下呼吸道细菌学检验操作规范(讨论稿)
下呼吸道感染细菌培养操作规范
清除机制：
健康宿主吸入口腔定植菌后常无临床症状，细菌 通常被粘液柱状纤维清除。
吸入能否引起肺部感染取决于： 吸入菌的致病性及数量； 患者免疫系统； 呼吸道功能等诸方面的因素。
2）吸入气溶胶肺部感染占第二位： 主因：使用了不清洁的呼吸机。
3）血液播散性肺炎占第三位：
感染通常造成双肺下叶肺炎。由呼吸道感染引发 的菌血症占12%，因此对肺部感染的高热患者送 检血培养，有利于发现肺部感染的病原菌。
3.1.3 血培养 注：当下呼吸道感染患者伴有高热症状时，送检血培养（具体参考血培养
标本采集和送检要求） 3.1.4 诱导痰（通常不用于细菌培养） 3.1.5 气管镜标本
3.1.5.1 采集气管镜标本注意事项 3.5.1.2 支气管肺泡灌洗液标本(BAL)
3.5.1.3 保护毛刷(PSB)
3.2 标本运送
肺炎支原体和肺炎衣原体
注2：通常可用分子生物学方法快速诊断，也可在感染后期用血清学方法检测肺炎支原体、肺炎衣 原体和军团菌属抗体确诊。由生物恐怖病原菌，如和鼠疫耶尔森菌引起的感染，血清学检测 可作为辅助诊断方法。结核分枝杆菌可用罗氏培养基或快速结核杆菌液体培养仪培养，或分 子诊断方法检测。
注3：暴露在特殊气溶胶环境：与飞沫有关的结核分枝杆菌、与尘暴和鸟排泄物有关的双相真菌等。
胡继红 任健康 马筱玲 胡云建 王辉 徐英春 苏建荣 罗燕萍 李向阳
1 美国微生物学会:《临床微生物学操作手册》（第3版）.2007.
（Clinical Microbiology Procedures Handbook）
2 美国微生物学会:《下呼吸道感染》临床微生物学检验技术及操作系列丛书.2004
类型/免疫状态
最常见病原菌
最新下呼吸道感染细菌学检验操作规范
下呼吸道感染细菌学检验操作规范—、相关临床知识临床通常将正常人喉以上部位称之为上呼吸道，上呼吸道定植有大量的正常菌群，而气管以下包括气管、支气管和肺泡称下呼吸道，通常无菌。
下呼吸道感染包括急性气管-支气管炎、慢性支气管炎急性发作、支气管扩张继发感染及肺实质感染（肺炎、肺脓肿）等。
病原体有细菌、病毒、衣原体、支原体、真菌、立克次体和原虫等。
下呼吸道感染患者可有发热、咳嗽和咳痰，痰呈脓性、粘稠或血性，可伴有胸痛、气急，肺部闻及湿罗音、白细胞总数及嗜中性粒细胞比例明显增高，x线检查提示肺部有炎症性浸润或胸腔积液等体症，严重时可导致感染性休克和呼吸衰竭，因此临床诊断一般不难；细菌学检验能明确感染病原，并提供有关抗菌药物对分离菌的抗菌活性等信息，有助于疾病治疗、流行病学调查研究和医院感染的监测。
临床呼吸道标本中常见分离细菌见表1表1呼吸道标本中的常见分离细菌二、标本米集本室必须注意生物安全防护。
（一）采集方法1 •自然咳痰法以晨痰为佳，采集标本前应用清水、冷开水漱口或牙刷清洁口腔和牙齿，有假牙者应取下假牙。
尽可能在用抗菌药物之前采集标本。
用力咳出呼吸道深部的痰，痰液直接吐入无菌、清洁、干燥、不渗漏、不吸水的广口带盖的容器中，标本量应》lml。
标本应尽快送检，不能及时送检的标本，室温保存w 2h o2•支气管镜采集法、防污染毛刷采集法、环甲膜穿刺经气管吸引法、经胸壁针穿刺吸引法和支气管肺泡灌洗法均由临床医生按相应操作规程采集，但必须注意采集标本时尽可能避免咽喉部正常菌群的污染。
3 •小儿取痰法用弯压舌板向后压舌，将拭子伸入咽部，小儿经压舌刺激咳嗽时，可喷出肺部或气管分泌物粘在拭子上送检。
幼儿还可用手指轻叩胸骨柄上方，以诱发咳痰。
（二）标本验收遇有不合格标本，应及时与临床联系，报告不合格标本拒收的具体理由。
下呼吸道标本验收与拒收见表2o三、实验室检查（一）肉眼观察 观察痰液的颜色、粘度、有无血丝和是否呈脓性，如见有颗粒存在，则应注意可能 与放线菌属及奴卡菌属感染有关。
下呼吸道感染细菌培养操作规范_3
2014/5/933.2 标本运送注1：若送检标本超过2h ，将导致有临床意义的致病菌数量减少，非苛养的口咽部定植 菌过度生长。
为防止口咽部正常菌群的过度生长，可将标本放置2℃～8℃环境，但 培养分离到肺炎链球菌等苛养菌的机会和数量会减少。
注2：若标本延迟送检超过2h 后未冷藏（超过2h ～24h ，2℃～8℃），应在报告中说明因 延误送检标本，可能对培养结果造成的影响。
3.3 筛选并拒收下呼吸道细菌培养标本❝拒收24h 内重复采集的痰细菌培养标本 ❝唾液❝鼻冲洗液和分泌物、鼻孔拭子 ❝咽部标本❝未经保护套管收集的支气管刷培养标本 ❝痰的厌氧菌培养标本注：除支气管穿刺吸出物、PSB 、活检标本、胸水或其他未经污染以外的标本做厌氧菌培养均不合格。
❝诱导痰注：诱导痰标本只适用于检测卡氏肺孢子菌和结核分枝杆菌，对其他病原菌检出效果差。
4.1 痰及气管吸出物标本处理 4.1.1标本处理要求❝接种标本及涂片操作必须在Ⅱ级生物安全柜中进行；❝应尽快处理所有标本，特别是来自急诊、新入院患者和有创方法采集的标本（如：BAL 和肺活检标本），以保证致病菌的活性，避免造成重复采集标本；❝使用全自动接种前处理系统的实验室按厂家说明书处理标本，洗痰、液化后自动接种和涂片革兰染色。
4.1.2 接种标本 4.1.3 培养4.1.4 标本涂片及革兰染色注1：革兰染色脱色时间因选用不同的脱色剂而异。
1）95%乙醇脱色时间为30s ；2）丙酮- 乙醇（体积比为3:7,棕色瓶室温保存，有效期1年）脱色时间1s ～5s ，脱色效果一致性 好；3）丙酮（试剂纯）脱色时间最短，当标本中含大量宿主细胞时脱色效果好。
注2：使用革兰染色仪染色的实验室按照厂家操作说明书进行，注意条件优化，使涂片染色结果达到满意效果。
4.1.5显微镜观察革兰染色结果注：低倍镜下细胞计数、油镜下细菌计数半定量指标；❝4.2 气管镜标本处理4.2.1 支气管肺泡灌洗液定量培养 4.2.2 保护毛刷定量培养4.2.3 接种其他培养基并培养 4.2.4 革兰染色标本处理4.2.5 剩余BAL 标本可用于其他病原检测（标本珍贵）对剩余BAL 标本离心后，可根据需要进行病毒、分枝杆菌、军团菌和真菌培养；或做病毒、卡氏肺孢子菌、抗酸染色和真菌涂片染色（见参考文献4的第六篇相关章节）（修改解释）。
呼吸道感染细菌学检验操作规范
细菌培养
01
02
03
04
培养基选择
根据不同病原体选择适宜的培 养基，如血琼脂、巧克力琼脂 等。
标本采集
采集呼吸道分泌物、痰液、肺 泡灌洗液等作为培养样本。
培养条件
菌落鉴别
在恒温（35-37℃）条件下进行 培养，观察菌落生长情况。
根据菌落的形态、染色特性、 生化反应等指标鉴别细菌种类 。
药敏试验
分子生物学检测
细菌学快速检测
采用自动化仪器和试剂盒进行细菌学 快速检测，如免疫分析仪、干式生化 分析仪等。
利用PCR等分子生物学技术检测病原 体核酸，具有快速、敏感的优点。
05
结果报告与解读
结果报告的格式与内容
检验结果
包括细菌培养、药敏试验等结果， 应详细记录。
检验报告单
应包括患者基本信息、送检标本类 型、检验项目、检验结果及结论等。
事故应急处理
制定实验室事故应急处理预案 ，并定期进行演练，确保在发 生事故时能够迅速、有效地应
对。
THANK YOU
感谢聆听
检验报告时间
应在规定时间内出具检验报告，并 注明报告时间。
结果解读与临床意义
解读依据
根据细菌培养和药敏试验结果， 结合患者临床表现和实验室检查 指标进行综合分析。
临床意义
为医生提供细菌种类、耐药性及 感染部位等信息，指导临床用药 和治疗方案制定。
结果报告的注意事项
准确性
确保检验结果的准确性，避免误差和误报。
样本稀释
将采集的样本进行稀释， 以便后续的细菌分离和培 养。
样本预处理
对稀释后的样本进行预处 理，如添加抗菌药物，以 抑制其他微生物的生长。
20呼吸系统标本细菌学检验标准操作规程
规范呼吸道标本细菌学检验标准操作规程，确保检验结果准确可靠。
2
呼吸道标本培养和涂片检查。
3
3.1
3.2
3.2.1
3.2.2
3.2.3
3.2.4
3.2.5
3.3
3.3.1
3.3.2
3.3.3
3.3.4
3.3.5
3.3.6
3.4
采集标本后立即送到实验室，放置时间不应超过2小时。
4
4.1
4.2
4.3
5
参见《质量管理程序》。
6.3
6.3.1
6.3.2
6.3.3
6.3.4
6.3.5
7
8
8.1
8.2
9
9.1
9.2
9.3
10
上呼吸道标本培养生长的细菌是否与疾病有关，需各方面综合分析，排除常居菌后，才可作出正确的判断。下呼吸道的痰液应是无细菌的，而经口腔咳出的痰带有多种上呼吸道的正常寄生菌（如草绿色链球菌）.若从病人痰标本中查见致病菌或条件致病菌，提示可能有呼吸道细菌感染。肺炎链球菌是肺炎最常见的致病菌.儿童细菌性肺炎多为流感嗜血杆菌所致.医院获得性肺炎的常见病原菌是革兰阴性杆菌，主要有肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、沙雷菌属和肠杆菌属细菌等。肺结核由结核分枝杆菌引起的。嗜肺军团菌引起军团菌病，肺部厌氧感染大多是脆弱类杆菌及梭杆菌属的细菌等。疑典型形态细菌所致肺部感染时，常先做痰液和支气管分泌物涂片、染色镜检（如肺部结核痰液徐片、抗酸染色，镜检找抗酸染色阳性结核分枝杆菌），有助于细菌培养检查。
11
如查出抗酸杆菌阳性，则应及时向临床报告并作出传染病报告。
编写：审核：批准：
日期：年月日
6
下呼吸道感染细菌培养操作规范
4.5质量控制 4.5.1革兰染色 4.5.2抗酸染色 4.5.3培养基 4.5.4试剂 4.5.4.1每批号、每周需做质控的试剂 4.5.4.2每批号、每次试验需做质控的试剂
3
5.1革兰染色报告 5.1.1痰标本报告原则（见表1） “痰/气管吸出物标本涂片革兰染色结果解释” 5.1.2 BAL细胞离心涂片报告
1
内容
1.口咽部定植菌群变化对肺部感染的重要影响
肺部感染的影响因素 (定植菌变化：健康人G+
免疫、基础病/住院、用抗菌药物 G-b )
2.肺部感染的常见机制
主要机制：吸入定植菌；吸入气溶胶；血播性； 附录A:“下呼吸道感染的主要类型及主要病原菌”
3.痰涂片对下呼吸道感染病原菌诊断的重要作用
痰培养：敏感性低 / 培养+ 涂片：提高特异性和敏感性
4.支气管纤维镜标本定量培养的临床意义
特异性82%～91%，诊断价值远高于痰标本； 附录B :“适合诊断的病原及检验项目”
5.下呼吸道感染细菌培养的局限性
培养结果假阴性、假阳性的原因
汇总表 汇总表
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针对医疗机构微生物实验室 针对痰 (细菌) 培养项目：
常规细菌培养方法检测下呼吸道感染病原菌的检验流程 本规范的特色： （1）明确下呼吸道标本适合诊断的病原和检验项目； （2）要求细菌培养项目需同时做革兰染色涂片； （3）规范痰培养/气管吸出物的定性培养程序、气管镜采集标本的定
3.1 标本采集 3.1.1 咳痰 3.1.2 气管吸出物
注：仅当出现肺炎的临床表现（如发热或浸润）时采集气管吸出物标本， 否则勿培养气管吸出物，因气管在插管24h后即有定植菌，培养结果 可能与疾病不符。
3.1.3 血培养 注：当下呼吸道感染患者伴有高热症状时，送检血培养（具体参考血培养
下呼吸道感染细菌培养操作规范_1
由于国内微生物检验专业缺乏系统的、按流程编写的操作规范；
2009年卫生部临床检验中心举办了全国临床微生物检验标准化培训班， 邀请美国斯坦福大学国际权威的临床微生物学家Prof. Ellen做了临床微 生物检验操作流程的标准化培训，得到参会学员的一致好评。
由此，2010-2011年中华医学会临床检验分会临床微生物学组任健康组 长和马筱玲副组长提议，由卫生部临床检验中心微生物室胡继红执笔， 合作草拟了《下呼吸道感染细菌培养操作规范》。
卫生部临床检验中心 陕西省人民医院 安徽省立医院
胡继红 任健康 马筱玲
卫生部北京Leabharlann 院胡云建 北京大学人民医院
王辉
中国医学科学院北京协和医院 徐英春
首都医科大学附属北京友谊医院 苏建荣
解放军总医院
罗燕萍
浙江省温州医科大学附属第二医院李向阳
1 美国微生物学会:《下呼吸道感染》临床微生物学检验技术技术及操作系列丛书.2004
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Standard for Bacterial Culture Procedures of Lower Respiratory Tract Infections
主要起草人：卫生部临床检验中心 胡继红
大多数微生物室每日近一半标本量：痰培养+药敏； 培养结果前后两天经常不一致； 培养生长的不同种类、数量细菌如何报告标准不统一； 定植菌、致病菌如何判断—标本是否合格如何判断？ 培养结果与临床诊断不符合；
2012年完成讨论稿，开过两次专家审稿会，也广泛征求了全国微生物专 家的意见，并在全国室间质评大会上征求了微生物室操作人员的意见， 大家普遍认为下呼吸道感染细菌培养操作急需规范性文件，此将对实验 室有重要指导作用。
下呼吸道细菌学检验操作规范(讨论稿)
出芽酵母样孢子和假菌丝
通常提示鹅口疮或上呼吸道酵母菌感 染，不是肺炎，仅当其为主要所见菌 时报告
请高级医师进行确认，可能需要补充 实验如改良的抗酸染色
其他异常结构，如真菌，分枝的革 兰阳性丝状杆菌或奇特形状的细菌 （可能抗生素治疗的结果）
培养结果检查
观察24h后平板
继续培养平板24－48h，为检出霉菌、慢生长菌、 苛养的革兰阴性杆菌如博德特菌属
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支气管 肺泡灌 洗液 BAL
保护毛 刷标本 PSB
库什曼 螺旋纤 维
术语及 定义
夏科雷 登结晶
弹性纤 维 纤毛柱 状上皮 细胞
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肺泡巨 噬细胞
保护毛 刷(PSB) 支气管 肺泡灌 洗液标 本(BAL)
咳痰
分析前
标本采集
气管镜 标本
气管吸 出物
诱导痰 （通常 不用于 细菌培 养）
血培养
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分析前下呼吸道标本检验
不要报告小菌落的beta-溶血链球菌或F群链球菌，
因为这些菌是上呼吸道正常菌群
链球菌 Alpha-溶血链球菌 Optochin敏感实验 胆汁溶菌实验 （联合上述两个实验进行鉴定） 药敏实验，贴OP纸片确认纯度以检查药敏结果是否
有污染
苛养革兰阴性杆菌 流感嗜血杆菌，卫星现象，ALA实验确认鉴定并 作beta-内酰胺酶试验。 百日咳博德特菌 触酶和尿素酶阳性，培养48h出 现肉眼可见菌落 巴斯德菌 吲哚和氧化酶阳性，动物口腔正常菌群
THANK YOU
报告“肠道革兰阴性杆菌”
报告“非发酵革兰阴性杆菌”
报告“分离到上呼吸道细菌”， 注如果只存在肠球菌和凝固酶阴 性葡萄球菌（有或没有酵母菌）， 报告“混合有革兰阳性微生物细 菌，或如果90%是培养物，则做 少量鉴定列出”
市第一人民医院细菌室下呼吸道标本的细菌学检验
市第一人民医院细菌室下呼吸道标本的细菌学检验1. 下呼吸道标本培养常见病原菌
金黄色葡萄球菌
脑膜炎奈瑟氏菌
化脓性链球菌
流感嗜血杆菌
肺炎链球菌
肠杆菌科细菌
结核分支杆菌
非发酵菌
白喉棒状杆菌
嗜肺军团菌
假丝酵母菌
2.标本收集：
2.1下呼吸道标本采集的基本要求是采集深部的痰液，具体方法有以下几种：1.自然咯痰法 2.气管镜采集法
3.小儿取痰法
4.气管穿刺法
5.胃内采痰法。
2.2标本采集的注意事项
2.2.1标本采集以晨痰为佳，咳前应充分嗽口，减少口腔正常菌群的污染。
2.2.2标本采集后应及时送检，以防某些细菌在外环境中死亡。
做结核分枝杆菌或真菌培养的痰液如不能及时送检，应放入4℃冰箱，以免杂菌生长。
3.检验步骤：
3.1一般细菌涂片检查挑取痰液的脓性或带血部分放在两张玻片中，置室温自然干燥，经火焰固定后，做革兰氏染色，另一张根据检验需要做抗酸染色或其他染色。
如标本中每个低倍视野内鳞状上皮细胞多于25
个，脓细胞又少于10个，并找不到病变部分，表示标本来自唾液，标本不合格，不必进一步检查，要求重新送检。
3.2分离培养一般细菌培养分别接种于血平板、麦康凯、巧克力平板，巧克力应置于CO2环境中35℃培养18～24小时。
4.报告结果：检出细菌，应报告菌名和药敏结果。
下呼吸道感染细菌培养操作规范
下呼吸道感染细菌培养操作规范ICS点击此处添加中国标准文献分类号WS中华人民共和国卫生行业标准XX/TXXXXX—XXXX下呼吸道感染细菌培养操作规范StandardforBacterialCultureProceduresofLowerRespiratoryTractInfections点击此处添加与国际标准一致性程度的标识（报批稿）（本稿完成日期：）XXXX-XX-XX发布XXXX-XX-XX实施中华人民共和国国家卫生计生委员会发布XX/TXXXXX—XXXX1目次前言 (4)引言 (5)1范围 (7)2术语及定义 (7)2.1支气管肺泡灌洗液 (7)2.2保护毛刷标本 (7)2.3库什曼螺旋纤维 (7)2.4夏科雷登结晶 (7)2.5弹性纤维 (7)2.6纤毛柱状上皮细胞 (8)2.7肺泡巨噬细胞 (8)3分析前 (8)3.1标本采集 (8)3.1.1咳痰 (8)3.1.4诱导痰（通常不用于细菌培养） (8)3.1.5气管镜标本 (8)3.2标本运送 (9)3.3筛选并拒收下呼吸道细菌培养标本 (9)4分析中 (9)4.1痰及气管吸出物标本处理 (9)4.1.1标本处理要求 (9)4.1.2接种标本 (9)4.1.3培养 (9)4.1.4标本涂片及革兰染色 (10)4.1.5显微镜观察革兰染色结果 (10)4.2气管镜标本处理 (10)4.2.1支气管肺泡灌洗液定量培养 (10)4.2.2保护毛刷定量培养 (11)4.2.3接种其他培养基及培养 (11)4.2.4革兰染色标本处理 (11)4.2.5剩余BAL标本检测其他病原 (11)4.3连续培养并观察慢生长菌 (11)4.4分离并鉴定下呼吸道重要致病菌（参见附录C） (11)XX/TXXXXX—XXXX24.4.1链球菌属 (11)4.4.2苛养革兰阴性杆菌（在麦康凯平板上难生长） (12)4.4.3革兰阴性双球菌 (12)4.4.4革兰阴性杆菌（在麦康凯平板上生长良好） (12)4.4.5葡萄球菌属 (13)4.4.6肠球菌属 (13)4.4.7革兰阳性杆菌 (13)4.4.8鉴定丝状真菌 (13)4.4.9涂片时可见但培养不生长的细菌 (13)4.5质量控制 (13)4.5.1革兰染色 (13)4.5.4试剂 (14)5分析后报告结果 (14)5.1革兰染色报告 (14)5.1.1痰标本报告原则（见表1） (14)5.1.2BAL细胞离心涂片报告 (15)5.2报告有临床意义的微生物 (16)5.2.1报告的病原菌 (16)5.2.2培养和涂片相符合时报告的病原菌 (16)5.2.3有临床意义的数量 (16)5.2.4报告有临床意义数量的非优势菌 (16)5.2.5报告有临床意义数量的优势菌 (16)5.3对非致病菌的报告 (17)5.3.1报告“肠杆菌科革兰阴性菌” (17)5.3.2报告“非发酵革兰阴性杆菌” (17)5.3.3只生长肠球菌和凝固酶阴性葡萄球菌 (17)5.3.4报告“分离到口咽部正常菌群” (17)5.4平板上无细菌生长 (17)5.5结果解释 (17)附录A（规范性附录）下呼吸道感染主要类型及常见病原体 (18)附录B（规范性附录）支气管镜采集的标本适合诊断的病原体和检验项目 (19)附录C（规范性附录）常见可疑菌落形态及经典快速鉴定方法 (20)参考文献 (22)XX/TXXXXX—XXXX3前言本标准按照GB/T1.1给出的规则起草。
下呼吸道感染细菌学检验操作规范
培养基选择问题
总结词
培养基是细菌生长的媒介，不同的培养基适合不同的细菌，因此选择适合的培养 基是关键。
详细描述
针对下呼吸道感染的常见病原菌，如肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌等 ，应选择含有适量的血液、血清、抗生素和碳源的培养基。同时，培养基的pH 值和渗透压也要适宜，以确保细菌的正常生长。
药敏试验误差
增菌
在适当的培养基中对样本 进行增菌，以促进细菌的 生长。
分离纯化
将增菌后的样本进行分离 纯化，得到单一菌落。
细菌培养
选择培养基
根据不同的细菌选择适宜的培养基，以保证细菌 的生长和分离。
培养条件
设定适宜的温度和湿度等培养条件，保证细菌的 正常生长。
观察记录
对培养的细菌进行观察和记录，包括菌落形态、 染色特性等。
PART 02
下呼吸道感染细菌学检验 操作流程
样本采集
01
02
03
采集时间
在抗生素使用前采集下呼 吸道感染的样本，以避免 抗生素对细菌的影响。
采集方法
根据感染部位选择合适的 采集方法，如痰液、支气 管肺泡灌洗液等。
注意事项
采集过程中要严格遵守无 菌操作原则，避免交叉感 染。
样本处理
预处理
去除样本中的杂质，如痰 液中的唾液、食物残渣等 。
药敏试验的方法包括纸片法、稀 释法和自动化仪器法等，应根据
具体情况选择合适的方法。
药敏试验结果应准确、可靠，为 临床医生提供准确的抗生素选择
依据。
结果报告要求
结果报告应及时、准确，以便临床医 生及时了解患者病情和治疗情况。
结果报告应包括细菌种类、药敏试验 结果等信息，以便临床医生选择合适 的抗生素进行治疗。
呼吸道标本细菌学检验标准操作规程
呼吸道标本细菌学检验标准操作规程1目的规范呼吸道标本细菌学检验标准操作规程，确保检验结果准确可靠。
2适用范围呼吸道标本培养和涂片检查。
3标本3.1标本类型：痰、咽拭子、支气管肺泡灌洗吸出液、支气管冲洗液或刷子、肺穿刺等。
3.2标本采集3.2.1采集时间：以晨痰为好；支气管扩张症病人，清晨起床后进行体位引流，可采集大量痰标本。
3.2.2自然咳法：在留取痰之前，用清水反复漱口，应从气管深处出痰，吐入无菌容器内。
3.2.3气管镜下采集法：在病灶附近用导管吸或用支气管刷直接取得标本。
3.2.4气管穿刺法：在环甲膜下穿刺抽取痰液，收集标本，适用于厌氧菌培养。
3.2.5棉拭采集法：用无菌棉拭子轻轻擦拭病人鼻咽部黏膜，留取标本，置无菌试管内送检。
3.3标本拒收标准3.3.1申请单姓名、科别、床号与标本的标签不符。
3.3.2痰标本呈水样或唾液样。
3.3.3痰涂片白细胞<10/低倍视野，上皮细胞>25/低倍视野。
3.3.4标本容器溢漏，无瓶盖。
3.3.5痰标本留取放置时间太长，超过2小时。
3.3.6未用指定的无菌容器作细菌培养。
3.4标本保存采集标本后立即送到实验室，放置时间不超过2小时。
4试剂、仪器4.1革兰染液、氧化酶试剂、3%触酶、血琼脂平板、巧克力平板、麦康凯平板、相关生化试剂等。
4.2VITEK鉴定系统；革兰阴性菌鉴定卡、革兰阴性菌药敏卡、革兰阳性菌鉴定卡、革兰阳性菌药敏卡、药敏纸片等，有效期及储存条件参见试剂说明书。
培养箱4.3接种针、接种环、电热灼烧器、显微镜、孵育箱、CO2等。
5细菌鉴定和药敏监控参见《质量管理程序》。
6检验步骤接收标本后，立即对标本进行编号、登记。
6.1肉眼观察：包括颜色、黏度、有无血丝或脓。
6.2涂片检查：可以确定标本是否适合做细菌培养，直接涂片镜检，依据低倍镜下观察白细胞和上皮细胞数目多少来评定。
并可初步判定是否有病原菌存在。
痰标本镜下分类分级白细胞（个）上皮细胞（个）A>25<10B>25<25C<10>25注：A、B两种情况的痰标本适合做培养，C不合格，应重新留标本。
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钟 桥 苏州市立医院本部
前言
• • • • • 口咽部正常菌群 常见的肺部感染机制： 吸入性：定植菌吸入肺部 呼入性：呼吸机、气溶胶等 血播性：见于静脉吸毒或血透患者
分析前下呼吸道标本检验
• 标本采集 咳痰 诱导痰（高渗盐水诱导3%NaCl 20-30ml）
• Murray, .R.,Baron ,E.J.,Pfaller ,M.,Tenover, F.,and Yoken, R. 2006. Manual of Clinical Microbiology, 9th ed. ASM Press, Washinton,D.C.
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气管和内镜吸出物 （气管插管24h，就有定植菌，仅有临床 症状时，否则切勿培养气管吸出物） 气管镜标本 （由肺科医生或受训后医生采集）支气管 肺泡灌洗液（BAL）支气管灌洗液，保护 性毛刷标本（PSB），支气管穿刺活检标 本 支气管灌洗液-BAL-PSB-穿刺活检标本
标本运送
无菌杯 条码 1－2h内送检 超时，苛养菌如肺炎链球菌减少，口咽部 正常菌群将过度生长
培养 35－37℃、5%CO2条件培养48h，最好至72h； 侵入性方法采集的肺标本，培养延长至4天
直接试验
革兰染色
注明细胞、细菌量以及评价结果 见表3 胆汁溶菌试验 革兰阳性双球菌
表3 痰涂片革兰染色结果解释
指征
每个低倍镜视野发现>10个鳞状上皮 细胞
解释
标本含有唾液和上呼吸道分泌物，报告 “>10个扁平上皮细胞/低倍视野，提示 标本被唾液污染，将不再进行培养”
污染痰标本和气管内标本革兰染色拒收条件的评价
（痰涂片 20－40/LP；气管吸出物低倍镜和油镜下都要检测）
• 不合格标本有： 痰标本 = 10个上皮细胞/低倍视野 但如果WBC数是上皮细胞数的10倍，单一形态的 细菌量达到3+至4+，可接受标本进行培养 成年人支气管吸出物：10SECs/LPF或未见细菌 患儿支气管吸出物：未见细菌 如WBC 4+，并可见纤维细胞，但未见细菌，最 好重新涂片做吖啶橙染色，用荧光显微镜观察弹 性纤维上是否有细菌，假单胞菌和嗜血杆菌可能 会在这类涂片中漏检； 还可以见军团菌，此类感染中常缺少白细胞。
不要报告小菌落的beta-溶血链球菌或F群链球菌，
因为这些菌是上呼吸道正常菌群
链球菌 Alpha-溶血链球菌 Optochin敏感实验 胆汁溶菌实验 （联合上述两个实验进行鉴定） 药敏实验，贴OP纸片确认纯度以检查药敏结果是否
有污染
苛养革兰阴性杆菌 流感嗜血杆菌，卫星现象，ALA实验确认鉴定并 作beta-内酰胺酶试验。 百日咳博德特菌 触酶和尿素酶阳性，培养48h出 现肉眼可见菌落 巴斯德菌 吲哚和氧化酶阳性，动物口腔正常菌群
囊性纤维化患者标本有特殊要求
囊性纤维化患者标本操作规范
菌名
丝状真菌 肠杆菌科 金黄色葡萄球菌 流感嗜血杆菌 肺炎链球菌 铜绿假单胞菌，洋葱克 雷伯，其他非发酵菌
鉴定
任何数量 优势菌 任何数量 优势菌 优势菌 任何数量
特殊处理
鉴定到种水平 做药敏实验 做药敏实验，做苯唑西林筛选 做beta-内酰胺实验 用苯唑西林纸片做青霉素耐药 筛，主要见革兰阳性 可疑肺炎链球菌。电话通知临床医生 球菌成对或成短链排列
指征
大量多形核白细胞，主要见革兰阳 性球菌成堆排列 大量多形核白细胞，主要见革兰阴 性双球菌 大量多形核白细胞，主要见小的革 兰阴性球杆菌 大量多形核白细胞，主要见大而胖 的革兰阴性杆菌 大量多形核白细胞，大量小的革兰 阴性杆菌，球杆菌，革兰阳性球菌 成链排列以及其他不同形态的细菌
报告“肠道革兰阴性杆菌”
报告“非发酵革兰阴性杆菌”
报告“分离到上呼吸道细菌”， 注如果只存在肠球菌和凝固酶阴 性葡萄球菌（有或没有酵母菌）， 报告“混合有革兰阳性微生物细 菌，或如果90%是培养物，则做 少量鉴定列出”
草链和或非致病的奈瑟菌，类白喉菌、凝 固酶阴性葡萄球菌、Rothia罗思氏菌、F群 链球菌，厌氧菌，嗜血杆菌属（非流感）， 艾肯菌，放线杆菌嗜二氧化碳菌，莫拉菌， 肠球菌，酵母菌和有意义数量的金黄色葡 萄球菌，革兰阴性杆菌和脑膜炎奈瑟菌
当培养少量，涂片也见到时报告
当培养达到有意义数量时，即使不 卡他莫拉菌 是优势菌，也报告 脑膜炎奈瑟菌 只对住院患者报告： 铜绿假单胞菌，报告药敏 嗜麦芽窄食单胞菌 不动杆菌，报告药敏 伯克霍德菌，报告药敏
检测
当培养达到有意义数量，并且是 优势菌，特别是涂片提示多形核 白细胞与培养一致，报告
病原菌
快速生长分枝杆菌
任何数量
鉴定到种水平
葡萄球菌 痰涂片显示有优势的呈堆球菌并与白细胞相关， 没有其他致病菌时，鉴定有意义菌量的金黄色葡萄 球菌 住院患者，鉴定并作苯唑西林耐药 仅当菌量达到90%纯培养时，鉴定凝固酶阴性葡
萄球菌，无需鉴定到种水平，无需做药敏
肠球菌 不要报告肠球菌，除非达到90%纯培养 很多革兰阳性球菌都是呼吸道正常菌群
• 门诊接受到大量脓性标本，应立即接种，不必等 待涂片结果。 • 拒收培养标本报告方式： • “涂片所见：每低倍镜视野含＝10个扁平上皮细 胞，提示标本质量差，不做培养；如果有临床指 征请重新采集标本” • “涂片检查40个视野，未见细菌，不做培养；如 果临床指征请与实验室联系” • 不能拒收标本 • 送检军团菌培养、抗酸染色痰标本、气管吸出物 和来自囊性纤维化患者的痰标本
每低倍镜视野发现<10个扁平上皮细 提示是一个良好的深部痰标本 胞，大量多形核白细胞，存在肺泡巨 噬细胞和柱状上皮细胞
大量多形核白细胞 胞内细菌 弹性蛋白或胶原纤维
Curschmann’s螺旋纤维
提示感染
提示感染
淀粉样小体 坏死白细胞
粉色絮状物 Charcot-Leyden结晶
提示感染
提示呼吸道疾病治疗产生的雾状高渗水 提示过敏性肺曲霉病
霉菌 念珠菌不能引起肺炎，除非肿瘤患者、肺移植患 者或新生儿。酵母菌是口腔正常菌群。
如果涂片时见到细菌但培养不生长，扩大培
养，可能存在军团菌、百日咳博德特菌和分
枝杆菌。
表4 下呼吸道培养致病菌报告指南
表6 常见可疑菌落形态及快速经典方法初步鉴定
检测
检验并报告
病原菌
化脓链球菌 B群beta-溶血链球菌（儿童） 博德特菌属，特别是支气管博德特菌 奴卡菌 新型隐球菌 淋病奈瑟菌 弗朗西斯吐拉菌（高致病菌） 鼠疫耶尔森菌（高致病菌） 炭疽芽孢杆菌（高致病菌） 霉菌，排除腐生菌污染 肺炎链球菌，报告药敏 流感嗜血杆菌，报告beta-内酰胺酶
解释
可疑金黄色葡萄球菌。电话通知临床 医生 可疑卡他莫拉局限性肺炎菌。电话通 知临床医生 可疑流感嗜血杆菌。电话通知临床医 生 可疑克雷伯菌或其他肠杆菌科菌引起 的肺炎 提示吸入性肺炎。这需要在报告中特 别提示，因为培养结果会显示正常菌 丛生长。电话通知临床医生
出芽酵母样孢子和假菌丝
通常提示鹅口疮或上呼吸道酵母菌感 染，不是肺炎，仅当其为主要所见菌 时报告
请高级医师进行确认，可能需要补充 实验如改良的抗酸染色
其他异常结构，如真菌，分枝的革 兰阳性丝状杆菌或奇特形状的细菌 （可能抗生素治疗的结果）
培养结果检查
观察24h后平板
继续培养平板24－48h，为检出霉菌、慢生长菌、 苛养的革兰阴性杆菌如博德特菌属
革兰染色结果解释培养结果 炎性细胞和细菌来决定对培养物下一步处理 如培养与涂片不符，重新读片 按照表4报告 鉴定以下有临床意义的可疑致病菌，排除正常 菌群
金黄色葡萄球菌，报告药敏 B群beta-溶血链球菌（成人），C、G群 单一形态革兰阴性杆菌（肺克）报告药敏 苛养革兰阴性杆菌，报告beta-内酰胺酶 尿素阳性棒状杆菌或来自ICU 来自免疫抑制患者，马红球菌 在麦康凯平板上生长1种以上革兰阴性杆 菌，氧化酶阴性，吲哚阳性，乳糖阳性或 蔓延生长 在麦康凯平板上生长1种以上革兰阴性杆 菌，氧化酶阳性，三糖铁上不发酵葡萄糖
革兰阳性杆菌 排除任何数量来自免疫抑制患者的奴卡菌和马红 球菌（粘液样并尿素酶阳性）
马、猪等动物致病菌，可条件致病，可以导致免疫抑制 患者的肺炎
大芽孢革兰阳性菌，则需排除炭疽芽孢杆菌和腊 样芽孢杆菌
快速尿素酶阳性（假白喉棒状杆菌），或标本来
自ICU插管患者时，鉴定大量优势的棒状杆菌
其他革兰阳性杆菌不会引起肺炎，无需鉴定
常见呼吸道重要致病菌
链球菌
苛养革兰阴性菌
革兰阴性双球菌 革兰阴性杆菌 葡萄球菌 革兰阳性杆菌
链球菌 Beta-溶血、触酶阴性呈链状或成对排列的球菌 化脓链球菌（PYR+）任何数量都要报告 患儿标本检查有小溶血环并鉴定B群-溶血链球 菌，任何数量都要报告 优势菌时，有意义数量的Beta-溶血链球菌
标本拒收规则
• 不接受48h内重复送检培养的标本 • 拒收以下标本申请做下呼吸道感染诊断：
24h内采集的痰标本 咽部标本 口水 诱导痰 鼻冲洗液和分泌物 或鼻孔拭子 厌氧培养标本 支气管刷培养，只能 用保护性毛刷 支气管灌洗液，气道 分泌物。
• 标本延迟>2h且未冷藏，应报告中注明标本延误送 检，可能对培养结果造成影响
侵蚀艾肯菌 上呼吸道正常菌群，无需鉴定
革兰阴性双球菌 卡他莫拉菌 G-双球菌，氧化酶阳性，血平板上可推动，丁 酸盐试验阳性 淋病奈瑟菌和脑膜炎奈瑟菌？ 需检验并报告，不需做药敏试验
当培养达到有意义数量时，即使不是优势菌，
也报告（表4）
在麦康凯或伊红美兰平板生长良好的革兰阴性杆菌 革兰阴性杆菌 鉴定和药敏试验 对于住院患者，不管是否有其他病原菌，检查有意 义数量的铜绿假单胞菌、不动杆菌、博克霍尔德菌 和嗜麦芽菌