细菌分离及常见致病菌1
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霉菌：孟加拉红培养基、马铃薯葡萄糖培养基
鉴别培养基:培养基中加入了能与目的菌代谢产物发生 显色反应的指示剂,从而只要辨别颜色就能把目的菌 从相似的菌落中找出来。
沙门氏菌：麦康凯琼脂，SS、XLD、DHL、三糖铁琼脂 大肠杆菌：麦康凯琼脂、伊红美蓝琼脂
鉴定细菌方法
（一）传统方法： 菌落形态学观察：主要观察菌落在其适合的培养基 上的生长状况。 细菌的个体形态学观察：即通过显微镜观察。
主要按培养基功能选择： 1、基础培养基 2、选择培养基 3、鉴别培养基 4、保藏菌种用培养基
选择培养基:据特殊营养要求或对某理化因素的抗性而 设计的培养基，使得混合菌样的劣势菌变成优势菌。
细菌：改良Camp—BAP培养基（弯曲杆菌） 庆大霉素血琼脂（鼻气管鸟杆菌） 氯化镁孔雀绿肉汤、连四硫酸盐肉汤（沙门） 高盐甘露醇琼脂（葡萄球菌）
一、细菌的分离、培养和鉴定的一般步骤
需要的工具
❖ 接种工具，酒精灯，试管（塞），移液管 ❖ 冰箱4℃，-20℃，-80 ℃ ❖ 高压蒸汽灭菌锅，高温烘烤箱 ❖ 恒温培养箱（需养、厌氧） ❖ 超净工作台、生物安全柜 ❖ 制备好的培养基
接种方式
细菌分离无菌意识 生物安全防护意识
接种方法
❖ 曲线划线法、分区划线法 ❖ 倾注法、涂布法（细菌计数） ❖ 斜面接种法（生化鉴定、保存菌种） ❖ 穿刺培养法（生化鉴定、保存菌种） ❖ 液体培养基接种法
菌丝
菌丝按结构分： 有隔菌丝和无隔菌丝。
孢子形态
曲霉形态特征 有隔菌丝，有足细胞，
球形分生孢子器，分生孢 子梗顶端膨大成为顶囊， 一般呈球形。顶囊表面长 满一层或两层辐射状小梗 (初生小梗与次生小梗)。 最上层小梗瓶状，顶端着 生成串的球形分生孢子。
通过显微镜观察孢子形态来分
❖ 曲霉的分生孢子
大肠杆菌抗原性复杂，有不同的宿主范围 和致病性，判断分离菌是否有致病性通常鉴 定O抗原：用单因子O抗血清做玻片凝集或试 管凝集鉴定。
❖ 常见的致病性的血清型有O1、O2、O35、O36、 O78、O157等。
（2）沙门氏菌
鸡白痢和禽伤寒：无运动性，主要感染禽类 禽副伤寒：有运动性，感染人和动物
培养特性
菌落形态
紫黑色，有绿色金 属光泽
粉色，中心色深 粉色，中心色深
无色 无色 无色
麦康凯培养基
❖ 菌落呈现粉红色或桃 红色
❖ 沙门氏菌为无色浅黄 色
大多数在正常条件下是不致病的共栖菌，在特 定条件下可致病，病原性大肠杆菌正常情况下极少 存在于健康机体。
抗原结构 180个O抗原（菌体抗原） 60个H抗原（鞭毛抗原） 80个K抗原（荚膜抗原）
木糖赖氨酸去氧胆酸 钠琼脂（XLD）和SS 培养基
多数菌株产生大 的有光泽的黑色中心 或几乎全黑色。
❖ 急性感染：具有高度侵袭性，很多内脏组织中都可 作为诊断培养的样品。
❖ 慢性感染或常规检测：无明显病变，应采集几种脏 器进行单独或一起培养。
直接接种至固体培养基
研磨后接种至选择性增菌液体培养基，转至鉴别固 体培养基上
养殖场常见细菌&霉菌的分离与鉴定
中国农业大学畜禽疫病诊断中心 徐阳
2016.07.04
细菌分离基本方法 常见致病细菌的分离及初步鉴别 常见霉菌的分离及初步鉴别
养殖场进行细菌分离鉴定的意义
大部分细菌通常以条件致病菌的形式存在于环 境及鸡体。当个体因受到应激或者其他病原微生物 感染导致抵抗力下降时，条件致病菌就会导致继发 感染，从而造成很大的经济损失。一旦继发感染发 生，此时首先应该控制细菌问题，而细菌的分离鉴 定是明确病原的有效途径。
常见致病细菌
（1）禽致病性大肠杆菌（APEC）
肠杆菌科代表菌属：埃希菌属 本属5个种，代表种：大肠埃希菌，俗称大肠杆菌
病原分离
1. 可引起局部或全身性感染：从典型的病变中可分离 和鉴定到大肠杆菌，注意：病料避免受到粪便的污染。
2. 死禽中分离到的大肠杆菌结果判定应谨慎，大肠杆 菌能从肠道迅速扩散至组织中。
❖ 革兰氏阴性菌，需养及兼性厌氧。 ❖ 在普通培养基上生长良好，形成中等大小、圆形、表面光滑、
无色半透明、边缘整齐的菌落，其菌落特征与大肠杆菌相似。 ❖ 鉴别培养基：如麦康凯、伊红美蓝一般为无色菌落，XLD、
HE、DHL 、SS一般为黑色菌落。
HE琼脂
菌落为蓝绿色 至蓝色，多数菌株 产生大的有光泽的 黑色中心或几乎全 黑色。
青霉的分生孢子
⒈ 采集相应的病变部位，选择适宜的培养基。
2、解剖病料及送检病料置于干净或无菌容器中，将表 面杂菌清除，接种环烧红冷却后（或无菌棉签）接 触病变部位内部，平板划线。
3、病料涂片或触片，染色，作出初步判断。
4、平板倒置于37℃ 恒温培养箱培养24h后，观察细菌 生长状况。
1、观察菌落是否在划线上，多数情况下，沿划 线生长较多的菌落，是待检病原菌的可能性 较大。
2、 检查细菌的形态学特征（菌落的形状、大 小、色泽、边缘、透明度、湿润度、溶血现 象等）。
3、涂片染色检查，观察是否与目的菌一样。
分离较难培养的病原菌、杂菌较多或目的菌 含量过少时： ❖ 取多种组织分别培养 ❖ 病料研磨处理，预增菌或选择性液体增菌 ❖ 培养基添加抗生素等
如何选择培养基提高目的菌的分离率？
养时间颜色有变化 性状：绒毛状，粉末状，絮状，颗粒状，棉花状等 边缘：整齐，锯齿状、树枝状
曲霉菌落
毛霉和青霉菌落
常见霉菌wenku.baidu.com微镜下的初步鉴别
水浸片置于显微镜下观察 ❖ 菌丝 ❖ 孢子形态。
于洁净载玻片上，用解剖针（钩）从霉菌菌落 的边缘处取少量带有孢子的菌丝置于小滴生理盐水 中，再将菌丝挑散开，然后小心地盖上盖玻片，轻 压，注意不要产生气泡。置显微镜下先用低倍镜观 察，必要时再换高倍镜。
形态学鉴定辅以生化试验在细菌鉴定中具有 重要的意义（生化鉴定管、药敏实验等） 。
细菌的生化鉴定
不同细菌有不同的代谢类型，与各种试剂表现 不同反应，故用生化反应来鉴别细菌：
1、蛋白质和氨基酸的代谢试验：吲哚和硫化氢试验 2、碳源和氮源利用试验：柠檬酸盐利用试验 3、碳水化合物代谢试验：糖发酵试验、甲基红 （MR）试验、V—P试验 4、各种酶类试验：硝酸还原酶试验、淀粉水解试验
GB/T4789.4－2010沙门氏菌检验流程
前增菌：用无选择性的培 养基使处于濒死状态的细 菌恢复活力：BPW
选择性增菌：使沙门氏菌 优势繁殖，其它细菌变到 抑制：SC+TTB
选择性鉴别培养： BS+XLD/HE/显色培基
生化试验：鉴定分离出来 的细菌是否符合沙门氏菌 的生化谱
血清学鉴定：特异性诊断 血清鉴定到种。
毛霉形态特征（与根霉 相似）
菌丝体上直接生出 单生、总状分枝或假轴 状分枝的孢囊梗。各分 枝顶端着生球形孢子囊， 内有形状各异的囊轴， 但无囊托。囊内产生大 量球形、椭圆形、壁薄、 光滑的孢囊孢子。
毛霉的孢囊孢子
根霉与毛霉主要区别：有无匍匐枝、假根和囊托
青霉形态特征
有隔多核的 多细胞菌丝,扫 帚状的分生孢子 头,分生孢子多 呈蓝绿色。
常见霉菌的分离及鉴定
主要病原：烟曲霉，黄曲霉，黑曲霉， 青霉，头孢霉，毛霉等。
❖ 将病料（主要病变于肺和气囊）剪碎后接种于马铃 薯葡萄糖培养基或沙氏培养基等其他真菌培养基， 生长后进行鉴定，一般为3-5天。
❖ 点植法（固体） ❖ 划线法（液体）
霉菌的菌落特征
菌落特征是鉴定霉菌的重要依据之一。 大小：生长大小和培养时间有关 形态：平滑，凹或凸，同心圆，放射沟纹状等 颜色：褐色、绿色、黑色、黄色等，正面、背面颜色，不同培
标准方法适用范围
❖ 鸡的组织样品、蛋内容物 ❖ 肠内容物、粪便、环境拭子、蛋壳
（3）传染性鼻炎
❖ 病原：副鸡嗜血杆菌 ❖ 本菌定殖于禽的上呼吸道及窦腔，离开活体很快死
亡。 ❖ 将无菌棉拭子伸入窦腔深部，沾取渗出物。
病原分离
❖ 在血琼脂平板上划横线，再接种上葡萄球菌 （该菌在普通培养基上不生长），置于厌氧 环境中培养，在葡萄球菌菌落边缘可长出一 种细小的卫星菌落。
3. 对采集的病变组织进行无菌划线操作接种到鉴别培 养基上如麦康凯培养基、伊红美蓝琼脂培养基（见下图）， 或者置于普通肉汤中进行增菌培养后接种到鉴别培养基上。
大肠杆菌测定——EMB选择性分离鉴别
EMB平板典型大肠杆 菌菌落特征： 中心黑色或紫红色，有 金属光泽。
菌名
大肠埃希氏菌
肺炎克雷伯氏菌 阴沟肠杆菌 弗氏志贺氏菌 鼠伤寒沙门氏菌 粪链球菌
1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml
液体样品10倍稀释
9 ml 9 ml 9 ml 9 ml 9 ml 9 ml
10
102 103 104 105 106 107
倾注法：各取1 ml 菌液至平皿再倾注培养基与菌液混匀；
涂布法：各取0.1 ml菌液至制备好的培养基上涂布均匀。
病料直接接种固体培养基方法
鉴别培养基:培养基中加入了能与目的菌代谢产物发生 显色反应的指示剂,从而只要辨别颜色就能把目的菌 从相似的菌落中找出来。
沙门氏菌：麦康凯琼脂，SS、XLD、DHL、三糖铁琼脂 大肠杆菌：麦康凯琼脂、伊红美蓝琼脂
鉴定细菌方法
（一）传统方法： 菌落形态学观察：主要观察菌落在其适合的培养基 上的生长状况。 细菌的个体形态学观察：即通过显微镜观察。
主要按培养基功能选择： 1、基础培养基 2、选择培养基 3、鉴别培养基 4、保藏菌种用培养基
选择培养基:据特殊营养要求或对某理化因素的抗性而 设计的培养基，使得混合菌样的劣势菌变成优势菌。
细菌：改良Camp—BAP培养基（弯曲杆菌） 庆大霉素血琼脂（鼻气管鸟杆菌） 氯化镁孔雀绿肉汤、连四硫酸盐肉汤（沙门） 高盐甘露醇琼脂（葡萄球菌）
一、细菌的分离、培养和鉴定的一般步骤
需要的工具
❖ 接种工具，酒精灯，试管（塞），移液管 ❖ 冰箱4℃，-20℃，-80 ℃ ❖ 高压蒸汽灭菌锅，高温烘烤箱 ❖ 恒温培养箱（需养、厌氧） ❖ 超净工作台、生物安全柜 ❖ 制备好的培养基
接种方式
细菌分离无菌意识 生物安全防护意识
接种方法
❖ 曲线划线法、分区划线法 ❖ 倾注法、涂布法（细菌计数） ❖ 斜面接种法（生化鉴定、保存菌种） ❖ 穿刺培养法（生化鉴定、保存菌种） ❖ 液体培养基接种法
菌丝
菌丝按结构分： 有隔菌丝和无隔菌丝。
孢子形态
曲霉形态特征 有隔菌丝，有足细胞，
球形分生孢子器，分生孢 子梗顶端膨大成为顶囊， 一般呈球形。顶囊表面长 满一层或两层辐射状小梗 (初生小梗与次生小梗)。 最上层小梗瓶状，顶端着 生成串的球形分生孢子。
通过显微镜观察孢子形态来分
❖ 曲霉的分生孢子
大肠杆菌抗原性复杂，有不同的宿主范围 和致病性，判断分离菌是否有致病性通常鉴 定O抗原：用单因子O抗血清做玻片凝集或试 管凝集鉴定。
❖ 常见的致病性的血清型有O1、O2、O35、O36、 O78、O157等。
（2）沙门氏菌
鸡白痢和禽伤寒：无运动性，主要感染禽类 禽副伤寒：有运动性，感染人和动物
培养特性
菌落形态
紫黑色，有绿色金 属光泽
粉色，中心色深 粉色，中心色深
无色 无色 无色
麦康凯培养基
❖ 菌落呈现粉红色或桃 红色
❖ 沙门氏菌为无色浅黄 色
大多数在正常条件下是不致病的共栖菌，在特 定条件下可致病，病原性大肠杆菌正常情况下极少 存在于健康机体。
抗原结构 180个O抗原（菌体抗原） 60个H抗原（鞭毛抗原） 80个K抗原（荚膜抗原）
木糖赖氨酸去氧胆酸 钠琼脂（XLD）和SS 培养基
多数菌株产生大 的有光泽的黑色中心 或几乎全黑色。
❖ 急性感染：具有高度侵袭性，很多内脏组织中都可 作为诊断培养的样品。
❖ 慢性感染或常规检测：无明显病变，应采集几种脏 器进行单独或一起培养。
直接接种至固体培养基
研磨后接种至选择性增菌液体培养基，转至鉴别固 体培养基上
养殖场常见细菌&霉菌的分离与鉴定
中国农业大学畜禽疫病诊断中心 徐阳
2016.07.04
细菌分离基本方法 常见致病细菌的分离及初步鉴别 常见霉菌的分离及初步鉴别
养殖场进行细菌分离鉴定的意义
大部分细菌通常以条件致病菌的形式存在于环 境及鸡体。当个体因受到应激或者其他病原微生物 感染导致抵抗力下降时，条件致病菌就会导致继发 感染，从而造成很大的经济损失。一旦继发感染发 生，此时首先应该控制细菌问题，而细菌的分离鉴 定是明确病原的有效途径。
常见致病细菌
（1）禽致病性大肠杆菌（APEC）
肠杆菌科代表菌属：埃希菌属 本属5个种，代表种：大肠埃希菌，俗称大肠杆菌
病原分离
1. 可引起局部或全身性感染：从典型的病变中可分离 和鉴定到大肠杆菌，注意：病料避免受到粪便的污染。
2. 死禽中分离到的大肠杆菌结果判定应谨慎，大肠杆 菌能从肠道迅速扩散至组织中。
❖ 革兰氏阴性菌，需养及兼性厌氧。 ❖ 在普通培养基上生长良好，形成中等大小、圆形、表面光滑、
无色半透明、边缘整齐的菌落，其菌落特征与大肠杆菌相似。 ❖ 鉴别培养基：如麦康凯、伊红美蓝一般为无色菌落，XLD、
HE、DHL 、SS一般为黑色菌落。
HE琼脂
菌落为蓝绿色 至蓝色，多数菌株 产生大的有光泽的 黑色中心或几乎全 黑色。
青霉的分生孢子
⒈ 采集相应的病变部位，选择适宜的培养基。
2、解剖病料及送检病料置于干净或无菌容器中，将表 面杂菌清除，接种环烧红冷却后（或无菌棉签）接 触病变部位内部，平板划线。
3、病料涂片或触片，染色，作出初步判断。
4、平板倒置于37℃ 恒温培养箱培养24h后，观察细菌 生长状况。
1、观察菌落是否在划线上，多数情况下，沿划 线生长较多的菌落，是待检病原菌的可能性 较大。
2、 检查细菌的形态学特征（菌落的形状、大 小、色泽、边缘、透明度、湿润度、溶血现 象等）。
3、涂片染色检查，观察是否与目的菌一样。
分离较难培养的病原菌、杂菌较多或目的菌 含量过少时： ❖ 取多种组织分别培养 ❖ 病料研磨处理，预增菌或选择性液体增菌 ❖ 培养基添加抗生素等
如何选择培养基提高目的菌的分离率？
养时间颜色有变化 性状：绒毛状，粉末状，絮状，颗粒状，棉花状等 边缘：整齐，锯齿状、树枝状
曲霉菌落
毛霉和青霉菌落
常见霉菌wenku.baidu.com微镜下的初步鉴别
水浸片置于显微镜下观察 ❖ 菌丝 ❖ 孢子形态。
于洁净载玻片上，用解剖针（钩）从霉菌菌落 的边缘处取少量带有孢子的菌丝置于小滴生理盐水 中，再将菌丝挑散开，然后小心地盖上盖玻片，轻 压，注意不要产生气泡。置显微镜下先用低倍镜观 察，必要时再换高倍镜。
形态学鉴定辅以生化试验在细菌鉴定中具有 重要的意义（生化鉴定管、药敏实验等） 。
细菌的生化鉴定
不同细菌有不同的代谢类型，与各种试剂表现 不同反应，故用生化反应来鉴别细菌：
1、蛋白质和氨基酸的代谢试验：吲哚和硫化氢试验 2、碳源和氮源利用试验：柠檬酸盐利用试验 3、碳水化合物代谢试验：糖发酵试验、甲基红 （MR）试验、V—P试验 4、各种酶类试验：硝酸还原酶试验、淀粉水解试验
GB/T4789.4－2010沙门氏菌检验流程
前增菌：用无选择性的培 养基使处于濒死状态的细 菌恢复活力：BPW
选择性增菌：使沙门氏菌 优势繁殖，其它细菌变到 抑制：SC+TTB
选择性鉴别培养： BS+XLD/HE/显色培基
生化试验：鉴定分离出来 的细菌是否符合沙门氏菌 的生化谱
血清学鉴定：特异性诊断 血清鉴定到种。
毛霉形态特征（与根霉 相似）
菌丝体上直接生出 单生、总状分枝或假轴 状分枝的孢囊梗。各分 枝顶端着生球形孢子囊， 内有形状各异的囊轴， 但无囊托。囊内产生大 量球形、椭圆形、壁薄、 光滑的孢囊孢子。
毛霉的孢囊孢子
根霉与毛霉主要区别：有无匍匐枝、假根和囊托
青霉形态特征
有隔多核的 多细胞菌丝,扫 帚状的分生孢子 头,分生孢子多 呈蓝绿色。
常见霉菌的分离及鉴定
主要病原：烟曲霉，黄曲霉，黑曲霉， 青霉，头孢霉，毛霉等。
❖ 将病料（主要病变于肺和气囊）剪碎后接种于马铃 薯葡萄糖培养基或沙氏培养基等其他真菌培养基， 生长后进行鉴定，一般为3-5天。
❖ 点植法（固体） ❖ 划线法（液体）
霉菌的菌落特征
菌落特征是鉴定霉菌的重要依据之一。 大小：生长大小和培养时间有关 形态：平滑，凹或凸，同心圆，放射沟纹状等 颜色：褐色、绿色、黑色、黄色等，正面、背面颜色，不同培
标准方法适用范围
❖ 鸡的组织样品、蛋内容物 ❖ 肠内容物、粪便、环境拭子、蛋壳
（3）传染性鼻炎
❖ 病原：副鸡嗜血杆菌 ❖ 本菌定殖于禽的上呼吸道及窦腔，离开活体很快死
亡。 ❖ 将无菌棉拭子伸入窦腔深部，沾取渗出物。
病原分离
❖ 在血琼脂平板上划横线，再接种上葡萄球菌 （该菌在普通培养基上不生长），置于厌氧 环境中培养，在葡萄球菌菌落边缘可长出一 种细小的卫星菌落。
3. 对采集的病变组织进行无菌划线操作接种到鉴别培 养基上如麦康凯培养基、伊红美蓝琼脂培养基（见下图）， 或者置于普通肉汤中进行增菌培养后接种到鉴别培养基上。
大肠杆菌测定——EMB选择性分离鉴别
EMB平板典型大肠杆 菌菌落特征： 中心黑色或紫红色，有 金属光泽。
菌名
大肠埃希氏菌
肺炎克雷伯氏菌 阴沟肠杆菌 弗氏志贺氏菌 鼠伤寒沙门氏菌 粪链球菌
1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml
液体样品10倍稀释
9 ml 9 ml 9 ml 9 ml 9 ml 9 ml
10
102 103 104 105 106 107
倾注法：各取1 ml 菌液至平皿再倾注培养基与菌液混匀；
涂布法：各取0.1 ml菌液至制备好的培养基上涂布均匀。
病料直接接种固体培养基方法