破坏性试验

破坏性试验—专属性考察

破坏性试验，也称为强制降解试验（stressing test），它是在人为设定的特殊条件下，如酸、碱、氧化、高温、光照、水解等，引起药物的降解，通过对降解产物的测定，验证检测方法的可行性，分析药物可能的降解途径和降解机制。

每项破坏性试验通常包括以下内容：酸降解一般采用0.1mol/L－1mol/L盐酸或硫酸；碱降解采用0.1mol/L－1mol/L的氢氧化钠溶液；氧化降解采用合适的过氧化氢溶液。以上三种试验，为了加快反应或者提高降解强度，必要时可以加热或提高浓度；高温试验通常温度高于加速试验温度的10℃，如50℃、60℃等，对于原料药有时需考虑水溶液或混悬液的降解，或者考虑在不同的pH值条件下的降解；光照试验条件可采用4500LX。

破坏性试验的具体条件，与具体药物密切相关，需结合具体药物的特点，选择合适的条件，使药物有一定量的降解，并对可能的降解途径和降解机制进行分析，保证实验的意义。

药物经强力破坏产生的降解产物通常采用色谱法测定，需结合药物和可能降解产物的理化性质，选择不同的色谱方法（HPLC、GC、TLC）或检测器，有时可采用不同分离机理的色谱系统。下面以HPLC法分析降解产物为例，说明在进行破坏性试验时的关注点和存在的问题：

1、在选定的破坏条件下，药物应有一定量的降解。

虽然不是每一种破坏性条件都使药物产生降解产物，但一般情况下，很少有一种化合物对每一种破坏性试验条件都稳定，因此，可以通过试验，选择合适的条件，如提高酸、碱、氧化的浓度或者通过加热等，使药物降解。

对于采用HPLC法测定降解产物时，以主成分计算，一般降解10%左右。应采用有效的方法对降解产物进行检测，关注测定的回收量，通常应达到90%左右，证明检测方法的有效性。

对于破坏性试验时降解量较大的降解产物，建议结合稳定性研究中加速试验和长期试验的具体杂质资料，参考ICH对新原料药中杂质的规定（每日服用最大剂量不超过2克时，鉴定阈值为0.10%；每日服用最大剂量超过2克时，鉴定阈值为0.05%。），必要时进行定性分析，并作为已知杂质，根据安全性资料，采用已知杂质对照，确定合理的限度，订入质量标准。不能采用已知杂质进行对照时，可通过测定降解产物、主成分在测定波长处的吸收系数，分析两者的差异。若两者吸收系数相差较大时，建议采用响应因子校正后进行有效控制；如果两者吸收系数相差较小，建议采用自身对照法或峰面积归一化法进行有效控制。

药物进行破坏性试验时通常降解为小分子物质，但也有发生聚合，形成聚合物，如β－内酰胺类抗菌药物，在高温或高湿时有可能产生聚合物，故应采取有效方法进行检测。在这方面存在的主要问题是：（1）主药完全降解，无法对降解产物进行有效检测；（2）由于选择的降解条件强度不够，使药物未能降解，而误认为药物稳定；（3）不能选择合适测定方法，测定降解产物，使主成分降解后测定的回收量偏低；（4）未考虑破坏性试验时产生的聚合物；（5）选择的色谱流动相不合适，在图谱中有干扰峰。

2、分离度与峰纯度分析

破坏性试验产生的降解产物的个数比较多，采用HPLC法测定时，需考虑主成分与降解产物之间、降解产物相互之间的分离度，保证降解产物峰与主峰、降解产物峰之间有良好的分离度。另外，对于原料药，分离度符合要求也应考虑到主药与起始原料、各合成中间体是否有良好的分离度；对于制剂，应注意辅料、辅料降解产物的干扰。色谱条件的确定通常以最难分离的两个降解产物或降解产物与主成分之间的分离度符合要求作为依据之一。鉴于降解产物检测时对分离度要求高，故推荐色谱分析时采用梯度洗脱，以有效分离降解产物。与分离度密切相关的是峰纯度分析。检测峰纯度通常采用二级管数组检测器或者液质连用技术分析测定各色谱峰的纯度，说明在主峰中、各降解产物峰中有没有包含其它峰。简单地通

过观察峰形判断峰的纯度没有说服力。

对于创新药物的破坏性试验来说，峰纯度分析非常重要，一是可以了解降解产物的特性；二是可以有效地检出和控制杂质。存在的主要问题是：（1）主峰上出现明显的降解产物峰，测定方法不可行；（2）未对峰纯度进行有效分析，这是一种常见现象，在此情况下无法判断主峰中是否包含着降解产物峰；（3）对于制剂，未考虑辅料降解对测定结果的干扰。

3、检测灵敏度的考虑

对破坏性试验产生的降解产物，通常考虑采取改变测定波长，来分析和检测降解产物峰个数和含量，确定合理的检测条件和方法。这也是测定波长确定的重要依据之一。必要时可采用不同机理的色谱系统检测降解产物。原则上讲，所选择的杂质检测方法应能测定破坏性试验中药物的每个降解产物（而且也考虑到起始原料、每个合成中间体的检出），从而达到对降解产物的控制，同时只有这样，才能保证有合适的回收量。目前在审评中发现存在的主要问题是仅提供主成分的检测限，以主成分的检测限作为测定波长确定的依据，而忽视对部分降解产物（包括起始原料和中间体）的检出，最终体现在降解的回收量达不到一定的要求，仅有药物降解，没有降解产物检出。

充分认识破坏性试验在杂质检测方法建立中的重要意义，建立科学合理的杂质检测方法，对于保证临床用药安全起着重要作用。

强制降解试验是指将原料药或制剂置于比较剧烈的试验条件下，考察其稳定性的一系列试验。一般而言，该试验的目的主要有以下两方面：一是通过考察药品在一系列剧烈条件下的稳定性，了解该药品内在的稳定特性及其降解途径与降解产物。例如，通过高温降解试验，可以了解所考察的药品在高温条件下是否稳定；如果不稳定，大致在何种条件下不稳定，该药品又是通过何种降解途径得到何种降解产物。其二，这些试验也能在一定程度上对有关物质分析方法用于检查降解产物的专属性进行验证。

对于创新药，由于对其各方面的性质均不够了解，因此，通过设计比较完整的强制降解试验，可以比较全面地了解其稳定特性，从而为制剂处方、工艺的设计，以及产品储存条件的确定等提供有益的参考。所以对于创新药而言，通过强制降解试验来了解药物的稳定特性就显得尤为重要。对于仿制药而言，如果已有充分的文献数据对该药物的稳定特性及其降解途径与降解产物进行比较全面的阐述，则没有必要再通过强制降解试验来重复了解这些背景知识。此时，强制降解试验的目的主要就是为了验证降解产物分析方法的专属性。并且，由于国内在进行有关物质研究时，一般不对各有关物质进行定性研究，也无相应的杂质对照品，所以在对有关物质的分析方法进行验证时，很难用杂质对照品对方法的专属性、检测限等进行验证。故作为对有关物质分析方法验证的一种补充，国内在制定相关指导原则时，要求对原料药及制剂进行必要的强制降解试验，以考察分析方法的可靠性。

根据强制降解试验的目的，该项试验一般应考察药品在酸、碱、高温、强光、氧化等因素影响下的稳定性。对固体状态的原料药而言，一般还需分别考察该原料药在固体和溶液状态下的稳定性。另外，为全面了解该药品的稳定特性及其降解途径，还可根据情况进行以上因素综合存在时的强制降解试验，例如，可以考察样品溶液分别在中性、酸性或碱性条件下对高温或强光的稳定性等。

在设计各项目的具体试验条件时，应结合该药的剂型、工艺条件等进行综合考虑，只要达到了强制降解试验的目的，所选的试验条件就是合理的。由于各药品的化学结构、剂型、工艺条件等各有不同，很难提出一个统一的试验条件，下面所介绍的各降解试验的条件仅供大家在研究中参考：

1．酸降解试验一般选择0.1N的盐酸，在室温或加热条件下进行考察。酸液的浓度、考察的温度与时间均可根据具体品种，在前期预试验的基础上灵活确定。

2．碱降解试验一般选择0.1N的氢氧化钠溶液，在室温或加热条件下进行考察。