免疫层析(金标)产品的不可控性

一、抓不住的胶体金

一个看似简单的胶体金的制备过程，其实有相当复杂的控制工艺，稍有偏差，就会导致生产出劣质、性能差及重现性极差的产品进而影响其商业用途。将这样的产品应用于快速检测中可能导致结果的低稳定性、低敏感性及低特异性。

在胶体金的制备过程中，需要把氯金酸还原成金原子。加入还原剂之后，溶液中金原子的含量上升并达到过饱和，并在核化过程中发生凝集作用，形成由11个金原子构成的中央的二十面体金核心。

最初形成的核数目决定了最终将有多少颗粒形成于溶液中，还原剂越多产生的晶核越多从而产生的金颗粒也越多。显而易见，在一个含既定数目氯化金的溶液中，形成的核化位点的数目越多，最终形成的每个金颗粒的尺寸就越小。因而微粒的大小可通过所加入的还原剂的量来精细调控。如果溶液中所有的核化位点都可以在瞬间同时发生，所形成的金颗粒大小都完全一致。要做到这一点（同步核化）是非常困难的，常会发生核化过程的不均一及多分散性胶体的产生，最终导致产品的重复性低下、交联物不稳定。

胶体金及交联物的生产制造表面看似简易，若掉以轻心则如果还原过程中核化作用及形成速度没有得到很好控制，粒子的形成就会不均一。这样的粒子在与蛋白的结合过程中将无法被均匀包被，也不能在溶液中均匀分布。仅仅5%形状不均一的粒子都会影响测试的结果，使其完全不具重现性，而这种不稳定性更容易造成错误的结果。更严重的是，粒子形状及尺寸的不均一会导致蛋白包被的不均一，这样会导致交联物长时间的积聚与凝集，储存于溶液中的交联物可能于几天甚至几个小时内就出现这样的变化。即使立即将交联物干燥于固相基质上也无法完全克服这个问题，在干燥过程中，由于粒子形状而未稳定结合的表面蛋白很容易分离，造成假阳性及高背景。

这也就是为什么胶体金标记的产品批间差较大（30%）的原因，因为每一批胶体金在制备过程存在天然的不可控性（氧化还原的过程），直接影响到每批胶体金的颗粒大小，颗粒分布比例，颗粒稳定性都不一样。直接影响到最终产品的灵敏度，重复性，带来较大的假阴性，假阳性。

二、摸不透的NC膜

免疫层析产品的基材就是NC膜，前面的文章中已描述过NC膜的制备工艺，NC膜的性能差异会带来什么问题呢？

首先，因为不同膜生产厂家制备工艺的不同，得到NC膜的孔径有较大差异，孔径直接影响了膜的流动性能，流动性是免疫反应的基础，流动的差异直接影响检测结果。这里涉及到一个膜的分类标准问题，一个供应商可能提供这个膜是8um，但另一个供应商告诉你膜是135s的。这之间的区别与联系是什么？

um指的是膜孔径，而从上面膜的生产过程，我们可以看出，膜的孔径实际上是没有办法界定的。由于干燥成型等过程的非绝对均一，膜的孔径也是非均一的。膜孔径的说法实际上是沿用了一直以来的一个形象称呼。而以秒为单位的定义为，每4cm膜，水的层析时间是***s，该单位已经越来越被各大厂商所接受，成为了一个通用的比较标准.以下我们将采用s单位来进行交流。

换算情况大致为：8um=135s；6um=180s，所以NC膜的最终性能是没办法掌握的。

其次，NC膜会老化，因为膜上的水分蒸发，使膜变得疏水，带电荷并变脆。储存膜一般要求是避光，密封，过干或过湿都不利。有些膜由于生产工艺的问题，使用后灵敏度会在一段时间内发生变化，遇到这种问题，就需要在点膜后放置一段时间，待稳定后方可进入调试生产，而这一时间只能靠经验来判断。而一旦NC膜的性能发生改变，这些经验就用不上了。

由上述情况可见，NC膜的性能受到制膜工艺的影响，孔径、均一性、反应时间、稳定性有较大波动，摸不透的NC膜的性能直接影响了免疫层析反应中的各个性能指标，这也是免疫层析类产品只能用于定性半定量检测的根本原因。

三、灵敏度和特异性

免疫层析反应需要解决的重要问题是检测灵敏度和特异性。

我们分析一下液体在膜上的运动过程：跑水过程，这是衡量NC膜好坏的重要指标。在膜上每隔1cm 做一个标记，当液体运动过标记处时记录时间点. 那么你将会发现液体在膜上的运动是呈减速前行的。而两张不同秒数的膜（例如135s，180s）在同一时间标记点处的运动速度不同。不同批次的膜跑水速度存在较大差异，即便同一张膜也不能保证所有位置跑水速度完全一致，有些位置跑水快一些，有些位置跑水慢一些。所以从一大块膜上裁切得到的每一块小的NC膜，可能存在完全不一致的跑水特性，这样的两个NC膜的反应灵敏度和特异性可能完全不一样。

从上述试验可以看出，在通过同一T线喷点位置时，金溶液通过的速度是快速膜>慢速膜。那么通过速度越快和包被在T线的物质反应时间也就越短，反应时间快，那么灵敏度也就越低。反之，反应时间长，读数慢，也就灵敏度高。为了保证检测项目的灵敏度，免疫层析的方法只能使用较长的反应时间。

然而，并不是反应时间越长越好，反应时间越长，发生非特异性结合的可能性就越大，所以过长时间的反应不一定就能够真正的提升灵敏度（反而会带来特异性的减弱）。所以免疫层析类产品都存在反应时间/反应灵敏度/非特异性结合的均衡，无法做到既保证反应时间短，又有较好的灵敏度和特异性。