FACS 胞内染色
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流式胞内染色实验方法
方案A：两步法胞内（细胞质）蛋白染色。
方案B：一步法胞内蛋白染色（细胞核）。
注意：
1、不同细胞因子的刺激条件是不同的，比如：LPS刺激活化单核细胞分泌IL-6的培养时间一般是6个小时，而检测IL-10则需要刺激24小时。
2、结合荧光的流式抗体应在4度，避光储存。
3、使用抗体前请低速离心30秒，使贴壁抗体沉底。不建议斡旋混匀抗体，可用手指轻弹混匀。
4、除非方案中注明，默认的抗体孵育方法是冰上或4度避光。
5、缓冲液中加BSA或FBS可以减少固定破膜后的非特异性背景。
方案A: 两步法胞内（细胞质）蛋白染色
实验材料：
12×75mm 圆底检测流式管。
[可选]可固定的活度染料eFluor® 450 (eBioscience Cat. No. 65-0863), eFluor® 660 (eBioscience Cat. No. 65-0864)，eFluor® 780 (eBioscience Cat. No. 65-0865)。
胞内抗原的直标抗体。
IC Fixation Buffer (eBioscience Cat. No. 00-8222)。
Permeabilization Buffer (10X) (eBioscience Cat. No. 00-8333)双蒸水稀释成1×。Flow Cytometry Staining Buffer (eBioscience Cat. No. 00-4222)（可以自己配置）。实验流程：
1、按照流式样品要求制备单细胞悬液。
2、按照流式表面染色方法标记CD3和CD4。缓冲液洗涤一次，离心完全弃上清。斡旋分散细胞。
3、加100ul IC Fixation buffer ，斡旋固定细胞。室温避光孵育20min。
4、每管加2ml 1×permeabilization buffer。
5、300g 室温离心5min,弃上清。
6、2ml 1×permeabilization buffer重悬细胞。
7、300g 室温离心5min,弃上清。
8、加100ul 1×permeabilization buffer 重悬细胞后，加入二抗IL-17A （或其他胞内抗原抗体），室温避光孵育20min。
9、2ml 1×permeabilization buffer洗一次，300g 室温离心5min,弃上清。
10、加2ml 流式染色液，300g 室温离心5min,弃上清。
11、适量流式染色液重悬即可上机检测。同行对照依照上述步骤进行。软件分析结果。
方案B：一步法胞内（细胞核）蛋白染色
实验材料：
12×75mm 圆底检测流式管。
[可选]可固定的活度染料eFluor® 450 (eBioscience Cat. No. 65-0863), eFluor® 660 (eBioscience Cat. No. 65-0864)，eFluor® 780 (eBioscience Cat. No. 65-0865)。
胞内抗原的直标抗体。
Foxp3 Fixation/Permeabilization Concentrate and Diluent (eBioscience Cat.
No.00-5521)
Permeabilization Buffer (10X) (eBioscience Cat. No. 00-8333)双蒸水稀释成1×。Flow Cytometry Staining Buffer (eBioscience Cat. No. 00-4222)（可以自己配置）。
注意：
Foxp3 Fixation/Permeabilization Concentrate 1份加3份Diluent 稀释为工作液（1:4稀释）。
实验方案：
1、按照流式样品要求制备单细胞悬液。
2、按照流式表面染色方法标记CD3和CD4。缓冲液洗涤一次，离心完全弃上清。斡旋分散细胞。
3、加1ml Foxp3 Fixation/permeabilization 工作液，斡旋固定细胞。室温或四度避光孵育30-60min（小鼠样品最长可以四度固定18小时）。
4、每管加2ml 1×permeabilization buffer。
5、300g 室温离心5min,弃上清。
6、2ml 1×permeabilization buffer重悬细胞。
7、300g 室温离心5min,弃上清。
8、加100ul 1×permeabilization buffer 重悬细胞后，加入二抗FOXP3 （或其他胞内抗原抗体），室温避光孵育20min。
9、2ml 1×permeabilization buffer洗一次，300g 室温离心5min,弃上清。
10、加2ml 流式染色液，300g 室温离心5min,弃上清。
11、适量流式染色液重悬，即可上机检测。同行对照依照上述步骤进行。软件分析结果。