蛋白酶的原生质体转化育种
水稻转基因育种的研究进展与应用现状
水稻转基因育种的研究进展与应用现状刘志宏1 田 媛2 陈红娜1 周志豪1 郑 洁2 杨晓怀1（1深圳市农业科技促进中心，广东深圳518000；2暨南大学食品科学与工程系，广东广州510632）摘要：随着生物技术发展的不断深入，我国水稻种业的发展也面临着全新的机遇和挑战。
目前，改善水稻品种质量的主要方法有分子标记技术、基因编辑技术和转基因技术。
其中，转基因水稻是利用生物技术手段将外源基因转入到目标水稻的基因组中，通过外源基因的表达，获得具有抗病、抗虫、抗除草剂等优良性状的水稻品种。
近年来，国内外在采用转基因技术进行水稻育种，提升水稻产量、改善水稻品质方面具有较多的研究进展。
在阐述转基因技术工作原理的基础上，概述国内外利用转基因技术在优质水稻育种方面的研究进展，进一步探究转基因技术在我国水稻育种领域的发展前景。
关键词：转基因育种；水稻；病虫害；除草剂Research Progress and Application Status of Rice Transgenic Breeding LIU Zhihong1，TIAN Yuan2，CHEN Hongna1，ZHOU Zhihao1，ZHENG Jie2，YANG Xiaohuai1（1Shenzhen Agricultural Technology Promotion Center，Shenzhen 518000，Guangdong；2Department of Food Science and Engineering，Jinan University，Guangzhou 510632）水稻（Oryza sativa L.）作为世界上重要的粮食作物之一，为世界超过1/3的人口提供了主粮，全球种植面积约1.4亿hm2[1]。
“十二五”以来，我国水稻产量连续稳定在2亿t以上[2]。
水稻作为我国的主要粮食作物，在我国粮食生产领域占据着十分重要的地位，水稻品种改良仍是保障种业持续发展和国家粮食安全的重点。
微生物育种资料名词解释1．富集培养目的微生物含量较少时，根据
微生物育种资料名词解释1．富集培养：目的微生物含量较少时，根据微生物生理特点，设计一种选择性培养基，创造有利生长条件，是目的微生物在最适环境下迅速生长繁殖，数量增加，由劣种变为优势种，以利用分离所需要的菌种。
2．营养缺陷型：野生型菌株经过人工诱变或自然突变失去合成某种营养（氨基酸、维生素、核酸等）的能力，只有在基本培养基中补充所缺失的营养因子才能生长。
3．常规杂交育种：通过接合、转化、转导、溶源转化和转染等方式来获得重组体的杂交育种方法。
4．原生质体融合育种：通过酶解破除细胞壁后，制备微生物原生质体，然后诱导原生质体融合杂交，双亲本不受亲和力限制，甚至可以打破种属间遗传障碍。
获得远缘杂交重组体的特殊方式。
5．原生质体再生育种：微生物制备原生质体后直接再生，从再生菌落中分离筛选变异菌株，最终得到优良性状提高的正变菌株。
6．原生质体诱变育种：以微生物原生质体为育种材料，采用物理或化学诱变剂处理，然后分离到再生培养基中再生，并从再生菌落中筛选高产突变菌株。
解答1．工业生产的微生物菌种的特性①在遗传上必须是稳定的②易于产生许多营养细胞、包子或其他繁殖体②必须是纯种，不应带有其他杂菌及噬菌体④种子的生长必须旺盛、迅速⑤产生所需要的产物时间短⑥比较容易分离提纯⑦有自身保护机制，抵抗杂菌污染能力强⑧能保持较长的良好经济性能⑨菌株诱变处理较敏感，从而可以选育出高产菌株⑩在规定时间内，菌株必须产生与其数量的目的产物，并保持相对地稳定2．工业微生物的发展史（1）诱变育种。
以人工诱变手段诱发微生物基因突变，改变遗传结构和功能，通过筛选，从多种多样的变异体中筛选出产量高、性状优良的变异株，并找出发挥这个变株最佳培养基和培养条件，使其在最是环境条件下合成有效产物。
（2）杂交育种。
使双亲或多亲的遗传物质重新组合，以获得综合双亲优良性状的新品种的育种方法。
（3）代谢控制育种。
进行内因改变，通过定向选育某种特定的突变型，以达到大量积累由于产物的目的，定向选育包括改变代谢代谢通路；降低支路代谢终产物产生或切断支路代谢途径及提高细胞膜通透性。
第七章 工业微生物原生质体育种和原生质体融合
4)存在着两株以上亲株同时参与融合形成融
合子的可能性。
5)有可能采用产量性状较高的菌株作融合 亲株。 6)提高菌株产量的潜力较大。 7)有助于建立工业微生物转化体系。
四、细胞融合过程
显微镜下的原生质体融合
融合过程中细胞膜变化
类脂质分子发生扰动和重排 导致细胞桥的形成 细胞质、核相互融合
都需要带有可以识别的遗传标记，如营养缺陷型 或抗药性等
2、原生质体融合的方法
物理法、化学法及生物法 。
原理 增加细胞间的粘附、改变膜的通透性—— 随机结合、融合
(1)物理法——电融合诱导法
在直流电脉冲的诱导下，极化产生偶极子， 彼此靠近，定向排列成串球状。
在直流电脉冲的诱导下，原生质体膜两侧 产生电势，正负电荷相吸，细胞膜变薄， 触发膜的穿孔（质膜瞬间破裂）。 膜之间形成通道，细胞质等得以交换、融 合。
原理与过程
灭活后的病毒颗粒结合到原 生质体表面。两受体细胞开 始凝聚。 两细胞的膜紧密结合。病毒 被膜与受体细胞的浆膜融合 。病毒颗粒周围的膜脱离整 个膜，产生破口，在两细胞 间形成细胞质通道（37℃下 1-2min），通道继续扩大， 病毒颗粒流入细胞质内，细 胞质互相融合。 融合细胞变圆，融合结束。
特点
研究最早的促融剂。 毒性大而使应用受到限制。
(3)化学法
包括PEG诱导、高Ca2+和pH诱导PEG结合诱导等。 聚乙二醇(PEG)是一种多聚化合物，分子式为 H(OHCH2-CH2)nOH)。 PEG诱导：PEG与溶液中自由水结合，高度脱水后 引起原生质体凝聚、扭曲变形、细胞膜连接处发 生融合，形成很小的细胞桥，之后扩大，最终彻
蛋白酶在代谢过程中的作用及其在疾病研究中的应用
蛋白酶在代谢过程中的作用及其在疾病研究中的应用蛋白质是生命体中的重要分子，它们在各种生物过程中起到关键作用。
生物体内的蛋白质需要在合适的时机和地点被降解和调节，这个过程就需要依赖蛋白酶进行催化。
蛋白酶是一类特殊的酶，主要的功能是将蛋白质分解成氨基酸和小肽链。
本文将阐述蛋白酶在代谢过程中的作用以及它们在疾病研究中的应用。
第一部分：蛋白酶在代谢过程中的作用蛋白酶在细胞的代谢和信号传导过程中具有重要作用。
它们可以将短寿命蛋白质降解，进而调节细胞中的生物学过程。
在细胞中，蛋白酶主要通过两个途径进行活动。
一种是通过原生质体系，即在细胞内液汁中进行催化反应。
另一种是通过溶酶体途径，在内质网或高尔基体附近降解蛋白质分子。
蛋白酶还可以负责完善蛋白质的生物合成。
在蛋白质的生产过程中，需要将多肽链进行剪切和修饰，蛋白酶即是起到这个作用的关键因素。
只有当蛋白质的结构完全正确时，才能保证生物学功能的实现。
此外，蛋白酶还可以作为细胞的“清道夫”，参与细胞内的质量控制，以及对细胞外蛋白质的分解。
在生物体的免疫系统中，蛋白酶也发挥着重要作用，能够清除细菌、病毒和其他入侵性物质。
第二部分：蛋白酶在疾病研究中的应用在现代生命科学领域，蛋白酶的研究已经成为一个非常活跃的领域。
可以通过研究蛋白酶的活性和特性，找到一些可以治疗疾病的方法。
蛋白酶的异常活性与很多疾病的进展有关。
人体内的某些酶类会因为一些因素或者环境因素的存在导致异常，这些酶类被称为“失调酶”。
失调酶会破坏细胞、组织或器官的稳定性，进而导致疾病的发生。
因此，研究蛋白酶的特性和性质可以为新药物研发提供参考。
在肿瘤治疗方面，蛋白酶也发挥着重要作用。
高水平的蛋白酶活性经常被发现在肿瘤细胞中，通过抑制或克服这些酶类的活性，可以减少肿瘤细胞的活性，从而达到治疗的目的。
此外，蛋白酶对于肝炎、某些心脏病、创伤等疾病也有治疗上的应用。
结论：蛋白酶在生物体内有着重要的功能，可以调节细胞、组织和器官的代谢过程，更是可以在疾病研究和治疗中起到关键的作用。
微生物育种复习题答案
微生物育种学复习题题型包括填空、选择、名词解释、简答题、问答题名词解释转换:嘌呤与嘌呤之间,嘧啶与嘧啶之间发生互换称为转换置换：在DNA链上的碱基序列中一个碱基被另一个碱基代替的现象称为置换颠换：一个嘌呤替换另一个嘧啶或一个嘧啶替换另一个嘌呤的现象称为颠换移码突变：碱基序列中有一个或几个碱基增加或减少而产生的变异;转导：由噬菌体将一个细胞的基因传递给另一细胞的过程;它是细菌之间传递遗传物质的方式之一;其具体含义是指一个细胞的DNA或RNA通过病毒载体的感染转移到另一个细胞中;转染：指真核细胞由于外源DNA掺入而获得新的遗传标志的过程;常规转染技术可分为瞬时转染和稳定转染永久转染两大类;端粒：是染色体末端的一个区域,该区域含有DNA重复序列,当体细胞衰老时,重复序列的数量将逐渐减少;异核体：两株基因型不同的菌株菌丝体在培养过程中紧密接触,接触部分细胞壁溶解、联结、融合、细胞质交流,在共同的细胞质里存在着两个细胞核;准性生殖：两个体细胞的核融合,及同源染色体的交换,直至基因重组,完成了和有性繁殖相似的繁殖过程;原生质体：指在人为条件下,用溶菌酶除尽原有细胞壁或用青霉素抑制新生细胞壁合成后,所得到的仅有一层细胞膜包裹的圆球状渗透敏感细胞;富集：某些物质通过水、大气和生物作用而在土壤或生物体内显著积累的作用;基本培养基：仅能满足微生物野生型菌株生长需要的培养基,含有一般微生物生长繁殖所需的基本营养物质的培养基;选择培养基及各种类培养基概念：根据微生物的特殊营养需求或其对某些物理、化学因素的抗性而设计的培养基,用来将某种或某类微生物群体中分离出来,具有使混合菌样中劣势菌变为优势菌的功能,广泛用于菌种筛选等领域;完全培养基:凡可满足一切营养缺陷型菌株营养需要的天然或半组合培养基;补充培养基:凡只能满足相应的营养缺陷型生长需要的组合培养基;富集培养：是在目的微生物含量较少时,根据微生物的生理特性设计一种选择性培养基,创造有利的生长条件,使目的微生物在最适环境下迅速生长繁殖,数量增加,由自然条件下的劣势种变成人工环境下的优势种以利分离到所需要的菌株;营养缺陷型：野生型菌株经过人工诱变或自然突变失去合成某种营养氨基酸、维生素、核酸等的能力,只有在基本培养基中补充所缺乏的营养因子才能生长;光修复又称光复活作用：细菌经波长220~300nm的紫外线照射后,接着经波长310~460nm的可见光照射,与不经可见光照射的对照相比,其存活率大幅度提高,突变率相应下降,这种现象称光复活;同工酶:催化同一个反应,但其分子结构不同,即同工酶;酶合成的调节：通过调节酶的合成量进而调节代谢速度的调节机制,这是一种在基因水平上的代谢调节;代谢控制育种：通过定向选育某种特定的突变型,改变代谢通路、降低支路代谢终产物的产生或切断支路代谢途径及提高细胞膜的透性,以达到大量积累有益产物的目的;末端产物阻遏：由某代谢途径末端产物过量累积而引起的阻遏;组成型突变株：操纵基因或调节基因突变引起酶合成诱导机制失灵,菌株不经诱导也能合成酶、或不受终产物阻遏的调节突变型;原生质体再生育种：微生物制备原生质体后直接再生,从再生的菌落中分离筛选变异菌株,最终得到优良性状提高的正变菌株;基因工程中标记用抗生素: 四环素、氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素各种反馈抑制的概念：1、P162直线式代谢途径中的反馈抑制：终产物合成过多时可抑制途径中第一个酶的活性,最终导致终产物合成停止;2、优先合成：分支途径中一个终产物优先被合成,浓度过量后,抑制自身合成途径,使代谢转向合成另一个终产物;3、协同反馈抑制多价反馈抑制、协作反馈抑制：分支途径中两个或两个以上的终产物单独存在时不能抑制共同途径中第一个酶,只有几个终产物同时过量存在时,才能抑制此酶;4、合作反馈抑制增效反馈抑制：分支途径中末端产物单独存在时仍有微弱的抑制作用,当几个末端产物单独存在时抑制作用增强;5、累积反馈抑制：分支途径中每一末端产物单独存在时,只是部分地抑制共同途径中的第一个酶;各个终产物的抑制作用互不影响,只有同时过量存在时,才使酶活力完全受到抑制,并且抑制的总百分数等于各单独抑制的百分数的和;6、同工酶：一个共同途径的起始反应受两个或两个以上的酶所催化;7、顺序反馈抑制：分支途径中几个末端产物抑制分支点后面第一个酶,使分支点产物积累;结果分支点产酶又反馈抑制了共同途径中的第一个酶,最后使整个代谢途径停止;分支代谢途径中的反馈抑制各种诱变剂种类及基本原理：1、物理诱变剂：例如：电离辐射、电磁波、紫外线等; 原理：通常使用物理辐射中的各种射线,主要是由高能辐射导致生物系统损伤,继而发生遗传变异的一系列复杂的连锁反应过程;电离辐射主要导致基因突变和染色体的畸变;非电离辐射主要导致形成嘧啶二聚体;2、化学诱变剂：如药品、农药、食品添加剂、调味品、化妆品、洗涤剂、塑料、着色剂、化肥、化纤等原理：对DNA其作用,改变其结构并引起遗传变异;对基因的某部位发生作用;3、生物诱变剂：如真菌的代谢产物、病毒、寄生虫等;原理:生物体内还有一些内源诱变剂,内源诱变剂是在人体健康异常的情况下产生的,如遗传因素、内分泌紊乱;放线菌杂交方法：一混合培养法二玻璃纸法三平板杂交法突变表型的种类：一形态突变型：菌落形态,细胞形态,孢子数量、颜色;二生化突变型：营养缺陷型、糖类分解发酵突变株、色素形成突变株、有益代谢产物生产能力突变株;三条件致死突变型：温敏突变型热敏感和冷敏感;四致死突变型：显性致死和隐性致死;五抗性突变型：抗药突变、抗噬菌体突变、抗高温突变、抗辐射突变;杂交育种的遗传标记：1、营养缺陷型标记：可选单缺、双缺或多缺型,通常用双缺陷型标记；2、抗性标记：抗逆性耐高温、高盐和高PH等和抗药性；3、温度敏感性标记：许可温度下生长,非许可温度下不生长；4、其他性状标记：孢子颜色、菌落形态结构、色素等;制备原主质体的各种酶：简答题1.工业微生物菌株应具备的基本要求有哪些写出6点以上即可a.在遗传上必须是稳定的;b.易于产生许多营养细胞、孢子或其它繁殖体;c.必须是纯种,不应带有其他杂菌及噬菌体;d.种子的生长必须旺盛、迅速;e.产生所需要的产物时间短;f.比较容易分离提纯;g.有自身保护机制,抵抗杂菌污染能力强;h.能保持较长的良好经济性能;2.原核微生物染色体结构特点有哪些a.遗传信息的连续性,共价、闭合、环状b.功能相关的结构基因组成操纵子c.结构基因单拷贝及rRNA多拷贝d.基因的重复序列少而短3.什么是表型延迟导致表型延迟的原因是什么表型延迟：是指微生物通过自发突变或人工诱变而产生新的基因型个体所表现出来的遗传特性不能在当代出现,其表型的出现必须经过2代以上的复制;导致表型延迟的原因：a.与诱变剂性质和细胞壁结构组成有关,有些诱变剂渗入细胞的速度相当慢;b.若突变发生在多核细胞中的某一个核,该细胞就成为杂核细胞了;如果该核突变的基因是唯一控制突变表型的基因,那么突变是隐性的,只有几代繁殖分裂得到纯的核突变细胞,才能出现由该基因控制的突变表型;C.原有基因产物在子细胞中的浓度随着繁殖逐步稀释到最低限度后,突变表型才显现;4.举例简述显色圈法筛选微生物菌种的原理和方法;直接用显色剂或指示剂原理：对于一些不易产生透明圈产物的产生菌,可在底物平板中加入指示剂或显色剂,使所需微生物能被快速鉴别出来;举例：P675.简述透明圈法筛选微生物菌种的原理,并举例;原理：在平板培养基中加入溶解性较差的底物,使培养基浑浊;能分解底物的微生物便会在菌落周围产生透明圈,圈的大小初步反应该菌株利用底物的能力;该法在分离水解酶产生菌时采用较多,如脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶、核酸酶6.试述筛选营养缺陷型菌株的步骤以及它们的微生物育种中的应用;筛选步骤：a.营养缺陷型的诱发b．淘汰野生型菌株c.营养缺陷型的检出d．营养缺陷型的鉴定应用：a.工业育种：协助解除代谢反馈调控机制,从而达到大量积累产物的目的,如氨基酸的发酵;b.遗传标记：菌种杂交、重组育种时作为遗传标记;7.简述选育营养缺陷型突变株可改变细胞膜透性的类型以及能够提高发酵产物产量的机理;类型：1、生物素缺陷型的突变株:w生物素作为催化脂肪酸生物合成最初反应的关键酶乙酰COA 羧化酶的辅酶,参与脂肪酸的合成,进而影响磷脂的合成,最终改变细胞膜的结构;2、油酸缺陷型的突变株:由于油酸缺陷型突变株切断了油酸的后期合成,丧失了自身合成油酸的能力,必须由外界供给油酸才能生长,故油酸含量的多少,直接影响到磷脂合成量的多少盒细胞膜的通透性;3、甘油缺陷型的突变株：甘油缺陷型的遗传障碍是丧失a-磷酸甘油脱氢酶,所以不能合成a-磷酸甘油和磷酸,必须由外界供给甘油才能生长;机理：8.反馈阻遏和反馈抑制的区别有哪些反馈阻遏是对酶合成的阻遏,是基因转录水平上的代谢调节,效果不及反馈抑制那样迅速;反馈抑制是通过调节变构酶的活力得以实现,因为不涉及蛋白质的而合成过程,调节的效果比较直接而快速;9.微生物原生质体育种主要包括哪4种方法,并对各方法做简要解释;a.微生物原生质体再生育种是微生物制备原生质体后直接再生,从再生的菌落中分离筛选变异菌株,最终得到优良性状提高的正变菌株;b.微生物原生质体诱变育种是以微生物原生质体为育种材料,采用物理或化学诱变剂处理,然后分离到再生培养基中再生,并从再生菌落中筛选高产突变菌株;c.微生物原生质体转化育种整条染色体DNA或片段DNA转化原生质体以及质粒DNA转化原生质体的技术d.微生物原生质体融合育种遗传性状不同的两个亲株原生质体融合10.请解释微生物原生质体再生育种高正变率的原因;a.原生质体本身较为敏感,制备和再生过程中的各种化合物及环境中的物理因子对染色体或质粒DNA都有一定诱变效应;b.原生质体再生本质上是细胞壁重建和分裂能力恢复的过程,再生是细胞壁可能在组成与结构上都发生变化,甚至于产生可遗传的利于细胞代谢和产物外泌的变异;c.常规诱变育种选用材料多为孢子,这些休眠体对诱变剂较为迟钝,获得的大部分是负变菌株;而制备原生质体的出发材料一般为对数生长期细胞,活力较强,对环境和诱变剂较为敏感,破壁与再生过程中又淘汰了大量弱势菌株,能再生的菌株不论初级代谢与次级代谢过程均较活跃,故高产优质正变菌株比例大；d.原生质体再生材料无需经过遗传标记,减少了对菌株的损失和优良性状的影响;11.请写出原生质体融合育种的步骤;a.出发亲本菌株的筛选及单倍体分离b.原生质体融合常用培养基与溶液c.原生质体制备d.原生质体再生e.原生质体融合f.融合重组体鉴定与遗传分析12.简述基因工程的原理和基本步骤;原理：是用人为的方法将所需的某一供体生物的遗传物质DNA分子提取出来,在离体条件下进行“切割”,获得代表某一性状的目的基因,把该目的基因与作为载体的DNA分子连接起来,然后导入某一受体细胞中,让外来的目的基因在受体细胞中进行正常的复制和表达,从而获得目的产物;步骤：1、目的基因的获得DNA片段的获得 2、载体的选择与准备 3、重组体DNADNA片段和载体的连接 4、外源DNA片段引入受体细胞——基因克隆和基因文库 5、目的基因的表达和重组体的筛选13.简述菌种退化的原因及防止措施;原因：1、基因突变基因突变导致菌种退化、质粒脱落导致菌种退化2、连续移代3、培养和保藏条件的影响防止措施：1、尽量减少传代2、菌种经常纯化3、创造良好的培养条件4、用单核细胞移植传代5、采用有效的菌种保藏法问答题1.请叙述一下微生物的修复系统包括哪些,它们的存在对微生物有何意义生物修复系统包括光修复和暗修复复制前修复和复制后修复1、光修复2、切补修复3、重组修复4、SOS修复系统5、DNA聚合酶的校正作用意义：繁衍微生物的后代,保证遗传的稳定性,修补DNA分子因突变造成的缺陷和损伤;2.紫外线对枯草芽孢杆菌诱变育种的基本原理、步骤和注意事项基本原理：紫外线是一种罪常用的物理诱变因素,它的主要作用是使DNA双链之间或同一条链上两个相邻的胸腺嘧啶间形成二聚体,阻碍双链的分开,复制和碱基的正常配对,从而引起突变;步骤：1、菌悬液的制备 2、平板制作 3、紫外线处理 4、稀释 5、涂平板 6、培养 7、计数 8、观察诱变效应注意事项：1、紫外线诱变时,一定要在红光下进行,在暗环境下培养,避免光修复;2、紫外线诱变时,要打开皿盖,紫外线穿透力差;3.阐述紫外线照射引起微生物突变的原理以及诱变的操作步骤和技术要点紫外线的诱变原理：紫外线会引起DNA与蛋白质的交联,胞嘧啶和尿嘧啶的水合作用,DNA链的断裂,嘧啶二聚体的形成单链上相邻两个胸腺嘧啶之间或双链相对应的两个胸腺嘧啶之间操作步骤：P38技术要点：4.营养缺陷型检出有哪几种常用方法并阐述各自的原理如何P124结合书本点植对照法：影印法：将稀释后的待测样品涂布到完全培养基上,适宜条件培养,等长出菌落之后用影印法将菌落转印到基本培养基上,适宜条件培养,等菌落长出来之后,对比原来的培养基,原来有菌落而在基本培养基上没有长出来的菌落是营养缺陷型;夹层法：先在培养皿底部倒入一层基本培养基,凝固后,倒入含有菌体细胞的基本培养基,待凝固后,继续加第三层基本培养基;培养后平板上首先出现的菌落,为野生型菌落;此时在平皿底部做好颜色标记;接着加上一层完全培养基,经培养,如果在基本培养基上不长而在完全培养基上生长的小型菌落,可能是营养缺陷型;限量补充培养法：5.在工业微生物菌种使用中,菌种发生退化的原因是什么如何防止菌种的退化以及对菌种进行复壮;退化的原因：一基因突变 1、基因突变导致菌种退化 1表型迟缓现象 2双核或多核脱离现象3非正倍体或部分双倍体分离2、质粒脱落导致菌种退化二连续移代菌种移解代数越多,发生突变的概率就越高三培养和保藏条件的影响不良的培养条件,如培养基组成、PH值、通气等和保藏条件如营养、培养基含水量、温度、氧气等,不仅会诱导低产基因型菌株的出现,而且会造成低产基因和高产基因细胞的数量比发生变化菌种退化的防治：1、尽量减少传代2、菌种经常纯化 1注重菌落的纯化 2单细胞或单孢子的纯化3、创造良好的培养条件4、用单细胞移植传代对于霉菌和放线菌,由于菌丝可能是多核的,所以尽可能用单核的孢子移接,如采用棉花团沾取孢子接种5、采用有效的菌种保藏方法 1良好的保藏培养基 2良好的保藏的温度条件复壮方法：1、纯种分离 1菌落纯是只要求达到菌落纯化的水平,通过稀释平板法、划线法、表面涂血法等常规操作法,该方法较为粗放,适用于菌退化不太严重的情况2细胞纯采用单细胞或单孢子分离法,也可以二者结合,先用前一种方法获得较纯的菌种再采用单细胞或单孢子分离法进一步纯化2、淘汰法通过物理、化学的方法处理菌种或孢子,使大部分死亡80%以上,存活的菌多为生长健壮者,可从中选出优良菌种来3、宿主体内复壮法对于寄生型微生物如苏云金杆菌、白僵菌、多角体病毒等,由于长期使用,其毒力会下降,导致杀毒效率降低的衰退现象;这时可以用菌种却感染青菜虫幼虫等,然后从致死的虫体上重新分离,经过几次重复感染与分离,就可以逐步恢复和提高毒力6.列举5种以上常用的工业微生物菌种保藏方法,并简要说明各自的优缺点保藏方法：斜面保藏、石蜡保藏、干燥保藏沙土管保藏、滤纸条保藏、无水硅胶保藏法、麸皮保藏法、冷冻干燥保藏法、真空干燥法、液氮超低温保藏法、液相保藏法优缺点：优点缺点斜面保藏操作简单,使用方便,特别适合于非长期保藏的菌种以及不能采用低温干燥方法保藏的菌种容易变异,因为的物理、化学特性不是严格恒定的,屡次传代会使微生物的改变,而影响微生物的；污染杂菌的机会亦较石蜡保藏制作简单,不需特殊设备,且不需经常移种,效果好保存时必须直立放置,所占位置较,同时也不便携带;从液体石蜡下面取培养物移种后,接种环在火焰上烧灼时,培养物容易与残留的液体石蜡一起飞溅,应特别注意滤纸条保藏较液氮、冷冻干燥法简便,不需要特殊设备沙土管保藏工业生产中应用最广,效果亦好;营养细胞效果不佳液氮超低温保藏法除适宜于一般微生物的保藏外,对一些用冷冻干燥法都难以保存的微生物如支原体、、氢细菌、难以形成孢子的霉菌、及动物细胞均可长期保藏,而且性状不变异需要特殊设备真空干燥法设备相对简单,操作方便。
现代生物技术在育种上的应用
2． 植物细胞杂交
(1)获得原生质体：人们常用_纤__维__素__酶__和__果__胶__酶__等将细胞 壁分解掉，得到无细胞壁的植物细胞——原生质体。 (2)诱导原生质体融合：方法有物理法(如_振__动_、电刺激等) 和化学法(如_聚__乙__二__醇__)等。 (3)获得杂种植株：通过_植__物__组__织__培__养__技术将杂种细胞培 育为杂种植株。 3．动物细胞杂交 动物细胞杂交与植物原生质体融合的原理_基__本__相__同__，诱 导融合的方法_也__类__似__。迄今为止，已经实现了人—鼠、 人—猴、人—蛙等种间个体的细胞杂交并获得杂交细胞， 但尚未获得杂种动物。
示例一 基因工程育种及应用
【例1】 为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐 碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育 出了耐盐水稻新品系。 (1)获得耐盐基因后，构建重组DNA分子所用的限制性内 切酶作用于图中的________处，DNA连接酶作用于 ________处。(填“a”或“b”)
哺乳动物的乳汁中含有人类所需要的物质，如激素、抗体和
酶类，这就是乳腺生物乳动物(如羊)得到相应的外源基因。该项
技术的优点之一就是可以定向的改变生物的遗传性状。受精
卵是个体发育的起点，其经细胞分裂、组织分化发育成的个
体，所有的细胞都含有与受精卵相同的遗传物质，且受精卵
【巩固2】 上海医学遗传研究所成功培育出第一头携带白蛋白的转 基因牛，他们还研究出一种可大大提高基因表达水平的新方
法，使转基因动物乳汁中的药物蛋白含量提高30多倍。“转基
因动物”是指
( )。
A．提供基因的动物
B．基因组中增加外源基因的动物
C．能产生白蛋白的动物
D．能表达基因信息的动物
碱性蛋白酶
碱性蛋白酶产品概述奥迪尔碱性蛋白酶是经原生质体诱变方法选育的枯草杆菌通过深层发酵、提取及精制而成的一种蛋白水解酶。
广泛应用于制革、丝绸、食品、医疗、酿造等行业。
产品原理碱性蛋白酶活性成分属于一种丝氨酸内切碱性蛋白酶，它能水解蛋白质分子肽链生成多肽或氨基酸，在有机溶剂中它还可催化多肽的合成。
产品特性1.温度范围：有效温度范围20-60℃，最适温度范围在35-45℃。
2.PH值范围：有效pH范围6-11，最适pH值范围9.5-10.5产品性状1.产品规格：固体100000u/g，200000u/g粉末（颗粒状）；液体100000u/ml液体酶pH（25℃）：7.0-9.0，容重：≤1.25g/ml；固体酶细度（0.4mm标准筛通过率）：≥80%。
2.酶活力定义：1g固体酶粉（或1ml液体酶），在40℃±0.2℃、pH10.5条件下，1min水解酪蛋白产生1μg酪氨酸，为1个酶活力单位，以u/g（u/ml）表示。
3.产品标准：执行中华人民共和国国家标准GB/T23527-2009应用方法1.碱性蛋白酶用于皮革加工具有简化工序、缩短周期、提高成品质量、增加的率、降低生产成本等优点。
用于浸水工序的加酶量为0.02-0.1%（按原料质量计，酶活力以10万u/ml计，下同），20-25℃作用12-20小时；用于皮革软化的加酶量为0.05-0.2%,35-38℃作用3-6小时；用于脱毛的加酶量为0.1-0.3%，20-35℃作用12-20小时。
以上使用pH均为9-11.2.碱性蛋白酶用于丝绸脱胶有丝素不受损伤、不起毛丝和蓬松的效果。
原料经过前处理，按0.8-2.4%加酶，pH9-11,40-50℃的条件下作用30-60min。
3.碱性蛋白酶用于软骨素生产，可有效提高收率和纯度。
原料在碱提取后，按照0.2-0.6%的添加量，pH8-10，温度40-50℃的酶解条件作用4-8小时。
4.碱性蛋白酶用于肝素钠的生产，可提高分子均一性和产品纯度。
微生物遗传育种名词解释（二）
微⽣物遗传育种名词解释（⼆）1、⾃然选育：从⾃然界直接分离和筛选菌种或在⽣产中利⽤⾃发突变选育优良菌株。
2、诱变育种：对出发菌株进⾏诱变，然后运⽤合理的程序与⽅法筛选符合要求的优良菌株。
3、代谢调控育种：利⽤现有的代谢调控知识，筛选特定突变型，改变代谢流量或流向，从⽽提⾼⽬的产物产量的⼀种育种技术。
4、重组育种；利⽤微⽣物间的遗传重组来改变其遗传物质组成及结构的⼯业微⽣物育种技术。
5、原⽣质体融合育种；通过⼈为⽅法，使遗传性状不同的两细胞的原⽣质体发⽣融合，从⽽实现遗传重组的⼯业微⽣物育种技术。
6、基因⼯程育种技术：在体外构建重组DNA分⼦并导⼊宿主内⾼效表达，从⽽获得重组微⽣物的育种技术。
7、突变：遗传物质核酸中的核苷酸序列发⽣了稳定的可遗传的变化。
8、突变体：带有突变基因的细胞或个体9、突变型：突变体的基因型或表型称为突变型，和其相对的原存在状态称为野⽣型。
10、⾃发突变（spontaneous mutagenesis）：未经任何⼈为处理⽽⾃然发⽣的突变；11、诱发突变（induced mutagenesis）：由⼈们有意识地利⽤物理或化学⼿段对⽣物体进⾏处理⽽引起的突变。
12、整倍体：含有完整的染⾊体组。
13、⾮整倍体：含有不完整状态的染⾊体组，⼀般是指⼆倍体中成对染⾊体成员的增加或减少。
14、部分⼆倍体：原核⽣物中由⼀整条染⾊体和外来染⾊体⽚段所构成的不完整⼆倍体。
增变基因（mutator gene）：其基因突变会导致整个基因组的突变频率明显上升的⼀些基因。
15、前突变：诱变剂所造成的DNA分⼦某⼀位置的损伤16、光复活：指细菌在紫外线照射后⽴即⽤可见光照射，可以显著地增加细菌的存活率，降低突变率。
17、表型延迟phenotype lag：突变体表型改变落后于其基因型改变的现象。
18、分离性延迟segregational lag ：突变基因由杂合状态到纯合状态所造成的表型迟延19、⽣理性延迟physiological lag ：由于基因产物的“稀释”过程所造成的表型迟延野⽣型（wild type）：从⾃然界分离到的任何微⽣物在其发⽣营养缺陷突变前的原始菌株；基因重组：由于不同DNA链的断裂和连接⽽产⽣DNA⽚段的交换和重新组合，形成新的DNA分⼦，进⽽形成新遗传个体的⽅式称为基因重组。
蛋白酶体的结构和功能分析
蛋白酶体的结构和功能分析蛋白酶体是细胞内的一种主要的降解细胞质蛋白的器官，也是细胞内最重要的原生质体之一。
蛋白酶体在细胞内起着非常重要的作用，参与细胞代谢、解毒、分解大分子物质、蛋白质合成、减少过量的蛋白合成和降解等等。
蛋白酶体是由多种酶分子组成的亚微型“蛋白酶复合物”，其结构和功能非常复杂。
本文就来探讨一下蛋白酶体的结构和功能分析。
一、蛋白酶体的结构分析蛋白酶体是细胞内一种直径为25~30nm的圆形体，由两个不同的结构域组成：内质网域和细胞骨架域。
蛋白酶体主要的降解作用是由其内质网域的外部蛋白质酶（如糖化酶、肽酶、蛋白酶等）和各种蛋白酶、氧化酶和还原酶等东西组成的。
在蛋白酶体的内质网域中，核心构造由降解桶形分子——ATPase和多个蛋白酶分子组成，这就构成了一个酶性降解复合物。
这些蛋白酶分子被固定在一起，并在ATPase附近形成一个类似于圆锥的结构，这一结构被称为“内质网环经”。
整个结构的强韧且误差率低，因此极其适合细胞降解蛋白质的过程。
另外，蛋白酶体的细胞骨架域则是由微管蛋白和微丝蛋白等细胞骨架蛋白组成的，维持了蛋白酶体稳定性的同时，也确保了其正确的定位和移动。
二、蛋白酶体的功能分析蛋白酶体是细胞内最重要的降解细胞质蛋白的器官之一，其主要功能是通过降解细胞内过期的蛋白质和不需要的多肽。
在细胞代谢过程中，会有许多蛋白质被合成。
这些蛋白质有一部分需要在细胞内发挥功能，而另一部分则不需要，它们会通过蛋白酶体进行分解并释放出有用的氨基酸来维持细胞的生理代谢活动。
蛋白酶体发挥这一降解作用的速度非常快，在细胞内同步控制着蛋白质的生长和降解，并在不断更新代谢过程中为细胞提供所需的氨基酸等物质。
除了作为细胞的垃圾处理站外，蛋白酶体还有着其他重要的生物学功能。
最近的研究表明，蛋白酶体可能还参与了许多重要的生物学过程，如蛋白质转录、翻译、分裂等。
在许多的细胞过程中，蛋白酶体也可以帮助维持一种稳定的环境，保证细胞不受外界诱导。
菌株选育
③、在分离产生脂肪酶的菌株时，如以土温为底物，尼罗兰作为指示剂，根据变色圈的大小来判断脂肪酶的活性高低。也可用甘油三丁酸酯为底物，罗丹明B为指示剂，以荧光圈来测定。
（3）生长圈法
①、适用范围：生长圈法通常用于分离筛选氨基酸、核苷酸和维生素的产生菌。
②、原理：工具菌是一些相对应的营养缺陷型菌株。将待检测菌涂布于含高浓度的工具菌并缺少所需营养物的平板上进行培养，若某菌株能合成平板所需的营养物，在该菌株的菌落周围便会形成一个混浊的生长圈。
18、原生质体融合育种：是指双亲本原生质体在促融剂作用下相互接触，融合成一个细胞，然后核融合，最终强制性地将双亲基因组融合，DNA交换、重组并产生新性状。
论述
1、工业微生物育种技术的发展经历了几个阶段
（1）自然选育：对工业微生物育种有很大的影响。例如
①、在酒精发酵中，推广了自然选育的纯系良种，扭转了酒精生产中的不稳定现象。
⑤琼脂块大通量筛选变株
是将生长突变株的平板用打孔器打下琼脂块，转移到生物鉴定平板上进行测定，此方法效率高、筛选量大。
⑥应用复印技术快速筛选变株
应用复印技术从平板上可直接筛选产脂野生株和具有髙脂含量的突变株，是产脂微生物的简便检测方法。
简答
1、物理诱变剂的生物学效应
（1）、物理诱变剂对微生物的诱变作用主要是由高能辐射导致生物系统损伤，继而发生遗传变异的一些列复杂的连锁反应过程。
3、紫外线的光谱范围在40～390nm，DNA可以吸收的紫外线光谱为260nm。15W紫外灯管放射出来的紫外线大约有80%的波长集中在这个范围内，诱变效应比30W的好。
4、紫外线的辐射剂量：紫外线的诱变剂量可分绝对剂量和相对剂量。
5、诱变剂包括物理诱变剂、化学诱变剂和生物诱变剂三大类。
微生物学控制与发酵考试重点
微生物学控制与发酵考试重点work Information Technology Company.2020YEAR1、代谢控制发酵：指利用遗传学的方法或者其它生物化学的方法，人为地在脱氧核糖核酸（DNA）分子水平上改变和控制微生物的代谢，使目标产物大量生成、积累的发酵。
2、营养缺陷型：指原菌株由于发生基因突变，致使合成途径中某一步骤发生缺陷，从而丧失了合成某些物质的能力，必须在培养基中补加该营养物质才能生长的突变型菌株。
3、结构类似物：指与代谢途径中的代谢产物结构相类似，能与代谢物一样与调节酶结合引起酶活性的变化，但不具有代谢物生理功能的一类化合物。
4、调节酶：是参与代谢调节的酶的总称。
作为一个反应链的限速因子，对整个反应起限速作用。
常称为关键酶，主要包括变构酶、同功酶和多功能酶。
5、积累反馈抑制：每一个最终产物只单独地、部分地抑制共同步骤第一个酶，并且各最终产物的抑制作用互不影响，当几个最终产物同时存在时，他们的抑制作用是积累的6、转化：指相当大的游离的供体细胞的DNA片段被直接吸收到受体细胞内，并整合于受体细胞的基因组中，从而使受体细胞获得供体细胞部分遗传性状的现象。
7、操纵子：是指原核生物基因组的一个表达调控序列，长度约1000bp左右，由若干结构基因串联在一起，其表达受到同一调控系统的调控。
8、巴斯德效应：在有氧的条件下，由于进行呼吸作用而使酒精发酵和糖酵解作用受到抑制的现象。
9、诱变：利用物理或化学因素处理微生物细胞群体，促使其中少数细胞中的遗传物质（主要是DNA）的结构发生改变，从而引起微生物的遗传性状发生变化，然后通过目的选择标记设法从群体中筛选出少数性状优良的突变菌株的过程。
10、二次生长：在分批培养微生物的过程中，由于微生物分阶段利用基质中的主要成分，而出现的两个高速生长现象。
1、能荷：能荷是机体能量在数量上的衡量形式。
为从量上表示细胞内ATP-ADP-AMP的能量情况，1968年Alkinson提出了能荷概念。
蛋白酶的生产和应用
注：PFP．二异丙基磷酰氟 甲基磺酰氟 Ph 马铃薯蛋白酶抑制剂 EDTA：乙二胺四乙酸
PCMB：对氯汞苯甲酸 PMSF．"苯 DAN：重氮乙酰正．DL．亮氨酸甲酯 OP：郯二氮杂菲)(菲绕啉)
2．关于微生物蛋白酶的生产
蛋白酶是用途最广泛的酶制剂之一，主要用于洗涤剂，制革、毛皮、蛋白水解物、酿酒、 酱油，以及纺织、医药品、化妆品等的生产上。全球蛋白酶的销售额占酶制剂市场的60％， 我国2005 年全国(外资合资企业不计)微生物酶制剂产量约48 万吨，总销售额约20 亿 人 民币，其中蛋白酶约10 万吨，销售额近9 亿人民币。
食品、饲料加工
蛋白质水解、脱苦、调味液
食品饲料加工
动植物蛋白水解、面包、发酵食品
面包制造
。·
动植物蛋白水解、调味液
弱碱性蛋白酶、调味液
水解蛋白质
Actinase(科研医药)
灰色链霉菌
试剂、食品加工、医药
13
Pantiase NP-2(Yokult)
酸性蛋白酶： SumizymeAP(新日本) Sumizyme RP(新日本) Molsin(Seishin 制药) Neulase F(天野)
奶酪制造
3．蛋白酶的利用 蛋白酶的用途非常广泛(表3)，最大的用户是洗涤剂，其次用于饲料、食品工业、酿
酒酿造，以及制革工业和医药。
用途
说明
表3 蛋白酶的用途
干酪制造
凝固酪蛋白，缩短成熟时间 酱油酿造
预处理大豆，提高蛋白质利用率 天然调
味液制造
水解蛋白质，增强风昧，制HVP、HAP
酒精，酿酒
水解蛋白质，促进酵母发酵
啤酒澄清 酿醋
分解啤酒单宁蛋白沉淀，延长保质期 缩短酿醋周期，增加食醋得率
微生物工程复习题
微⽣物⼯程复习题微⽣物⼯程复习题第⼀章微⽣物⼯程概论1. 简述微⽣物⼯程领域国内外现状。
2. 简述微⽣物⼯程主要研究内容。
微⽣物菌种、菌种选育的研究微⽣物的代谢调节和代谢⼯程的研究培养基的研究发酵⼯艺控制研究下游加⼯技术的研究3. 简述微⽣物⼯程发展简史。
微⽣物⼯程的发展划分为四个阶段：①从⼈类开始从事酿造酒、醋的时期，是以⾃然发酵为主的微⽣物⼯程时期；②19世纪末到20世纪30年代，主要建⽴纯培养技术；③20世纪40年代到50年代，主要是建⽴深层培养技术为主的微⽣物⼯程时期，这个时期由于好⽓性发酵⼯程的建⽴，1947年诞⽣了⽣化⼯程；④20世纪50~60年代以来，由于DNA重组技术、细胞融合技术的发展进⼊现代微⽣物⼯程时期，微⽣物⼯程的发展史和微⽣物⼯程学科的建⽴与发展，⼤概是符合这⼀历史进程的。
4. 简述微⽣物⼯程应⽤。
微⽣物⼯程在⾷品⼯业中的应⽤微⽣物⼯程在医药⼯业中的应⽤微⽣物⼯程在酶⼯程中的应⽤微⽣物⼯程在化⼯和漂产品的应⽤微⽣物⼯程在农业中的应⽤微⽣物⼯程在环境保护中的应⽤微⽣物⼯程在⾦属冶炼中的应⽤微⽣物⼯程在⾼新技术研究中的应⽤5. 简述微⽣物⼯程的优缺点。
微⽣物⼯程⼯业优点如下：⑴反应条件温和：⑵⽣物发酵罐的通⽤性：⑶⽣产原料多数为农副产品：⑷微⽣物反应机理的⾼度选择性：⑸微⽣物菌种选育的优越性：（6）可以⽣产⽬前不能⽣产的或⽤化学法微⽣物⼯程缺点⑴能源消耗较⼤：⑵微⽣物菌体的⽣长需要消耗部分原料⑶需要消耗⼤量⽔：⑷废⽔、废液量⼤，易造成污染：6. ⽐较微⽣物⼯程与酶⼯程优缺点。
（1）发酵⼯程和酶⼯程⼆者之间，既有联系⼜有区别，因为⼤多数酶剂也是由发酵⽽产⽣的产物，如淀粉酶、糖化酶、蛋⽩酶等。
(2)酶制剂的研究开发涉及产酶菌种选育、⽣产⼯艺、酶反应技术的优化以及酶制剂产品的应⽤，酶制剂能有效带动相关领域技术⽔平的提⾼，包括微⽣物⼯程的技术的提⾼。
7. ⽐较微⽣物⼯程与动植物细胞培养优缺点。
微生物遗传育种名词解释(一)
1、工业微生物菌种：在大规模培养条件下，批量商业性获得微生物细胞或其代谢产物过程中所使用的微生物菌株；或利用微生物特定代谢过程，规模化加工或转化特定底物或环境物料的微生物菌株。
2、天然菌种：通过自然筛选和分离获得的工业菌种。
3、诱变菌种：通过物理、化学等诱变剂在实验室人工诱变自然筛选与分离的菌株，获得产量或/ 和性状改善的工业菌种。
4、重组菌种：通过遗传重组技术对菌种进行定向遗传改良获得的工业菌种。
3、染色体畸变：是指生物细胞中染色体在数目和结构上发生的变化。
包括缺失、重复、倒位和易位。
①缺失：指染色体片段的丢失。
②重复：指染色体片段的二次出现。
③倒位：指染色体的片段发生了180°的位置颠倒，造成染色体部分阶段的位置顺序颠倒，极性相反。
④易位：指一个染色体的一个片段连接到另一个非同源染色体上。
4、基因突变：指一个基因内部遗传结构或DNA序列的任何改变，包括一对或少数几对核苷酸的缺少、插入或置换。
①碱基置换：DNA链上一个碱基对被另一碱基对所取代。
（注意转换和颠换的区别）②移码突变：在DNA序列中由于一对或少数几对核苷酸的插入或缺失而使其后全部遗传密码的阅读框架发生移动，进而引起转录和翻译错误的突变。
5、错义突变：一对碱基的改变使某氨基酸的密码子变为另一氨基酸密码子的突变。
无义突变：一对碱基的改变使某氨基酸的密码子变为终止密码子的突变。
6、形态突变型：指细胞个体形态或菌落形态改变的突变型。
7、营养缺陷型：野生型菌株由于基因突变而丧失合成一种或几种生长因子能力的突变株。
8、抗性突变型：由于基因突变而产生的对某些化学药物、致死物理因子或噬菌体具有抗性的变异菌株叫抗性突变株。
9、致死性突变型：由于基因突变而导致个体死亡的突变型。
10、条件致死性突变型：在某种条件下可以正常繁殖并呈现其固有的表型，而在另一条件下却是致死的突变型叫条件致死突变型。
11、产量突变型：所产生的代谢产物的产量明显有别于原始菌株的突变株称产量突变型。
溶菌酶的性质与应用
溶菌酶的性质与应用孙慧君;张杰【摘要】主要介绍了溶菌酶的结构、性质以及在实际生活、生产中的应用概况.溶菌酶又称N-乙酰胞壁质聚糖水解酶或胞壁质酶,广泛存在于生物体内,它是一种专门作用于某种目的微生物细胞壁的糖苷水解酶,是一种天然的、无毒的、无害的、安全性很高的蛋白酶,被广泛应用于医药制剂、食品、饲料、生物研究等行业.【期刊名称】《哈尔滨师范大学自然科学学报》【年(卷),期】2012(028)005【总页数】3页(P82-84)【关键词】溶菌酶;肽聚糖;性质;应用【作者】孙慧君;张杰【作者单位】哈尔滨师范大学;哈尔滨师范大学【正文语种】中文1 溶菌酶溶菌酶又称N-乙酰胞壁质聚糖水解酶或胞壁质酶［1］，它是一种专门作用于某种目的微生物细胞壁的糖苷水解酶，主要是通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1，4糖苷键，使细胞壁中的不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂，内容物溢出而使细菌溶解.因此，溶菌酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用，是近年来科学家研究探索的又一重点.早在上世纪初科学家就已经开始了对溶菌酶的研究，1922年英国细菌学家Alexander Fleming［2］发现了一种能够有选择性的溶解微生物细胞壁的酶，其大量存在于人的眼泪、唾液中，有较好的溶菌作用，因此把它命名为溶菌酶.此后，人们发现溶菌酶广泛存在于高等动物组织及分泌物、植物和各种微生物中，而它在新鲜鸡蛋中的含量最高，约占3.5%.因此，蛋清也是提取纯化溶菌酶的最佳来源. 1.1 溶菌酶的性质溶菌酶是一种糖苷水解酶，在干燥室温环境下可以长期保存，纯品为白色或微白色结晶型或无定型粉末，无臭、味甜、易溶于水，不溶于乙醚、丙酮等［3］，其化学性质非常稳定，在pH 4～7范围内，100℃处理10 min仍能保持原酶活性，在碱性环境中溶菌酶对热稳定性较差［4］.溶菌酶发挥溶菌作用的最适pH是在6.5左右，最佳反应温度和进行溶菌作用的温度都要在低于50℃范围内，等电点pH为10.5～11.现在对溶菌酶的研究已经比较详细，在实际应用中，溶菌酶具有抗病毒、抗菌、镇痛、消肿、加快组织修复等功能，可用于医疗，更是一种天然的食品防腐剂，还可以用于提取微生物细胞内各类物质和进行原生质体的制备及融合育种［5］.被WHO与许多国家认定为无毒、无害、安全的添加剂.1.2 溶菌酶的结构及作用机理1.2.1 溶菌酶的结构对于溶菌酶的研究最清楚的就是蛋清溶菌酶，它是由18种129个氨基酸残基组成单一肽链.分子内含有4对S-S键.1965年Phillips等人用X射线衍射法［6］分析了蛋清溶菌酶的三维结构，发现溶菌酶的分子构象近椭圆形，大小为4.5 nm × 3.0 nm × 3.0 nm，其中α 螺旋仅占25%，在分子的一些区域有伸展着的β片层结构.Alexander等人［7］经研究发现溶菌酶的内部几乎是非极性的，疏水相互作用在溶菌酶的折叠构象中起着非常重要的作用，它的分子表面有一个能够容纳多糖底物6个单糖的裂缝，这个裂缝即为溶菌酶的活性部位，活性中心为天冬氨酸(Asp52)和谷氨酸(Glu35).1.2.2 溶菌酶的作用机理1959—1963年，通过索尔顿、古伊森、让洛兹等人的研究发现溶菌酶是主要通过肽链中由Glu35和Asp52构成的活性中心水解细菌细胞壁的肽聚糖结构，从而杀死细胞.肽聚糖是由N-乙酰葡萄糖胺、N-乙酰胞壁酸和几个氨基酸短肽聚合成的多层网状大分子构成的，溶菌酶切断N-乙酰葡萄糖与N-乙酰胞壁酸之间的β-1，4糖苷键，Glu35作为糖苷键的质子供体，剪切底物中的C-O键，而作为亲核试剂的Asp52参与生成糖基酶中间体.随后，中间体与水分子发生反应，水解生成产物.使肽聚糖骨架断裂、细胞壁损伤、细胞溶解、最终导致死亡.溶菌酶不仅仅可以溶解细菌的细胞壁，还可以溶解霉菌和酵母菌的细胞壁，通常根据溶菌酶作用的对象不同，将其分为细菌细胞壁溶菌酶、霉菌细胞壁溶菌酶和酵母菌细胞壁溶菌酶等3大类.1.3 溶菌酶的溶菌谱溶菌酶是一种非广谱抗菌剂，它能够有效水解细菌细胞壁中的肽聚糖，革兰氏阳性菌的细胞壁几乎都是由肽聚糖组成的，而革兰氏阴性菌的细胞壁中只有内壁层是由肽聚糖组成的，外层是一层脂蛋白.因此溶菌酶对G+细菌(如金黄色葡萄球菌、溶壁微球菌)的溶菌作用效果最为显著，而对G-细菌(如埃希氏大肠杆菌)的溶菌作用很弱.经研究发现通过对溶菌酶进行改性可以改变它对G-细菌的抑菌效果，将溶菌酶与其它物质如EDTA、有机酸或nic in合用时［8］，其抗菌范围可以扩大到其它腐败性和致病性细菌以及革兰氏阴性菌.研究表明，溶菌酶能够不依赖其酶触功能而具有进一步的抗菌活性 .现已发现，酶的水解作用可以暴露蛋白质的抗菌部分或产生具有抗菌作用的肽，从而提高酶的活性.2 溶菌酶的应用2.1 溶菌酶在医疗中的应用2.1.1 溶菌酶具有抗菌消炎、抗病毒、增强免疫力的功效溶菌酶具有专一性水解细胞壁的特点，对革兰氏阳性菌具有良好的抗菌作用(如枯草芽孢杆菌、溶壁微球菌等)，对埃希氏大肠杆菌等革兰氏阴性菌也具有一定程度的溶菌作用.此外，据研究将一定比例的溶菌酶与抗菌素混合使用，具有较好的协同作用，能够起到抗菌、消炎、祛病强身的作用，因此溶菌酶被广泛应用现代医药行业中.溶菌酶是一种碱性蛋白，在体内环境下带有大量正电荷，能够与带有负电荷的病毒蛋白结合，与DNA、RNA形成复盐，使病毒失去活性.因此，溶菌酶可以被用于预防及治疗一些由病毒引发的疾病，减轻内毒素，从而起到抗病毒的作用.溶菌酶普遍存在于生物体内.作为非特异性免疫因子之一，溶菌酶参与机体的许多免疫反应，在机体的非特异性免疫及正常的防御功能中，具有保持机体生理平衡、增强机体免疫能力的重要作用.2.1.2 溶菌酶可以作为多种疾病的诊断指标1996年Osserman等首次把血清溶菌酶水平的测定作为白血病分型的依据，用于诊断急性白血病.人体的尿液在正常情况下只存在少量的溶菌酶，测量尿中溶菌酶含量，可以作为诊断肾功能障碍的重要依据.2.2 溶菌酶在食品中的应用2.2.1 在乳制品和蛋糕中的应用在欧洲，溶菌酶广泛应用于婴儿食品，人乳和牛乳的主要不同之处，即是其中溶菌酶的含量，人乳中含有大量的溶菌酶，而牛乳中很少.在牛乳制品中添加一定量的溶菌酶，使牛乳制品向人乳转化［9］，改良牛乳品质，通过婴儿吸食牛乳而增强对病菌的抵抗力，使婴儿肠道正常化、成人化，因此将一定量溶菌酶添加到新鲜的牛乳或奶粉中，不但可以起到防腐、保鲜、延长保质期的作用，还有增加营养，促进婴儿健康的作用.在蛋糕、奶油生产中加入一定量的溶菌酶，使它保鲜防霉、有效地延长保质期. 2.2.2 在海产品和水产品保鲜中的应用溶菌酶目前广泛应用于海产品防腐上，通常用质量分数0.05%的溶菌酶、1.5%甘氨酸和3%食盐溶液中浸渍5 min，沥干，常温或冷藏储存，可延长海产品的储存期.2.2.3 在水果保鲜中的应用将溶菌酶和甘氨酸按照一定比例混合涂抹到水果上，可以有效抑制细菌在水果表面的生长繁殖，防止烂果，增加了水果的保鲜期.2.2.4 在低温肉制品中的应用低温肉制品可以保持天然成分，又使营养成分破坏很少，但它的保鲜期短，货架期短，不能满足广大消费者需求.溶菌酶无毒、无害可以将一定浓度的溶菌酶溶液喷洒在低温肉制品上可以起到防腐保鲜的作用［10］.2.3 溶菌酶在饲料中的应用现在抗生素的滥用，不仅细菌使产生了耐药性，更为严重的是药物在动物食品中的残留，对人身体的危害也越来越大.因此，溶菌酶这种天然、安全无毒害的抗菌物质，越来越多的替代抗生素添加到饲料中改善动物的健康状况.1996年邵春荣等［11］用自制的溶菌酶粗品添加到饲料中，使仔猪腹泻下降了22%;同年他又用自制的溶菌酶粗品同样添加在饲料中，使肉仔鸡的成活率提高了14.3% ～17.1%;2002年经李晓辉等研究发现，溶菌酶与免疫球蛋白在功能上有着密切的联系，并能与其他活性物质互补，增强抗体的活性从而杀灭细菌.2006年邱伟海在仔猪的日常粮食中添加了500 mg/kg的溶菌酶，腹泻率比对照组的下降了5% ～50%，基本上达到控制仔猪腹泻的效果，认为溶菌酶可以完全替代抗生素.2.4 溶菌酶在生物研究中的应用在生物研究中，可以利用溶菌酶专一性水解细胞壁的特点，了解细胞壁的结构构造;分解细胞壁后制备的原生质体，可用于微生物育种以及微生物分类学等研究和专用试剂.近年来，溶菌酶已成为细胞工程及基因工程项目中必不可少的一种工具酶，用来制造和提取菌体的活性物质，如核酸、酶和活性多肽等［12］.3 结论现代社会，各种有毒有害的污染日益严重“北京咳”“速成鸡”等等都严重危害着我们的身体健康，在全社会大力提倡绿色食品、绿色环境、绿色生活的今天，溶菌酶以它无毒无害、天然安全的特点引起了人们的广泛关注，它具有稳定的性质，在医疗、食品和生物研究中都起到了十分重要的作用，广泛应用于我们的生产生活中. 近些年，由于溶菌酶越来越多地被人们认可，科学界也展开了溶菌酶的各方面研究，包括溶菌酶的提取与应用等等.据研究发现，通过一系列的生物改良手段已经可以在一定程度上扩大它的抗菌谱，从而更多更广的应用于我们的实际生活中.因此，相信随着科学研究的不断深入，溶菌酶的未来将会有着更广阔的发展前景，也将会更广泛的为人类所用.参考文献［1］景普秋，张复明.工业化与城市化关系研究综述与评价［J］.中国人口资源与环境，2003(3):34-39.［2］刘仲敏，何伯安.溶菌酶及其在食品工业中的应用［J］.食品与发酵工业，1995(5):80-82.［3］沈仁泉，顾其敏.生物化学教程［M］.北京:高等教育出版社，1993.101-105.［4］林亲录，等.鸡蛋卵清中溶菌酶的提取与纯化［J］.食品科学，2002(2):43-45.［5］朱奇，陈彦.溶菌酶及其应用［J］.生物学通报，1998(10):9-10.［6］ Phillips Perry L J.Disulfide bond engineered into T4lysozyme:stabilization of the protein toward thermal inactivation［J］.Science，1965，226:555-55.［7］ Alexander J Exon encode functional and structural units of chicken lysozyme［J］.Pme Natl Acad Sci USA ，1980 ，77(10):57-59.［8］ Ibrahim H R，Matsuzki T，Aoki T.Genetic evidence that antibacterial activity of lysozyme is independent of its catalytic function.FEBS Letters，2001，506:27-32.［9］卢冬梅，王霆.溶菌酶在口腔疾病者的应用.医药导报，2006，25(8):777-779.［10］赵飞龙，徐亚军.鸡蛋清中溶菌酶的应用性研究.食品工业，2006，3:19-20. ［11］自制饲用溶菌酶制剂饲喂肉鸡的效果［J］.江苏农业科学，1996(1):57-58. ［12］ Paola Appendini and Joseph H.Hotchkiss.Immobilization of Lysozyme on Food contact Polymers as Potential Antimicrobial Films ［M］.Packaging Technology and Science，1997.271-279.。
原生质体融合(实验报告)
酵母原生质体融合××××××××××酵母有发酵工业的灵魂之称，其发酵性能的好坏直接影响发酵产品的质量，同时也决定着发酵工艺流程和运转周期及运转费用[1]。
因此，选育优良的酵母菌种在发酵工业中具有重要的意义[2]。
对酿酒酵母的选育始终是酿酒工作者所要从事的重要工作之一。
好的酿酒酵母能够提高酒的质量和产量，赋予酒良好的风味；能够简化工艺流程，减少设备投资；能够缩短发酵周期，降低运转费。
原生质体融合育种( protoplast fusion)是20世纪60年代发展起来的基因重组技术。
通过两个遗传性状不同的亲株原生质体融合从而达到杂交目的。
1960年法国的Barsi研究小组在培养两种不同动物细胞混合时发现了自发融合现象，同时日本的Dkada发现仙台病毒可诱发内艾氏腹水病细胞彼此融合，从而开始了细胞融合的探索。
国内外对原生质体融合技术的研究都比较成熟, 一般认为酵母菌原生质体融合技术的关键点有原生质体的制备和再生、原生质体的融合以及融合子的筛选等。
传统的对酿酒酵母的选育方法主要有自然分离、连续培养和诱变育种[3]。
近年来重组技术，基因工程和原生质体融合技术迅速发展，得到了广泛应用。
两个或两个以上的细胞经过自然的或者人为的作用合并成为一个细胞叫融合细胞，这个过程就称为细胞融合过程。
用微生物作材料进行细胞融合，必须消除细胞壁和细胞膜。
通常采用酶解作用破除细胞壁，采用聚乙二醇促使细胞膜融合。
细胞融合之后，还经过细胞质融合，细胞核重组，细胞壁再生等一系列过程才能形成具有生活能力的新菌株。
融合后的细胞有两种可能：一是染色体DNA不发生重组，两种细胞的染色体共存于一个细胞内，形成异核体，这是不稳定的融合。
另一类是两亲本细胞核染色体DNA真正发生重组。
通过连续传代分离纯化可以区别这两类融合。
应该指出，即便是真正的重组融合子，在传代中也有可能发生分离，产生回复或新的遗传重组体。
植物原生质体在基因转化中的应用研究
植物原生质体在基因转化中的应用研究植物原生质体是指植物细胞在一定的生长条件下，生长到一定的阶段后，通过酶解细胞壁，使细胞质裸露出来的一种活细胞系统。
原生质体含有细胞核、质膜、质体、叶绿体、线粒体等细胞器，具有细胞一般的活力和生命特性，是植物细胞衍生出的诸多细胞形态中最基本的形态。
原生质体在植物中起着重要的作用，如参与植物的生长发育、细胞分裂、物质转运与代谢等生物过程。
基因转化，是指将外源基因导入目标细胞内，并整合到目标细胞的染色体上，使之表现出外源基因所编码的性状或产生外源基因所编码的产物的过程。
基因转化技术是现代生物技术的核心，是实现生物信息化和生物多样性保护、改良、利用的关键技术之一，也是探讨生命科学规律以及人类利用自然资源的基础。
在农业生产和农业科学研究中，利用基因转化技术可实现农作物的育种改良、病虫害控制、环境污染的防控等多个方面。
植物原生质体在基因转化中的应用，源于20世纪70年代初美国生物学家J. G. Scowcroft对植物细胞原生质体的发现。
Scowcroft等人首次报道利用原生质体进行外源基因的整合并表达，打开了利用原生质体进行基因转化的大门。
经过不断的发展，植物原生质体基因转化技术已成为利用植物进行外源基因研究、农业生产和生命科学研究的主要手段之一，在遗传工程研究中有着广泛的应用前景。
其中，利用原生质体进行植物细胞的核酸转化是一项关键性技术。
核酸转化时以大量的DNA或RNA进行转染，使其进入细胞核，与细胞染色体发生作用。
不仅限于核酸的转化，亦可通过悬浮培养细胞、叶片切片、花药等方法引导外源DNA或RNA进入原生质体内，进而实现外源基因转化。
原生质体转化具有转化效率高、快速、仅需少量外源DNA等特点，是植物基因转化中常用的技术之一。
原生质体转化技术在植物基因转化中的应用越来越广泛，能够满足现代农业对于作物优化育种和病虫害抗性的需求。
由于其具有更快的转化速度和更高的转化效率，越来越多的科学家开展了基于原生质体转化的作物育种和改良研究。
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蛋白酶的原生质体转化育种
一实验材料
1.菌种及载体
枯草芽孢杆菌株，带有蛋白酶基因、氯霉素抗生素的载体
2.培养基
1）完全培养基（CM，30ml液体；120ml固体，6个平板）：蛋白胨1.5g，葡萄糖1.5g，酵母膏0.75g，牛肉膏0.75g，NaCl 0.75g，蒸馏水150ml，pH 7.2,
取在120m上述液体培养基中加入2.4g琼脂，配成固体培养基。
2）高渗再生培养基（CMR）200ml：蛋白胨2.2g，葡萄糖2.2g，酵母膏1.1g，牛肉膏1.1g，NaCl 1.1g，蔗糖37.6g，MgCl2 0.8g，琼脂4.4g，pH 7.0 ，1210C，灭菌20min
牛奶10g+100ml水，包扎1100灭菌15分钟，按10%加入固体培养基，然后倒平板。
氯霉素抗性30ul、100mlCMR
3.缓冲液
1）0.1mol/L磷酸缓冲液（pH 6.0）100ml
磷酸二氢钾1.5g，磷酸氢二钾3.5g
2）高渗缓冲液（10ml）：于上述缓冲液中加入0.8mol/L甘露醇。
3）0.9%生理盐水100ml
7*4.5ml，5*4.5ml，其余装入三角瓶灭菌
4）原生质体稳定液（SMM）100ml
17.11g蔗糖，0.4g MgCl2，0.23g顺丁烯二酸，pH6.5
5*4.5ml，其余装入三角瓶灭菌
5）介导剂（5ml）
40%聚乙二醇（PEG-4000）的SMM溶液
6）溶菌酶液
用ＳＭＭ溶液配制，终浓度为１ｍｇ／ｍＬ，过滤除菌备用，（0.1g溶菌酶+1ml的SMM，全班共配这些）
7）器皿
培养皿、移液管、试管、三角瓶、烧杯、离心管、显微镜、台式离心机。
50ml离心管1个二原生质体制备
1菌的培养
分别接30ul亲本菌株到两管装有3ml液体完全培养基（CM）的试管中，370C振荡培养14h，取1ml菌液转接入装有24ml液体完全培养基的250ml锥形瓶中，370C振荡培养3h，使细胞生长进入对数前期。
2010-10-24 星期日
2.收取细胞
取菌液10ml，4000r/min离心10min，弃去上清，将菌体悬浮于10ml磷酸缓冲液中，再次离心，如此洗涤两次，将菌体悬浮于10ml SMM 中。
3.总菌数测定
取菌液0.5ml，用生理盐水稀释，取10-5、10-6、10-7各100ul，在完全培养基上涂板，370C 培养24h后计数。
此为未经酶处理的总菌数。
4.脱壁
取1.5ml菌悬液，加入100ul溶菌酶溶液，溶菌酶浓度为50-100ug/ml，混匀后于370C水浴保温处理30min，定时取样，镜检观察原生质体形成的情况，当95%以上细胞变成球状原生
质体时，用4000r/min离心10min，弃上清液，然后将原生质体悬浮于1.5ml的高渗缓冲液中。
5.剩余菌数测定
取0.5ml上述原生质体悬液，用生理盐水稀释，使原生质体裂解死亡，去10-2,10-3.，10-4
稀释液个0.1ml，涂布于完全培养基平板上，370C培养24~48h，生长出的菌落应是未被酶裂解的剩余细胞。
三原生质体再生
取0.5ml原生质体悬液，用SMM作适当的稀释，去10-3,10-4,10-5稀释液各100ul，加入平板培养基的中央涂布，370C培养24h，分别计算原生质体的再生率，并计算其平均数。
四原生质体转化
在离心管中加入0.1ml原生质体液和10ul质粒DNA，温和混匀后，再加入0.3PEG液，轻轻混匀。
振荡5分钟后加入5mlSMM，终止反应，立即在室温条件下3000rpm离心10min。
吸去上清液，小心地把经转化的原生质体悬液悬浮在1mlSMMP（+BSA）液中，30~370C保温90min。
取200ul涂布在再生抗性平板上，370C培养24h。
2010-10-25 星期一
检出水解圈明显增大的菌株。
清洗所有的器皿，清点，放在盆子里，列清单。