶
酶
抗原 酶标记 抗体 样本/标 品(抗原) 抗体 抗抗体
间接竞争法(包二抗)： 1.将抗抗体（二抗）包在固相载体上。 2.加入抗体，则结合为抗抗体-抗体复 合物。 3. 加入样本和标准品及酶标记抗原， 两者竞争结合抗体。 4.酶催化底物并显色。
。化学结构和空间构型互补关系，具有高度的特异性。即“钥匙与
锁”的关系。 与类似物的交叉反应率是评价特异性的技术指标。
2.ELISA的原理和类型
一、ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中 有三个必要的试剂： （1）固相的抗原或抗体，即"免疫吸附剂"（immunosorbent）； （2）酶标记的抗原或抗体，称为"结合物"（conjugate）； （3）酶反应的底物。 可设计出各种不同类型的检测方法：药残检测时常采用下例方
移液器（20--200µl；100--1000µl；50--300µl八道排枪）；
电子天平（0.01g）； 振荡器； 具有吹氮气或空气的多道吹干装置； 酶标仪(部份需要另配打印机)；
电脑（用于数据分析与储存）
常见仪器的操作
• 酶标仪
主要有MK3/2、美国伯乐680、ST-360三种。
反应终止后颜色示意图
标准1
标 准 曲 线
标准2 标准3 标准4
标准5
标准6
样 本 显 色 情 况
得出读数以后 再用专用软件 进行分析即可
无酶标仪不加终止液直接比对
标准1
标 准 品 显 色 情 况
标准2 标准3 标准4
样本1的显色情况可以看出大概 在标准2与标准1的颜色之间， 即可得出其样本中的待测物含 量在标准1与标准2之间，再乘 上样本的稀释倍数以后即可得 出该样本的最终含量范围。
食品安全快速检测技术概述
技术服务中心：李晓芳
2011.5.26
研发生产大楼位于北京国际信息产业基地，共计8000平米
目

录
食品安全概述 药物残留的危害及控制残留的意义 药物残留快速检测方法 ELISA用到的相关仪器介绍 残留检测方法实际应用情况概述 总结
一.食品安全概要
动物性食品安全已成为全世界关注的焦点，其中兽药残留问题是 影响动物性食品安全的最主要因素之一。国际外贸畜产品进出口条例 明确规定了氯霉素、硝基呋喃类等药物残留是肉品国际贸易中的必检 项目。 我国是农业大国，畜禽产品的对外贸易在我国的国民经济中已显 示了非常重要的地位，但由于药物残留量超标问题，致使畜禽肉产品 的出口在国际市场上屡屡受挫，已成为阻碍我国畜牧养殖业的一大棘 手问题。
法来进行检测。
2.ELISA的原理和类型
二、必备试剂： 三个必要的试剂：免疫吸附剂、结合物和酶的底物 1.已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂） 2.酶标记的抗原或抗体（结合物） 3.酶的底物 4.阴性对照品和阳性对照品，参考标准品 5.结合物及标本的稀释液 6.洗涤液 7.酶反应终止液 三、方法类型： 1.双抗体夹心法测抗原 2.双抗原夹心法测抗体 3.间接法测抗体 4.竞争法测抗体或抗原
加入酶标二抗
酶
酶
酶 酶
酶
酶
酶 酶
酶 酶
酶 酶
酶
酶 酶
孵育
酶
酶 酶
酶
酶
酶 酶
酶 酶
酶 酶
酶
酶
酶
加入底物和显色剂
先 加
A液
B液
后 加
酶 酶 酶 酶 酶 酶 酶 酶 酶 酶 酶 酶
显色
酶 酶 酶 酶 酶 酶 酶 酶 酶 酶 酶 酶
有经验者可根 据颜色深浅调 整显色时间
终 止
2M H2SO4
酶 酶 酶 酶 酶 酶 酶 酶 酶 酶 酶 酶
多宝鱼事件
1.硝基呋喃类药物，如呋喃西 林、呋喃唑酮及其代谢物等。 具有致突变和致癌作用。2002 年4月，农业部规定禁止使用。 2.孔雀石绿：一种染料，具有 杀菌和延长鱼类寿命的作用。 但致癌。 3.氯霉素、环丙沙星等抗生素 残留。长期使用会污染环境， 产生耐药性。
三聚氰胺分子模型
2.对社会的影响
方 法 三
方法三: 二步反应,操作比较简单,在加 样本时容易出现时间差而影响 检测结果的准确度.
固相载体
酶 抗 抗 体 酶标记 抗抗体
一步法反应： 1.将抗原（或二抗）包被在固相载体上。 2.加入样本和酶标记二抗或酶标抗原 后，最后加入抗体，三种一起混合 反应。形成抗原（或二抗）--抗体 -酶标记抗抗体（或抗原）复合物。 4.酶催化底物并显色
C T
C T
C T
试纸条示意图 （带卡俯视图）
图一
图二
其他相关的检测方法
PCR:聚合酶链式反应 (Polymerase Chain Reaction)，; HPLC:
1.2
敏感性
① 化学比色法的敏感度为mg/ml水平。 ② 酶反应测定法的敏感度约为5-10μg/ml。
③ 免疫测定中凝胶扩散法和浊度法的敏感度与酶反应法相仿。
④ 标记的免疫敏感度可提高数千倍，达ng/ml水平。 例如，氯霉素、呋喃唑酮类药物，其敏感度可达0.05ng/ml以 下。
1. 3
特异性
抗原抗体的结合发生在抗原的决定簇与抗体的结合位点之间
4、洗板所用水为去离子水，若没有制备去离子水的仪器，也可使用 纯净水。 5、在ELISA分析中的再现性，很大程度上取决于洗板的一致性，仔细 按照推荐的洗板顺序操作是ELISA测定程序中的要点。在洗板过 程中如果出现板孔干燥的情况，则会出现标准曲线不成线性， 重复性不好的现象。所以洗板排干后应立即进行下一步操作。
ELISA中常用名词
8.灵敏度:指测定值(平均值)与真实值的接近程度,表示分析结果的正确 性.由于无法知道榈的真实浓度,故通常采用添加回收率来表示: 回收率=(测定值-空白值)/添加量 9.精密度:指用某种方法重复测定同一均质样品所得测定值的彼此接近 程度,表示分析结果的重复性. 10.检测限:检测限指分析方法能够从榈的背景信号中检测出待测物存在
ELISA中常用名词
1.半抗原: 只有免疫反应性,而无免疫原性的小分子物质.如药物, 多糖,类脂等。 2.抗原: 凡是能刺激机体产生免疫应答并能与应答产物特异结合的 物质。 3.载体: 赋予半抗原具有免疫原性的蛋白质分子,即为载体。 4.抗体:可与相应抗原发生特异性结合反应的免疫球蛋白 。 5.稳定性:通常用户指的稳定性既指试剂盒的保存期，又指试剂盒 不同批次的均一性。 6.特异性:试剂盒特异性一般指试剂盒出现假阳性或假阴性的概率。 7.准确度:一般用回收率来表示,是评价试剂盒方法的重要指标。
标准5
标准6
同理可以看出样本的检测 含量在标准5与标准6的浓 度之间，再乘上样本的稀 释倍数以后即得到该样本 的大概含量。
样 本 显 色
样本1 样本2
ELISA整个流程示意图
先 加 后 加
混匀
洗 板
2M H2SO4 先A液 加 显色
酶酶酶 酶 酶 酶酶 酶 酶酶酶 酶 酶酶酶 酶 酶 酶酶 酶 酶酶酶 酶
到达金标垫处时，金标记物被溶解，同时与检测线处的抗原结合形 成复合物从而形成“检测线红线”。多余的金标记物与没有被固定
在检测线处的复合物与二抗反应结合形成“质控线红线”。多余的
液体继续前移至吸水垫处。
胶体金检测试验图示：
样品吸收垫
吸收垫
NC膜
金标垫
C线（控制线） 背衬垫 T线（检测线）
• 胶体金检测方法结果分析：
的吸光度值小于0.5个单位（OD450nm<0.5 ）时，表示试剂可能变
质。
报告方式
定量分析 用已知量的标准品做ELISA测定，绘制标准曲线， ELISA的标准曲线每次都要和待测标本做在同一块板上。现有的ELISA 定量试剂盒标准曲线只有在较窄的浓度范围内成直线，要得到精确的
结果实属不易。因此不能用定性试剂盒做定量分析。
灰区概念
把定量分析的正常值范围引入定性分析建立灰区概念，即将 检测限值上下的一段区域定为阳性可疑，需重复实验或换试剂重测以 确定其阴阳性，如仍落在灰区范围内需要用确证方法进行确证实验。
2 仪器设备
酶联免疫实验室需要的设备应根据实验室实际条件来进行配备。主 要的实验仪器有： 能进行50ml管离心的离心机（非冷冻也可）； 组织匀浆器；
注意事项
6、反应终止液为2M硫酸，避免接触皮肤。 7、不要使用过了有效日期的试剂盒，稀释或搀杂使用会引起灵敏度、 OD值的变化。不要交换使用不同批号的盒中试剂。 8、储存条件保存试剂盒于2-8℃，不要冷冻；将不用的微孔板放进自
封袋重新密封；标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直
接暴露在光线下。 9、试剂变质的迹象显色液若有任何颜色表明变质，应当弃之。0标准
（1）大众消费心理恐慌
（2）社会负担 （3）环境生态变化
3.对产业的影响
（1）对兽药产业、饲料工业的影响
（2）对养殖业的影响
（3）对食品加工业的影响
4.对进出口贸易的影响
药物对人体的危害:
硝基呋喃----致癌 孔雀石绿----致癌、致畸、致突变 氯霉素------再生障碍性贫血、速发型过敏 、皮炎 喹诺酮类----儿童头痛、肝、肾功能 损害 磺胺类 -----免疫下降、破坏造血系统、溶血性贫血 潜在致癌
时所需的最低浓度.
11.定量限:指分析方法能够对样品中的待测物进行定量测定的最低浓度.
1.1 抗原抗体反应的特点
抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一 种动态平衡，其反应式为：
Ag+Ab→Ag· Ab
抗体的亲和力（affinity），可以用平衡常数K表示 ：K=[Ag·Ab]／[Ag][Ab] ,Ag·Ab的解离程度与K值有关 。高亲和力抗体的抗原结合点与抗原的决定簇在空间构 型上非常适合，两者结合牢固，不易解离。解离后的抗 原或抗体均能保持原有的结构和活性。