酵母菌遗传

(1)自主复制序列ARS的结构： 酿酒酵母中，ARS是长度为100-200bp、富含AT的 DNA 片段。根据其在质粒中稳定性，可将ARS分为A、B、C三 个结构域，其中A和B最为重要。 A区：由11bp核苷酸(A／T)TTTAT(A／G)TTT(A/T)组成 的保守序列，即ARS共有序列 。 B区：位于ACS的3′末端，长度约80bp 。 C区：结构域位于ACS的5′末端，这一结构域也是富含AT， 但C结构域之间不具有同源性，也不含共有序列。
嗜杀型酵母
敏感型酵母
含L型类病毒 和M型类病毒
只含L型类病毒 不含M型类病毒
L型类病毒： 含有4.5kb的双 链RNA
M型类病毒：含 有两条1.8kb双 链RNA
不含L型类病毒 不含M型类病毒
第四节 酵母的载体系统
根据其功能可分为三大类：
克隆载体 表达载体 分泌载体 转化方法：电转化法 醋酸锂法
酿酒酵母端粒DNA的长度约为300bp，其DNA重复单位为 5′C1-3A 3′G1-3T
3.复制起点 酵母的复制起点是指染色体上控制DNA复制起始的一小段 DNA序列，通常称为自主复制序列(autonomously replicatory sequence，ARS)。
自1979年首次发现酿酒酵母的ARS以来，已在酿酒酵母中约 有400个ARS， ARS/40kb。但这些ARS的使用频率不同， 变动在0-100%之间。
第九章
酵母菌遗传
酵母菌属于真核微生物，同时又具有原核生物的某些特征。 重要的是酿酒酵母(Saccharomyces cerevtsiae)的基因组只是 大肠杆菌的2.6倍，因此酿酒酵母已成为目前在分子水平上 研究真核生物的重要材料。
第一节
酵母菌的基因组和Baidu Nhomakorabea色体
一、酵母菌的基因组
1996年完成酿酒酵母全基因组的测序，是当时完成测序的 最大基因组，也是真核生物中第一个被测序的生物。 1. 酿酒酵母的单倍体细胞含有16条染色体，总长度为 12068kb，其中第Ⅰ条染色体最短(230kb )，第Ⅳ条染色 体最长(1532kb) 。 2. 基因组中没有明显的操纵子结构，有间隔区和内含子。
•噬菌体展示（phage display） •酵母双杂交系统（yeast two-hybrid system）
一、酵母双杂交系统的作用原理
激活区 DNA 结合区 转录因子
5’ 调控位点
启动子
结构基因
待测蛋白 ？
报告基因
第五节 酵母基因表达的调控
真核生物调控的特征: 1. 真核生物基因表达的调控核心途径： 环境信号转导 染色质活化 转录的激活 2. 基因表达以正调控为主（激活蛋白激活靶基因） 3. 转录与翻译在不同的亚细胞区域进行
转录水平的调控
顺式作用元件: 影响自身基因表达活性的非编码DNA序列,包括启动子、 增强子、沉默子。 反式作用因子： 为DNA结合蛋白，核内蛋白，可使邻近基因开放（正调 控）或关闭（负调控）。包括通用转录因子和特异性转 录因子。
二、酵母菌的表达载体(YXp)
酵母的表达载体包括酵母菌的强启动子、多克隆位点、终 止子。外源结构基因插入多克隆位点的适当酶切位点，在 强启动子的调节下，外源基因就可进行高效表达。 酵母的启动子至少含有3个成分：上游激活序列(UAS)、 TATA序列和起始密码子。
三、酵母菌的分泌载体(YSp)
分泌载体是一种将基因产物分泌到胞外的一类载体。 酵母菌的分泌载体除必须含有表达载体的启动子和终止子 外，还需要在表达载体的起始密码子(ATG)的上游有分泌信 号序列。
ste6 αsg(α型细胞特异的基因） MFα1、MFα2 ste3 ste13
α-因子受体
分泌a-因子所需基因 α-因子 a-因子受体 α-因子加工
接合信息信号传递
受体
a细胞膜
两个不同的接合型细胞可以接合形成二倍体合子，相同的 接合型细胞不能接合，但是接合型a可以转变成接合型α， 相反α型也可以转变成a型，这种现象称为接合型转换 （mating type conversion）。 控制接合型转换的显性基因HO突变后，接合型转换频率 下降到10-6。由于HO基因的存在，一个只有一种接合型的 群体，无论开始的是什么接合型，在无性繁殖几代后就有 大量的两种接合型细胞。
根据dsRNA存在状态，将其分为L-型和M-型：
L型类病毒：含有4.5kb的双链RNA，称为L-dsRNA，有两 个ORF，编码L型和M型类病毒的蛋白外壳和复制类病毒 RNA的RNA聚合酶。M型和L型类病毒的蛋白外壳相同，都 是由L-dsRNA编码。 M型类病毒：含有两个相同的1.8kb双链RNA，称为MdsRNA，编码毒素蛋白，从细胞中分泌出去。
BamHI BamHI
SmaI
BamHI
His3 TEL ori/Amp Trp1 ARS1 CEN4 Sup4 URA3 TEL BamHI SmaI
TEL ori/Amp Trp1 ARS1 CEN4
URA3 TEL
SmaI
原生质体和电转化 URA3/trp ade2-1赭石突 变株红色菌落插入失活
一、克隆载体
依据酵母菌质粒载体的构成和复制方式，克隆载体分为：
整合型载体(integrative plasmid , YIp) 附加体载体(episomal plasmid , YEp) 复制型载体(replicative plasmid , YRp) 着丝粒载体(centromere plasmid , YCp) 酵母人工染色体(yeast artificial chromosome, YAC)
酵母线粒体基因组图谱
第二节
接合型基因及其基因型转换
一、酿酒酵母的生活史
二、 酵母接合型的遗传控制
酵母的有性生殖取决于两个单倍体细胞的接合型，其接合型 的“性别” 是由其本身的遗传物质所决定的，是稳定的遗 传特征。
基因 asg(a型细胞特异的基因） MFa1、MFa2 a-因子 基因产物或功能
ste2
接合型基因的转换
HO基因的转录受几种调控影响： ① HO的转录受接合型基因的调控，它不在MATa／MATα 二倍体细胞内合成。 ② HO在亲代细胞里而不是子代细胞被转录。 ③ HO的转录也与细胞周期相关，该基因只在亲代细胞G1 期末表达。
第三节
酵母菌中的质粒
一、2μm质粒
REP1 REP3
FRT
三、酵母线粒体基因组
1.呼吸缺陷突变株 吖啶黄处理野生酵母后，出现很多在好气条件下生长缓慢的 突变株，称为小菌落突变株。
分离性小菌落（染色体基因突变）：与野生型杂交后，突变: 野生=2:2 中性或营养性小菌落（线粒体隐性突变）：与野生型杂交后， 突变:野生=0:4 抑制性小菌落（线粒体显性突变）：与野生型杂交后，突变: 野生=4:0
3. 酿酒酵母染色体基因组中，有5885个可能是编码蛋白质 的ORF，每个ORF约为1.4kb，而基因间的平均间隔为 600bp。
4. ORF大约占整个基因组70%，其中一半是已知的基因或与 已知基因有关的基因，其余是新基因。 5. 酿酒酵母中约4%编码蛋白质的基因含有内含子，而在粟酒 裂殖酵母(Schizosaccha-romyces pombe)中，40%编码蛋白 质的基因具有内含子。
一、酵母基因的启动元件（顺式作用元件）
1. 2. 3. 4. 上游激活序列（upstream activating sequence UAS） TATA元件 转录起始位点 沉默子
二、转录调控因子（反式作用蛋白）
1. 通用转录因子 结合在TATA序列附近，包括TFII-A、TFII-B、 TGII-D、TFII-E、TFII-F等。 2. 转录调控因子 结合在启动子上游 转录调控蛋白由两个独立的结构域组成： DNA结合区 转录激活区
(2) ARS结合蛋白 参与的蛋白： ORC：由6个亚基组成，相当于Dna A和 λ的O蛋白，与 A/B1结合，结合于游离的DNA Mcm: DnaB 螺旋酶， Cdc6: 相当于DnaC，λ的P蛋白，使Mcm蛋白结合到复合体 上。此对在Ori上起始复制是必须的。 ABF1：转录因子，参与复制和转录。
在酿酒酵母中，所有染色体的CEN 序列的长度均大于130bp，由5′→3′ 依次分为 CDEⅠ、CDEⅡ和CDEⅢ 三个区。
2.端粒(telomere)
端粒是真核生物线性染色体两端的特殊DNA-蛋白质复合体 结构，这种复合体结构是由 DNA重复序列和与之相结合的蛋 白质分子构成的。
在大多数生物中，端粒DNA只是由几个碱基组成的DNA重复 单位通过串联重复而形成，长度从20bp到几个kb不等。
二、酵母菌的染色体结构
1.着丝粒(centromere) 着丝粒是真核细胞染色体DNA上的一段特殊序列。在有丝 分裂和减数分裂时，纺锤丝 (着丝粒结合蛋白)与着丝粒结合， 将染色体拉向细胞的两极 。
着丝粒有两种主要类型：
第一种：短着丝粒 (约200bp)，又叫点着丝粒(point centromere)，酿酒酵母的着丝粒就属于这类型 第二种：区域着丝粒(regional centromere)，其着丝粒序 列较长(从 40kb到几个Mb)，含有很多重复序列， 真菌(如脉孢菌)、果蝇、哺乳动物和人的着丝粒都 具有这种结构特征。
1．酵母整合型载体（YIp）
1个拷贝
2．酵母附加体质粒载体（YEp）
50-100个拷贝
3．酵母菌复制载体(YRp)
低拷贝，不稳定
4．酵母着丝粒载体(YCp)
低拷贝，稳定
5．酵母的人工染色体(YAC)
YAC(yeast artificial chromosome)是人工构建的具有酵母染 色体功能的人工染色体载体。 1983年Murray等人将酵母的着丝粒、自主复制序列及一些 标记基因与四膜虫大核 rDNA末端的端粒连接在一起，共同 构成了长度为55kb的酵母人工染色体。 1987年，美国华盛顿大学的Burke等人构建了能克隆大片段 的酵母人工染色体，这是真正意义上的第一代 YAC载体系 统。
REP2
FRT
REP2
A-type
FRT
B-type
FRT
FLP REP1
FLP
REP3
二、嗜杀现象 1963年，Bevan和Makower发现酿酒酵母中的某些菌株可以 产生毒素而杀死其他酵母，这种现象被称为嗜杀现象。 将产生毒素的酵母菌株称为嗜杀株(killer) 对毒素敏感的菌株称为敏感株 既不产毒素又不对毒素敏感的菌株称为中性株 酵母嗜杀现象是由两种具有自我复制能力的细胞遗传因子— —双链线状 RNA(dsRNA)决定的。
原核和真核生物复制体系：
E.coli DnaA λ O SV40/人 T抗原 酵母 ORC 功能 起始蛋白
DnaB
DnaC DnaG
DnaB
P DnaG
T抗原
? Polα-引发酶 Polδ Polδ
MCM
Cdc6 Polα-引发酶 Polδ,Polε Polδ,Polε
解旋酶
装配因子 引发酶 聚合酶 校正
PolⅢ的 α亚基 PolⅢ的ε亚基
PolⅢ的亚基
复合体 SSB
PCNA
RF-C RF-A
PCNA
RF-C RF-A
滑动钳
滑动钳装配器 单链结合蛋白
(3) ARS启动染色体复制的活性： 酒酵母基因组中约有400个ARS，但并不是所有的ARS在原 染色体上都具有自主复制活性。 对第Ⅲ染色体(62%)上的ARS进行了系统分析，ARS编号从 300到314： 其中ARS305、306、307、309和310在大多数细胞循环中都 具有复制起始活性；ARS308仅在10%～20%的细胞循环中 能起始复制；其余的ARS则在染色体上无起始复制活性。
二、转录调控因子（反式作用蛋白）
1. 通用转录因子 结合在TATA序列附近，包括TFII-A、TFII-B、 TGII-D、TFII-E、TFII-F等。 2. 转录调控因子 结合在启动子上游 转录调控蛋白由两个独立的结构域组成： DNA结合区 转录激活区
第六节
酵母双杂交系统
研究蛋白质间的相互作用的方法: •蛋白质亲和层析（protein affinity chromatography） •亲和印记（affinity blotting） •免疫共沉淀（immunoprecipitation） •交联（cross linking）（Phizicky，1995）