蛋白酶的原生质体转化育种

蛋白酶的原生质体转化育种

一实验材料

1.菌种及载体

枯草芽孢杆菌株，带有蛋白酶基因、氯霉素抗生素的载体

2.培养基

1）完全培养基（CM，30ml液体；120ml固体，6个平板）：蛋白胨1.5g，葡萄糖1.5g，酵母膏0.75g，牛肉膏0.75g，NaCl 0.75g，蒸馏水150ml，pH 7.2,

取在120m上述液体培养基中加入2.4g琼脂，配成固体培养基。

2）高渗再生培养基（CMR）200ml：蛋白胨2.2g，葡萄糖2.2g，酵母膏1.1g，牛肉膏1.1g，NaCl 1.1g，蔗糖37.6g，MgCl2 0.8g，琼脂4.4g，pH 7.0 ，1210C，灭菌20min

牛奶10g+100ml水，包扎1100灭菌15分钟，按10%加入固体培养基，然后倒平板。

氯霉素抗性30ul、100mlCMR

3.缓冲液

1）0.1mol/L磷酸缓冲液（pH 6.0）100ml

磷酸二氢钾1.5g，磷酸氢二钾3.5g

2）高渗缓冲液（10ml）：于上述缓冲液中加入0.8mol/L甘露醇。

3）0.9%生理盐水100ml

7*4.5ml，5*4.5ml，其余装入三角瓶灭菌

4）原生质体稳定液（SMM）100ml

17.11g蔗糖，0.4g MgCl2，0.23g顺丁烯二酸，pH6.5

5*4.5ml，其余装入三角瓶灭菌

5）介导剂（5ml）

40%聚乙二醇（PEG-4000）的SMM溶液

6）溶菌酶液

用ＳＭＭ溶液配制，终浓度为１ｍｇ／ｍＬ，过滤除菌备用，（0.1g溶菌酶+1ml的SMM，全班共配这些）

7）器皿

培养皿、移液管、试管、三角瓶、烧杯、离心管、显微镜、台式离心机。50ml离心管1个二原生质体制备

1菌的培养

分别接30ul亲本菌株到两管装有3ml液体完全培养基（CM）的试管中，370C振荡培养14h，取1ml菌液转接入装有24ml液体完全培养基的250ml锥形瓶中，370C振荡培养3h，使细胞生长进入对数前期。

2010-10-24 星期日

2.收取细胞

取菌液10ml，4000r/min离心10min，弃去上清，将菌体悬浮于10ml磷酸缓冲液中，再次离心，如此洗涤两次，将菌体悬浮于10ml SMM 中。

3.总菌数测定

取菌液0.5ml，用生理盐水稀释，取10-5、10-6、10-7各100ul，在完全培养基上涂板，370C 培养24h后计数。此为未经酶处理的总菌数。

4.脱壁

取1.5ml菌悬液，加入100ul溶菌酶溶液，溶菌酶浓度为50-100ug/ml，混匀后于370C水浴保温处理30min，定时取样，镜检观察原生质体形成的情况，当95%以上细胞变成球状原生

质体时，用4000r/min离心10min，弃上清液，然后将原生质体悬浮于1.5ml的高渗缓冲液中。

5.剩余菌数测定

取0.5ml上述原生质体悬液，用生理盐水稀释，使原生质体裂解死亡，去10-2,10-3.，10-4

稀释液个0.1ml，涂布于完全培养基平板上，370C培养24~48h，生长出的菌落应是未被酶裂解的剩余细胞。

三原生质体再生

取0.5ml原生质体悬液，用SMM作适当的稀释，去10-3,10-4,10-5稀释液各100ul，加入平板培养基的中央涂布，370C培养24h，分别计算原生质体的再生率，并计算其平均数。

四原生质体转化

在离心管中加入0.1ml原生质体液和10ul质粒DNA，温和混匀后，再加入0.3PEG液，轻轻混匀。振荡5分钟后加入5mlSMM，终止反应，立即在室温条件下3000rpm离心10min。吸去上清液，小心地把经转化的原生质体悬液悬浮在1mlSMMP（+BSA）液中，30~370C保温90min。

取200ul涂布在再生抗性平板上，370C培养24h。

2010-10-25 星期一

检出水解圈明显增大的菌株。清洗所有的器皿，清点，放在盆子里，列清单。