凝胶过滤色谱
凝胶过滤色谱实验报告
一、实验目的1. 了解凝胶过滤色谱（Gel filtration chromatography，GFC）的基本原理和操作方法。
2. 掌握凝胶过滤色谱在分离、纯化蛋白质等生物大分子中的应用。
3. 通过实验验证凝胶过滤色谱的分离效果。
二、实验原理凝胶过滤色谱是一种根据分子大小进行分离的技术，其基本原理是利用凝胶的分子筛特性。
凝胶是一种具有多孔结构的物质，孔径大小不一，当混合物通过凝胶时，分子大小不同的物质会被不同程度地阻滞在凝胶孔隙中，从而实现分离。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 蛋白质样品：牛血清白蛋白（BSA）、鸡卵清蛋白（OVA）、酵母提取物（Yeast Extract）- 凝胶色谱柱：Sephadex G-75- 缓冲液：磷酸盐缓冲液（pH 7.4）- 标准分子量蛋白质：分子量分别为6.5×10^4、1.4×10^5、2.0×10^5、4.0×10^5、6.0×10^5的蛋白质混合物2. 实验仪器：- 凝胶色谱仪- 超速离心机- 荧光检测器- 移液器- 离心管- 吸管四、实验步骤1. 准备凝胶色谱柱：将Sephadex G-75凝胶柱安装在凝胶色谱仪上，用磷酸盐缓冲液（pH 7.4）平衡凝胶色谱柱，使其达到稳定状态。
2. 准备样品：将标准分子量蛋白质混合物、牛血清白蛋白、鸡卵清蛋白和酵母提取物分别溶解于磷酸盐缓冲液中，制成蛋白质溶液。
3. 上样：将蛋白质溶液加入凝胶色谱柱，使样品在凝胶色谱柱中均匀分布。
4. 流动：打开凝胶色谱仪，以一定流速（如1 mL/min）进行洗脱，收集洗脱液。
5. 分析：将收集到的洗脱液进行检测，记录蛋白质的洗脱峰，并分析其分子量分布。
6. 离心：将洗脱液中的蛋白质进行离心，分离出蛋白质沉淀。
7. 质量分析：将蛋白质沉淀进行电泳、质谱等分析，验证其纯度和分子量。
五、实验结果与分析1. 凝胶过滤色谱洗脱曲线：通过凝胶色谱仪收集洗脱液，绘制洗脱曲线。
凝胶色谱法
凝胶色谱法添加摘要凝胶色谱法又叫凝胶色谱技术，是六十年代初发展起来的一种快速而又简单的分离分析技术，由于设备简单、操作方便，不需要有机溶剂，对高分子物质有很高的分离效果。
凝胶色谱法又称分子排阻色谱法。
凝胶色谱法主要用于高聚物的相对分子质量分级分析以及相对分子质量分布测试。
目前已经被生物化学、分子生物学、生物工程学、分子免疫学以及医学等有关领域广泛采用，不但应用于科学实验研究，而且已经大规模地用于工业生产。
凝胶色谱法-分类根据分离的对象是水溶性的化合物还是有机溶剂可溶物，又可分为凝胶过滤色谱（GFC ）和凝胶渗透色谱（GPC ）。
凝胶过滤色谱一般用于分离水溶性的大分子，如多糖类化合物。
凝胶的代表是葡萄糖系列，洗脱溶剂主要是水。
凝胶渗透色谱法主要用于有机溶剂中可溶的高聚物 (聚苯乙烯、聚氯已烯、聚乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯等) 相对分子质量分布分析及分离，常用的凝胶为交联聚苯乙烯凝胶，洗脱溶剂为四氢呋喃等有机溶剂。
凝胶色谱不但可以用于分离测定高聚物的相对分子质量和相对分子质量分布，同时根据所用凝胶填料不同，可分离油溶性和水溶性物质，分离相对分子质量的范围从几百万到100以下。
近年来，凝胶色谱也广泛用于分离小分子化合物。
化学结构不同但相对分子质量相近的物质，不可能通过凝胶色谱法达到完全的分离纯化的目的。
凝胶渗透色谱技术原理凝胶色谱法-分子筛效益一个含有各种分子的样品溶液缓慢地流经凝胶色谱柱时，各分子在柱内同时进行着两种不同的运动：垂直向下的移动和无定向的扩散运动。
大分子物质由于直径较大，不易进入凝胶颗粒的微孔，而只能分布颗粒之间，所以在洗脱时向下移动的速度较快。
小分子物质除了可在凝胶颗粒间隙中扩散外，还可以进入凝胶颗粒的微孔中，即进入凝胶相内，在向下移动的过程中，从一个凝胶内扩散到颗粒间隙后再进入另一凝胶颗粒，如此不断地进入和扩散，小分子物质的下移速度落后于大分子物质，从而使样品中分子大的先流出色谱柱，中等分子的后流出，分子最小的最后流出，这Array种现象叫分子筛效应。
凝胶过滤色谱法和凝胶渗透色谱法的区别
凝胶过滤色谱法和凝胶渗透色谱法是生物化学领域常用的两种分离和纯化方法。
它们在分子大小分离和蛋白质结构分析中发挥着重要作用。
今天，我们将深入探讨这两种方法之间的区别，以便更好地理解它们的应用和优势。
一、原理1. 凝胶过滤色谱法：凝胶过滤色谱法是一种按照分子大小分离物质的方法。
它利用具有特定孔径大小的凝胶填料，大分子无法进入凝胶孔隙而直接流出，而小分子则能够进入孔隙而被滞留，从而实现分子的分离和纯化。
3. 凝胶渗透色谱法：凝胶渗透色谱法是一种根据分子在凝胶中的渗透速度来分离物质的方法。
它利用凝胶填料形成的三维网络结构，分子在凝胶中的渗透速度与其分子大小成反比，因此分子越大，其在凝胶中的渗透速度越快，分子越小，渗透速度越慢，从而实现分子的分离和纯化。
二、区别1. 分离原理不同：凝胶过滤色谱法是根据分子大小的不同把大分子和小分子分离开来的，而凝胶渗透色谱法则是根据分子在凝胶中的渗透速度的不同进行分离的。
2. 分子范围不同：在凝胶过滤色谱法中，适用于分离分子量较大的物质，而凝胶渗透色谱法适用于分离各种分子量的物质，并且对于高分子更为有效。
3. 分离效果不同：凝胶过滤色谱法可以获得较好的分离效果，但对于高分子的分离效果不如凝胶渗透色谱法。
而凝胶渗透色谱法可以实现对高分子的高效分离。
三、应用凝胶过滤色谱法常用于分离蛋白质、多肽和核酸等生物大分子，用来检测生物大分子的分子大小和形态。
而凝胶渗透色谱法除了用于生物大分子的分离外，还可以用于溶液中各种溶质的分子量测定。
四、个人观点以上就是凝胶过滤色谱法和凝胶渗透色谱法的区别和应用。
在实际科研工作中，选择合适的色谱方法对于提高分离效率和分析准确性非常重要。
我们需要根据样品的特性和需要进行全面评估，选择合适的色谱方法进行分离和分析。
总结回顾通过本文的讨论，我们对于凝胶过滤色谱法和凝胶渗透色谱法有了更全面的了解。
这两种色谱方法在生物化学和生物医药领域具有重要的应用价值，能够帮助科研人员进行生物大分子的分离、纯化和分析，对于推动生物技术和医药领域的研究具有重要的意义。
凝胶过滤色谱操作规程
凝胶过滤色谱操作规程Gel Filtration Chromatography仪器型号：Lc-10ADVP仪器厂商：日本岛津公司SHIMADZU启用日期：2005.3仪器组件：泵Lc-10ADvp、示差检测器RID-10A、控制器SCL-10Avp、柱温箱CTO-10ASvp可测项目：①适合水溶性物质（如蛋白质、多肽、多糖、DNA、RNA、水溶性的有机聚合物和其他水溶性大分子等）的分离和定量分析②水溶性多组份体系的分子量分布测定。
测试步骤：TSK 2500柱子，分子量测试范围3万以下。
TSK 4000柱子，分子量测试范围百万以下。
1．实验准备：换流动相瓶中水，超声10min赶走气泡，检查废液瓶等。
2．开稳压电源、电脑，打开仪器四组件的电源开关（检测器2500柱子开紫外，4000柱子开示差RID）。
3．赶气泡（一般更换流动相后需要赶气泡），打开泵的排液阀（逆时针旋转180度），（此步骤非常重要！）按LC-10AD面板上的purge键冲洗泵并赶气泡，等purge自动停止后（观察排液管中无气泡跑出），关闭排液阀（顺时针旋转180度），此过程一般需几分钟。
4．开启软件CLASS-VP，点击Instrument 1进入控制界面，在LC Setup Assistant-System页面点击组件图块，在跳出的Instrument Setup界面上编辑方法，主要是设置流动相流速、柱温箱温度和运行时间，设置完毕保存方法（一般不需修改，使用原来方法即可）。
点击快捷键Instrument on，使用该方法控制仪器。
5．示差检测器：点击快捷键RID R.flow on，等10min后再次点击RID R.flow off（即按钮弹起），再过10分钟，点击Balance RID（平衡示差检测器），注意整个流路的压力值（泵组件上的示数），与记录本上前一天的压力值对比（如压力值变化大，可能要清洗流路）；紫外检测器：没有此步骤6．等炉温升到40℃，界面“ready”后走基线。
凝胶过滤色谱名词解释
凝胶过滤色谱名词解释凝胶过滤色谱(gelselution column chromatographic technique)，是一种新型分离技术。
凝胶色谱柱以亲水性高分子凝胶为固定相，利用凝胶良好的吸附、分子筛特性及表面活性等特点将待分离组分吸附在固定相表面上。
凝胶可分为亲水性高分子凝胶与疏水性高分子凝胶，前者为大孔、多孔网状凝胶，后者为微孔、无定形网状凝胶，由于孔径不同，对流动相中不同极性物质有不同选择吸附力，可使极性或非极性物质实现分离。
当样品中混杂的组分经柱子传输至检测器时，样品中组分首先被凝胶中的疏水性成分所吸附，凝胶中的亲水性成分随后被流动相中的流动相携带通过凝胶颗粒间隙向检测器移动，并将其分离。
分析时将被测组分和内标一起加入到样品溶液中，样品中的待测组分会被凝胶中的亲水性成分所吸附，然后样品中被吸附的组分随着流动相向检测器移动，被内标识别并解吸下来，从而得到待测组分的含量。
凝胶过滤色谱的分离机理主要包括吸附和洗脱两个阶段。
吸附过程是在固定相表面发生的。
在这个过程中，柱中的溶剂可能会进入凝胶中，因此样品中的组分被吸附到凝胶颗粒的表面上。
这些固定相颗粒都有各自的孔隙结构，它们的表面积比较大，有利于吸附。
在凝胶吸附过程中，除了样品溶液本身的极性外，溶剂的极性也是吸附过程发生的必要条件。
同时，由于凝胶是高分子材料，因此在受到搅拌作用时，凝胶中会形成较大的内部和外部剪切应力场，这就有利于保证吸附过程的正常进行。
洗脱过程是当样品溶液通过凝胶柱后，由于凝胶的吸附作用，样品溶液中某些组分可能会留在凝胶上，从而影响了后续流动相的吸收，导致浓度信号减弱或消失，这就需要在适当的位置加入流动相把这些“逃逸”的组分重新吸引到柱子上来。
如果不考虑流动相的洗脱能力，则要求样品溶液中被吸附的组分具有较强的洗脱能力。
实际工作中，加入足够量的流动相将样品溶液洗脱下来，是保证仪器稳定运行的关键步骤之一。
所以，要达到好的分离效果，就要选择适合的流动相，且适宜的洗脱条件，但这还远远不够，还需要有好的柱设计，即凝胶色谱柱的理论模型。
简述凝胶过滤色谱分离蛋白质的原理
简述凝胶过滤色谱分离蛋白质的原理
凝胶过滤色谱分离蛋白质是一种非常有效的高精度蛋白质分离方法，它是在现代生物分子技术领域中被广泛应用的工艺。
它可以有效地去除病毒、抗原和多种其他污染物，提高生物系统的纯度，可用于药物研究和药物开发等多个领域。
凝胶过滤色谱分离的原理依赖于对蛋白质的分子大小，电荷和结构的分析，同时还依赖于凝胶纤维的物理属性。
在凝胶过滤色谱分离中，首先从样品中取出溶液，然后将其稀释到分离质谱仪中，在垂直于样品流动方向的静止盒子中加入预处理凝胶，并同时在样品流动路径上安排一个保护液池，同时将流动的样品溶液在冷却管中静止，使样品溶液内的蛋白质和病毒分子在凝胶纤维中逐渐凝结，形成稳定的聚集体。
经过特殊分离处理，污染物聚集体从凝胶中移出，而相应的蛋白质分子保留在凝胶内。
经过特定条件的改变，聚集体不断游离，并以不同的速度由凝胶移出，形成一条梯度图，不断改变分离系统的压力和温度，可以有效地改变梯度图的形状，以实现最佳的分离效果。
最终的分离结果可以非常清晰地显示出蛋白质的迁移路径。
分离结果可以用于分析蛋白质的数量和结构，也可以用于药物的研发和临床应用的评估。
因此，凝胶过滤色谱分离法是一种高精度、有效的蛋白质分离方法，可用于从样品中有效地提取蛋白质，具有很强的应用价值。
它不仅可以有效地滤除污染物，提高蛋白质质量，而且能够有效掌握蛋白
质的结构和组成，为药物研究和药物开发提供了灵活的分析工具，为科学家和医学界提供帮助。
总之，凝胶过滤色谱分离蛋白质可以有效提取高纯度的蛋白质，且具有高精度的分离能力，是现代生物分子技术研究中不可缺少的生物分子分离手段。
蛋白纯化方法—凝胶过滤色谱
活性蛋白整体方案凝胶过滤色谱摘要：本文主要讲解了凝胶过滤色谱法（分子筛）在蛋白纯化实验中的应用，包括纯化原理、实验方案设计、技术操作以及相关案例介绍和问题分析。
基本原理凝胶过滤色谱蛋白纯化法，又称为空间排阻色谱，分子筛等。
其原理是应用蛋白质分子量或分子形状的差异来分离。
当样品从色谱柱的顶端向下运动时，大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒从而被迅速洗脱；而较小的蛋白质分子能够进入凝胶颗粒中，且进入凝胶的蛋白在凝胶中保留时间也不同，分子量越大，流出时间就越早，最终分离分子大小不同的蛋白质。
凝胶过滤色谱原理通常，多数凝胶基质是化学交联的聚合物分子制备的，交联程度决定凝胶颗粒的孔径。
常用的色谱基质有：葡聚糖凝胶（Sephadex）、琼脂糖凝胶（Sepharose）、聚丙烯酰氨凝胶（Bio-Gel P）等。
高度交联的基质可用来分离蛋白质和其他分子量更小的分子，或是除去低分子量缓冲液成分和盐，而较大孔径的凝胶可用于蛋白质分子之间的分离。
选用合适孔径的凝胶很大程度取决于目标蛋白的分子量和杂蛋白的分子量。
实验方案设计1.凝胶介质的选择凝胶介质的选择主要是根据待分离的蛋白和杂蛋白的分子量选择具有相应分离范围的凝胶，同时还需要考虑到分辨率和稳定性的因素。
比如，如果是要将目的蛋白和小分子物质分开，可以根据他们分配系数的差异，选用Sephadex G-25和G-50；对于小肽和低分子量物质的脱盐，则可以选用Sephadex G-10、G-15以及Bio-Gel P-2或P-4；如果活性蛋白整体方案是分子量相近的蛋白质，一般选用排阻限度略大于样品中最高分子量物质的凝胶。
具体凝胶过滤色谱介质应用如下：常用凝胶过滤色谱介质的分离范围凝胶介质蛋白质的分离范围/103凝胶介质蛋白质的分离范围/103Sephadex G25 Sephadex G50 Sephadex G100 Sephadex G200 Sepharose6B Sepharose4B1~51.5~304~1505~60010~400060~20000Sepharose2BBio-Gel P-4Bio-Gel P-10Bio-Gel P-60Bio-Gel P-150Bio-Gel P-30070~400000.5~45~1730~7050~150100~4002.凝胶介质的预处理凝胶在使用前应用水充分溶胀（胶：水=1：10），自然溶胀的耗时较长，可采用加热的方法使溶胀加速，即在沸水浴中将凝胶升温至沸，1~2h即可达到溶胀。
凝胶过滤色谱柱说明
rat liver microsome
Elution : (0.2mol/l sodium chloride +20%glycerol +
octaethyleneglycol dodecylether) in 50mmol/l
phosphate buffer,ph 7.0. Note : concentration
2008 -12 volume 15
Applications of TSK-GEL SW-type Gel Filtration columns
Higher resolution with 5um TSK-GEL SWXL compared with 10um TSK-GEL SW columns
Separation of membrane protein by SEC with different surfactant concentration in the eluent
Column : TSKgel G3000SW ,7.5mm ID*60cm
Sample : Membrane protein from a crude extract from
Separation of crude protein samples on TSKgel G3000SWxl.
Column : Sample:
Elution : Flow Rate ; Detection : Recovery :
TSK gel G3000SWXL,5um,7.8mm ID *30cm A. crude peroxidase from Japanese radish, 0.15mg in 0.1ml B. crude glutathione S-transferase from guinea pig liver extract ,0.7mg in 0.1ml 0.3mol/l NaCL in 0.05mol/l phosphate buffer ,ph 7 1.0ml/min
不同多肽分子量占比测定方法凝胶过滤色谱
不同多肽分子量占比测定方法凝胶过滤色谱
凝胶过滤色谱（gel filtration chromatography）是一种常用的分
子量分析方法，可以用于测定不同多肽分子量的占比。
具体操作如下：
1. 准备凝胶柱：选择合适的凝胶颗粒，如琼脂糖（sephadex）等，根据待测样品的分子量范围选择合适的孔径大小的凝胶柱。
2. 将凝胶柱装置到色谱仪中，并进行平衡：用合适的缓冲液对凝胶柱进行平衡，使凝胶颗粒充分膨胀。
3. 样品加载：将待测多肽样品溶解在适当的样品溶液中，并将其加载到凝胶柱上。
4. 进行洗脱：通过缓冲液缓慢地通过凝胶柱，大分子会在凝胶中占据较大空间，通过速度较快；而小分子则可以渗透凝胶，速度较慢。
5. 捕集洗脱的组分：在洗脱过程中，收集不同组分随时间洗脱下来的分画，并进行进一步分析。
6. 分析各分画：可以通过比色法、荧光法、质谱等方法对分画进行分析，确定不同多肽组分的分子量占比。
需要注意的是，凝胶过滤色谱仅能提供相对分子量的信息，不
能确定具体的分子量数值。
为了准确测定不同多肽分子量的占比，还需要结合其他实验技术进行分析。
凝胶过滤色谱原理
凝胶过滤色谱原理
凝胶过滤色谱是一种常用的分离和纯化生物大分子的方法。
它基于样品分子在凝胶基质中的大小排列来实现分离。
在凝胶过滤色谱中，通常使用多孔度不同的凝胶基质，如琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶等。
这些凝胶基质具有规则的孔隙结构，可以限制分子在凝胶中的自由扩散。
较大的分子将被阻挡在孔隙之外，而较小的分子则能够进入凝胶内部。
样品通常在一定浓度的缓冲液中进行注入，缓冲液的选择要使得待分离的分子稳定、水溶性好。
样品溶液在凝胶表面形成一个样本区，然后逐渐渗入凝胶内部。
在样本渗入过程中，凝胶基质将限制大分子的运动，使其停留在凝胶表面或孔隙之外，而较小的分子能够进入凝胶内部，逐渐向凝胶深处扩散。
最终，分子根据其大小在凝胶中被分离成不同的区带。
较大的分子留在凝胶的近表面区域，而较小的分子则可以进入凝胶离凝胶表面较远的区域。
因此，在从凝胶中洗脱样品时，先洗脱出较小的分子，然后依次洗脱出较大的分子。
凝胶过滤色谱广泛应用于生物大分子的纯化和分析。
它可以用于分离蛋白质、核酸、多肽等生物大分子，并且对样品的体积要求较小。
同时，凝胶过滤色谱的操作相对简单，且不需要高压。
因此，它成为了生物化学和生物制药领域中不可或缺的技术之一。
凝胶色谱法的原理
凝胶色谱法的原理凝胶色谱法是一种以分离样品中不同分子大小为基础的色谱技术。
它包括两种主要类型：凝胶过滤色谱和凝胶吸附色谱。
凝胶色谱法的主要原理是利用在基质中固化的凝胶材料的孔径大小来分离不同分子大小的样品，从而实现样品组分的分离和纯化。
凝胶过滤色谱是最常见的凝胶色谱类型之一，它是基于溶液中的分子在凝胶层内的孔径大小选择性分布的原理进行分离。
凝胶层可以是天然多糖（如琼脂和琼脂糖）或人工合成的凝胶材料（如琼脂糖醚、聚丙烯酰胺凝胶等）。
样品溶液通过凝胶层的孔径时，较大的分子无法穿过较小的孔径，因此会被凝胶层阻滞，而较小的分子可以更容易通过较大的孔径，从而分离出来。
凝胶过滤色谱主要用于蛋白质、核酸等生物大分子的分离和纯化。
凝胶吸附色谱是另一种常见的凝胶色谱类型，它是基于样品分子与固相凝胶材料之间的亲疏水性差异进行分离的原理。
凝胶吸附色谱使用有官能团的凝胶材料，样品中的分子通过与凝胶材料上的官能团发生相互作用来分离。
官能团可以是疏水基、静电基、亲和基等，不同的官能团决定了凝胶材料与分子之间的作用力。
样品中的分子与凝胶材料上的官能团之间的相互作用使分子在凝胶中停留的时间不同，从而实现分离。
凝胶色谱法的选择性和分离能力主要取决于凝胶材料的孔径大小和分子与凝胶材料之间的相互作用。
凝胶材料的孔径大小对分离效果具有决定性的影响，孔径越小，分离越强。
凝胶材料可以通过调整交联度或改变凝胶材料的成分来改变其孔径大小。
分子与凝胶材料之间的相互作用也可以通过调整凝胶材料的官能团或改变溶液条件来改变。
此外，凝胶色谱法还可以通过改变输运溶液的流速或溶液温度来控制分离的速度和分辨率。
总之，凝胶色谱法是一种基于分子大小和相互作用的色谱技术，通过调整凝胶材料的孔径大小和官能团，以及调节输运溶液的条件，可以有效地分离和纯化样品中的分子。
凝胶色谱法在生物技术、生物医药和生物化学等领域具有广泛的应用价值。
吸附色谱 分配色谱 凝胶过滤色谱的分离原理
【序号一：吸附色谱】在色谱分离技术中，吸附色谱是一种常见的分离方法。
它利用样品成分与吸附剂之间的吸附/脱附作用来实现分离。
吸附色谱的分离原理基于不同成分在吸附剂上的吸附性能不同，从而实现样品成分的分离。
对于吸附色谱的理解，我们首先需要了解吸附剂的选择对分离效果的影响。
常见的吸附剂包括硅胶、炭黑、离子交换树脂等，它们的吸附性能不同，适用于不同类型的样品。
样品成分的极性、分子大小等特性也会影响吸附色谱的分离效果。
在实际操作中，吸附色谱通常采用柱层析法进行分离。
样品混合物首先被加载到色谱柱中，然后通过适当的溶剂进行洗脱，不同成分将以不同速度移动，并最终被分离出来。
这种分离方法在生物化学、药学、环境监测等领域有着广泛的应用。
【序号二：分配色谱】与吸附色谱相对应的是分配色谱。
分配色谱是利用固定相和移动相之间的分配作用，将组分按照其在两相之间分配系数大小的不同进行分离的方法。
分配色谱的分离原理是样品成分在两相之间的分配系数不同，从而在固定相上呈现不同的留度时间，最终实现分离。
在分配色谱中，固定相通常是多孔吸附树脂、硅胶或高分子物质，而移动相则是由溶剂和添加的缓冲液组成。
通过控制流动相的性质和条件，可以实现对不同成分的选择性分离。
这种色谱方法适用于天然产物的提取、天然药物的分离等方面。
【序号三：凝胶过滤色谱的分离原理】凝胶过滤色谱是一种利用孔径大小对分子进行分离的色谱方法。
它的分离原理是基于不同大小的分子能否进入凝胶颗粒孔隙的不同，从而实现分子的分离。
相对于其他色谱方法，凝胶过滤色谱对大分子的分离效果更显著。
在凝胶过滤色谱中，凝胶通常是由聚合物或硅胶制成的微小颗粒组成，这些颗粒具有不同大小的孔隙，其孔径大小决定了能通过的分子大小。
而移动相则是用于提供流动条件的缓冲液。
通过调整孔径大小和流速，可以实现对不同大小分子的选择性分离。
【总结与个人观点】通过对吸附色谱、分配色谱和凝胶过滤色谱分离原理的探讨，我们可以发现不同的色谱方法在分子分离中有着各自独特的优势。
2024凝胶过滤层析结合液相色谱-串联质谱法测定血清中游离甲状腺激素
2024凝胶过滤层析结合液相色谱一串联质谱法测定血清中游离甲状腺激素基于凝胶过滤层析(GFC)进行前处理，结合液相色谱-串联质谱(1C-MS/MS)建立了血清中游离三碘甲腺原氨酸(FT3)和游离甲状腺素(FT4)的高通量、高灵敏检测新方法。
选用Sephadex1H-20凝胶小柱对150μ1血清样本进行过滤分离，先用Tris-HCI缓冲液(0.1mo1∕1,pH7.4)淋洗去除结合蛋白的甲状腺激素，然后用甲醇对游离的甲状腺激素进行洗脱，采用1C-MS/MS法进行检测和定量，并进行方法学验证。
结果显示：FT3和FT4的线性相关系数(⑵均不小于0.9995,批内及批间相对标准偏差为18%~10%,准确度为85.4%-110%z基质效应为85.8%-114%z回收率为85.8%~107%o采用该方法与平衡透析法(ED)同时检测了95份血清样本，使用IBMSPSSStatistics26和MedCaIc统计软件(v.20.0.0)对检测结果进行配对t检验分析、PaSSingBab1ok回归分析和B1and-AItman 一致性分析。
结果表明，GFC∕1C-MS/MS与ED∕1C-MS∕MS法对血清中FT3、FT4的测定结果无统计学差异(P>0∙05).所建立的方法快速、简便，受干扰因素相对较少，便于临床推广，可为临床实验室游离甲状腺激素的快速、高效、准确检测提供参考方法，同时为其它游离激素的检测提供了一种新的思路。
三碘甲腺原氨酸(Triiodothyronine,T3)和甲状腺素(Thyroxine,T4)是两种主要的甲状腺激素，其分泌量的增多或减少均可导致甲状腺功能障碍，并可增加心血管疾病、糖尿病并发症和妊娠并发症的发生风险。
正常情况下，T3、T4分别约99.7%和99.97%与特异的血浆蛋白相结合，仅有0.3%和0.03%为游离状态，简称为FT3和FT4o而游离激素假说认为，甲状腺激素的游离形式才是其活性部分，与生物效应密切相关。
凝胶过滤色谱法
凝胶过滤色谱法
凝胶过滤色谱法（Gel Filtration Chromatography），也被称为分子筛色谱或凝胶渗透色谱，是一种常用的生物分离和纯化技术。
它基于样品分子在凝胶填料中的分子尺寸差异来实现分离。
工作原理是通过在色谱柱中填充具有特定孔径大小的凝胶填料，较大的分子在凝胶中较快通过孔隙，而较小的分子由于进入填料内部的孔隙较多而较慢通过。
因此，分子的分离程度取决于其尺寸，大分子被排除在凝胶颗粒外部，较小分子则更容易渗透到凝胶颗粒内部。
凝胶过滤色谱法通常用于分离和纯化蛋白质、多肽、核酸等生物大分子。
它可以去除小分子杂质，同时可以根据分子大小分离具有不同尺寸的目标分子。
该方法操作简单，无需特殊的溶剂，对生物大分子具有较好的保护性，不会对其结构和活性产生显著影响。
在凝胶过滤色谱法中，填料的孔径大小是一个重要的参数，需要根据目标分子的分子量范围选择适当的凝胶填料。
常用的填料包括琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶等，它们具有不同的孔径范围，可满足不同分子大小的分离需求。
凝胶过滤色谱原理
凝胶过滤色谱原理凝胶过滤色谱是一种常用的生物分离技术，它基于分子在凝胶基质中的大小和形状差异而进行分离。
在凝胶过滤色谱中，样品中的大分子会被排除在凝胶颗粒外部，而小分子则能够渗透进入凝胶颗粒内部，从而实现分离。
本文将介绍凝胶过滤色谱的原理及其应用。
凝胶过滤色谱的原理主要包括两个方面，凝胶基质和分子分离。
首先，凝胶基质是凝胶过滤色谱的关键组成部分。
凝胶基质通常由聚合物构成，其孔隙大小可以根据实验需要进行调控。
大分子无法进入较小的孔隙，因此会被排除在凝胶颗粒外部；而小分子则可以进入较小的孔隙，从而被分离。
其次，分子分离是凝胶过滤色谱的核心原理。
在样品通过凝胶基质时，大分子会受到阻滞而流经凝胶基质的速度较慢，而小分子则能够快速通过凝胶基质。
通过这种方式，不同大小和形状的分子可以被有效地分离。
凝胶过滤色谱在生物分离和分析中有着广泛的应用。
首先，凝胶过滤色谱可以用于分离蛋白质。
蛋白质通常具有不同的大小和形状，因此可以通过凝胶过滤色谱进行分离。
其次，凝胶过滤色谱也可以用于寡核苷酸和多核苷酸的分离。
由于寡核苷酸和多核苷酸的大小差异较大，因此可以通过凝胶过滤色谱进行有效的分离。
此外，凝胶过滤色谱还可以用于分离细胞器和病毒等生物颗粒。
通过调控凝胶基质的孔隙大小，可以实现对不同大小的生物颗粒进行分离。
总之，凝胶过滤色谱是一种重要的生物分离技术，其原理简单而有效。
通过调控凝胶基质的孔隙大小，可以实现对不同大小和形状的分子进行有效的分离。
在生物领域中，凝胶过滤色谱有着广泛的应用，可以用于蛋白质、寡核苷酸、多核苷酸、细胞器和病毒等生物颗粒的分离。
因此，凝胶过滤色谱在生物分离和分析中具有重要的地位，对于生物科学研究具有重要的意义。
空间排阻色谱法
二、凝胶色谱法的固定相
1、分类 （1）软质凝胶 （2）半刚性凝胶 （3）刚性凝胶 2、特性参数 （1）排阻极限：指凝胶可用来分离化合物（组分）分子量的最大 值 （2）分离范围：lgM-Ve校正曲线的线性范围 （3）固流比（VP/V0）：凝胶色谱法中，将柱中凝胶孔体积VP中的 溶剂称做固定相，凝胶颗粒间体积V0中的溶剂称作流动相，它们的 比值称做相比。表示凝胶柱的分离容量。
一、空间排阻色谱的分离原理
固定相---多孔凝胶 流动相---水→凝胶过滤色谱 有机溶剂→凝胶渗透 1 、分离机制 利用凝胶的孔径与被分离 组分分子线团尺寸相对大小 关系而对高分子溶液进行分 离分析（类似分子筛）
分离依据：空间排斥理论
具有不同大小的样品分子，严格按照凝胶孔径大小பைடு நூலகம்柱内进 行分配。分配平衡时： [Xs ] 渗透系数： K P [ ]
1、凝胶渗透色谱法的流动相 四氢呋喃、N,N一二甲基酰胺、临二氯苯、 1,2,4一三氯苯 注意 ：四氢呋喃储存过程中容易形成过 氧化物，特别在日光照射下形成的更快。
2、凝胶过滤色谱法的流动相 具有不同pH值的缓冲溶液
三、凝胶色谱法的流动相
凝胶色谱法主要依据凝胶的孔容及孔径分布与样品分 子量大小及分子量分布的相互匹配来实现不同的组分的分 离，而与样品、流动相之间的相互作用无关。因此，不能 通过改变流动相组成的方法改善分离。 （1）用作流动相的溶剂应对样品由较好的溶解能力。 （2）流动相与柱中的凝胶固定相相互匹配，能浸润凝胶， 防止凝胶吸附 （3）与检测器匹配 （4）粘度小
X
m
溶质在凝胶柱内的容量因子kP为：
k
p
K P VP
V
0
VP 凝胶固定相全部可渗透的孔洞体积（孔容）。 V0 凝胶柱中固定相间空隙的体积。 如果凝胶所有孔洞都能接受样品分子时[XS]=[Xm] ，此时KP=1.0, 此即为凝胶的渗透极限。 若果凝胶所有的孔洞不能使样品分子进入时[XS]=0，此时KP=0, 此即为凝胶的排阻极限
凝胶色谱gpc
凝胶色谱gpc凝胶色谱（GPC）是一种分离技术，其特点是使用凝胶作为分离介质，因此得名。
GPC是一种广泛应用于聚合物分子量分析的方法。
它具有许多优点，如高分辨率、简单易行、准确性高等特点。
本文将从定义、原理、应用等方面详细介绍GPC技术。
一、定义凝胶色谱（GPC），又称凝胶过滤色谱（GFC），是一种以聚合物溶液中分子量大小分离为目的的色谱技术，通过使用一种凝胶化合物作为固定相来实现。
异构体、聚合物和其他高分子物质可以被凝胶过滤器赶出溶液，从而有效进行分析。
二、原理 GPC的原理是将待测样品注入溶剂中，并通过进样系统将样品引入色谱柱中。
色谱柱由一束微粒、凝胶或涂层柱组成，包括高分子树脂、泡沫塑料或其他亲水性材料。
样品通过色谱柱流动时，大分子会因分子量大而与凝胶颗粒反复碰撞，并逐渐逐出柱外。
相反，小分子则更容易穿过凝胶颗粒，达到提取分子的目的。
由于某些原因，大分子的分离能力非常重要。
其中最重要的条件是使用疏水性溶液，这有助于分子与凝胶颗粒产生亲水作用，并排出大分子分子，以谷物的形式进行检测和分离。
其次，为了获得最好的分离效果，GPC操作需要优化。
包括确定外径，内径，粒径，压强，长度和运行时间等参数。
三、应用 GPC技术广泛应用于聚合物分子量分析、生物大分子的纯化和组分分离，其中聚合物分子量分析是GPC 的主要应用之一，把聚合物以及其他宏大分子按照其不同的分子量分离出来，并对其分子量进行测定。
GPC广泛用于各种行业，尤其是化学、医药、材料科学等领域。
GPC技术因其简单易实施，又不需高百科技含量，被广泛用于聚合物领域中分子量的分析。
聚合物的分子量和分子分布是对其性质、应用和储存特性影响较大的一个参数，因此GPC技术已经成为聚合物科研和实际应用领域的日常工具。
（一）在功能材料领域中GPC的应用：用于纤维素的结构性能研究；碳纤维复合材料中的聚合物基质性能的研究；用于电池电极材料的研究。
（二）在生命科学领域中GPC的应用：GFC已经成为蛋白质化合物的一种得到纯化的方法；纯化或高净度生物材料的时序性分析；用于多肽或蛋白质的计量。
凝胶色谱法
凝胶色谱法凝胶色谱法添加摘要凝胶色谱法又叫凝胶色谱技术，是六十年代初发展起来的一种快速而又简单的分离分析技术，由于设备简单、操作方便，不需要有机溶剂，对高分子物质有很高的分离效果。
凝胶色谱法又称分子排阻色谱法。
凝胶色谱法主要用于高聚物的相对分子质量分级分析以及相对分子质量分布测试。
目前已经被生物化学、分子生物学、生物工程学、分子免疫学以及医学等有关领域广泛采用，不但应用于科学实验研究，而且已经大规模地用于工业生产。
凝胶色谱法-分类根据分离的对象是水溶性的化合物还是有机溶剂可溶物，又可分为凝胶过滤色谱（GFC ）和凝胶渗透色谱（GPC ）。
凝胶色谱系统凝胶过滤色谱一般用于分离水溶性的大分子，如多糖类化合物。
凝胶的代表是葡萄糖系列，洗脱溶剂主要是水。
凝胶渗透色谱法主要用于有机溶剂中可溶的高聚物 (聚苯乙烯、聚氯已烯、聚乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯等) 相对分子质量分布分析及分离，常用的凝胶为交联聚苯乙烯凝胶，洗脱溶剂为四氢呋喃等有机溶剂。
凝胶色谱不但可以用于分离测定高聚物的相对分子质量和相对分子质量分布，同时根据所用凝胶填料不同，可分离油溶性和水溶性物质，分离相对分子质量的范围从几百万到100以下。
近年来，凝胶色谱也广泛用于分离小分子化合物。
化学结构不同但相对分子质量相近的物质，不可能通过凝胶色谱法达到完全的分离纯化的目的。
凝胶色谱仪凝胶渗透色谱技术原理凝胶色谱法-分子筛效益一个含有各种分子的样品溶液缓慢地流经凝胶色谱柱时，各分子在柱内同时进行着两种不同的运动：垂直向下的移动和无定向的扩散运动。
大分子物质由于直径较大，不易进入凝胶颗粒的微孔，而只能分布颗粒之间，所以在洗脱时向下移动的速度较快。
小分子物质除了可在凝胶颗粒间隙中扩散外，还可以进入凝胶颗粒的微孔中，即进入凝胶相内，在向下移动的过程中，从一个凝胶内扩散到颗粒间隙后再进入另一凝胶颗粒，如此不断地进入和扩散，小分子物质的下移速度落后于大分子物质，从而使样品中分子大的先流出色谱柱，中等分子的后流出，分子最小的最后流出，这种现象叫分子筛效应。
凝胶色谱
3. 凝胶的制备
• 商品凝胶是干燥的颗粒使用前需直接在欲使用的洗 脱液中膨胀。为了加速膨胀，可用加热法，即在沸 水浴中将湿凝胶逐渐升温至近沸，这样可大大中速 膨胀，通常在1-2小时内即可完成。特别是在使用软 胶时， 自然膨胀需24小时至数天，而用加热法在几 小时内就可完成。这种方法不但节约时间，而且还 可消毒，除去凝胶中污染的细菌和排除胶内的空气。
1. 葡聚糖凝胶
• 葡聚糖凝胶是应用最广泛的一类凝胶，国 外商品名为Sephadex。它由葡聚糖 Dextran交联而得。交联剂在原料总质量 中所占的百分数叫交联度。交联度越大， 网状结构越紧密，吸水量越小，吸水量越 小，吸水后体积膨胀越少；反之，交联度 越小，网状结构越疏松，吸收量越多，吸 水后体积膨胀越大。
色谱柱的使用下限就是当聚合物中最大尺寸的分子链 比凝胶孔的最小孔径还要小，这时也没有达到分离不同相 对分子质量的目的。所以在使用凝胶色谱仪测定相对分子 质量时，必须首先选择好与聚合物相对分子质量范围相配 的色谱柱。
溶剂的选择：
能溶解多种聚合物 不能腐蚀仪器部件 与检测器相匹配
四、实验技术
• ②高分子材料中小分子的 定性鉴别
• 和其他色谱方法一样， GPC也可以用保留体积来 鉴别或分离后用IR等方法 鉴定中小分子物质。这里 介绍一种便利方法。如果 能预测某未知峰属于某种 化合物，则将该化合物加 入该试样中，比较前后的 谱图变化，如果未知峰强 化，则很可能就是该物质。
• 2）在高分子材料生产过 程中的检测
• A:高分子 B:添加剂和齐聚 物C：未反应的单体和低 分子的污染物如水。
• ①环氧树脂中树脂和齐聚 物的同时分析
• 普通双酚A型的环氧树脂 有很宽的分子量范围，包 括低分子量的，中等分子 量的，高分子量的产品。 GPC能快速可靠的鉴别不 同类型环氧树脂的分子量 特性。
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主要缺点：
分辨率及峰 容量均相对 较低。
凝胶过滤色谱的分离原理
◆凝胶过滤色谱是在装填有多孔性材料的色谱柱 如果溶质分子的尺寸大于孔径，则只能从孔旁 中进。 流过。这意味着体积较小的分子能占有更多的 ◆当流动相携带分子量不同的溶质进入色谱柱后。 孔体积。这样，分子体积不同的混合物一起进 ①因浓度差而可能渗入或扩散进入填料的孔中， 入柱端时，经过淋洗、扩散，总是体积大的分 即溶质在两相中的运动是由浓度梯度推动的。 子先流出柱子，小分子量即体积小的分子印刻 ②分子体积的大小，造成了在孔中扩散途径的 进入凝胶的孔中，使其行程延长而滞后流出， 差异，溶质分子只能进入尺寸比它大的孔； 从而使分子体积不同的分子得以分离。
凝胶过滤色谱的应用
• 例3.葡聚糖凝胶过滤色谱柱法测定两种氨基 酸锌螯合物螯合率的差异性
采用葡聚糖凝胶过滤色谱柱法测定蛋氨酸锌、苏氨酸锌两 种氨基酸锌螯合物的螯合率，发现该法测定结果与其他测 定方法分析结果一致，表明此法适用于测定蛋氨酸锌的螯 合率 但测定苏氨酸锌螯合物的螯合率时，测定结果与其他测定 方法分析结果不一致，结合葡聚糖凝胶过滤色谱柱法测定 过程，表明此法不适用于测定苏氨酸锌的螯合率。
常见凝胶过滤色谱填料
• 表11-8列出了常见的无机型亲水凝 胶，尽管牌号各异，但其化学本质 几乎均是二醇型化学键合硅胶。 二醇型化学键合硅胶。 二醇型化学键合硅胶
！
见书本247页 页 见书本
凝胶过滤色谱的应用
• 例1.凝胶过滤色谱分离大豆抗氧化肽活性
利用木瓜蛋白酶水解大豆分离蛋白制备大豆肽的水解 液，水解液经Sephadex G-25凝胶过滤色谱进行分子量 分级，根据分离图谱确定柱层析的最佳条件。 在最佳条件下绘制标准曲线，并根据标准曲线判断分离 组分的分子量分布。采用铁离子还原/抗氧化能力测定 法（FRAP）、二苯基苦基苯肼法（DPPH）以及金属 铜离子螯合能力测定法研究不同分子量大豆肽的抗氧化 能力，并对抗氧化活性最佳的肽段进行进一步的HPLC 分离和氨基酸组成分析
凝胶过滤色谱填料
第三组
目录
凝 胶 过 滤 色 滤 色 谱 填 料
概 述
凝 胶 过 滤 色 谱 分 离 原 理
凝 胶 色 谱 填 料 的 制 备
凝 胶 过 滤 色 谱 的 应 用
概述
体积排除色谱（ 体积排除色谱（SEC） ） 凝胶过滤色谱是体积排除色谱（SEC）的一种。
溶质只依据其分子体积（流体力学体积） 的大小而分离。
与其他色谱相比较的优点：
①出峰迅速，任何组分的保留体积均在Vi 和V0之间，且不需要梯度淋洗。 ②溶质与固定相（填料）和流动相之间没 有相互作用。 ③分离时不会滞留杂质或残留物在柱上， 故柱寿命长。
与其他色谱相比较的优点：
④可用于测定生物大分子的分子量 ⑤生物相容性好，有很高的活性回收 率 ⑥负载量较大，利于制备分离。
关系到凝胶色谱柱 因此，用作凝胶 的分离容量。根据 粒径及粒径分影响 分离介质的硅胶， 凝胶色谱柱的一般 其柱效 理论，孔容愈大， 必须具有较高的 所填装的柱子的分 例如，通常所使用 孔度。对于多空 辨率和柱子的容量 的直径5um的软 硅胶而言，Ψ一 就愈高。因此，用 般在0.6~0.7， 胶，能达到理论塔 作凝胶分离介质的 故Vi/V 0值应在 板数1500/m左右 硅胶，必须具有较 1.05~1.23之间 的柱效 高的孔容。
！
由工作曲线可确定该凝胶过滤色 谱柱的分离范围，指的是工作曲 线线性部分所对应的分子量区间。
凝胶色谱填料的制备
• 未经化学键合或改性的多空硅胶或可控孔径玻璃 未经化学键合或改性的多空硅胶或可控孔径玻璃，可以直 接用于中性糖的寡聚物和聚合物的分离，近年来，经葡聚 糖键合至硅胶上或包敷在硅胶上制成的填料亦有报道和销 售。但用于生物高分子，如蛋白质、核酸等分离时，还是 以进行表面亲和处理为宜。即将其表面加以修饰，令其带 上亲水性基团。 • 制备方法如下：见书246 制备方法如下：见书 • 即以环氧丙基三甲氧基硅烷为硅烷化试剂，以高孔隙度硅 胶为基质，键合反应后，再令其环氧基开环，生成二醇型 化学键合硅胶。
世 纪 年 代 中 期
以可控孔径玻璃（CPG）、 可控孔径玻璃（ ）、 硅胶为基质的无机基质高效 硅胶为基质的无机基质高效 凝胶色谱填料和以合成高分 凝胶色谱填料和以合成高分 子或高交联天然高分子为基 子或高交联天然高分子为基 质的 机高效凝胶色谱填料 基 可 以
20 70
！！！
粒度及粒度分布 孔径或孔径分布 孔容
凝胶过滤色谱填料的种类和性能
早 期
用于凝胶色谱的填料主要是 用天然的多糖类原料 多糖类原料制成的， 多糖类原料 它们的机械强度低，粒径较 机械强度低， 机械强度低 大而不均匀， 大而不均匀，很难在高流速 流 ， 很低
理想的高效凝胶色谱填料应具备以下性能： 理想的高效凝胶色谱填料应具备以下性能 6.具有较高的孔径， 1.机械强度高，能耐受 以利于得到高分容量。 几兆帕的操作压力。 7.较高的化学稳定性， 2.球形颗粒，粒子直径 控制在3~10um，且粒 有较宽的适用PH值 径分布窄，达到高柱效。 范围. 3.具有亲水性表面，以 8.有较好的生物相容 利降低疏水性效应。 性，不会引起生物活 4.非离子性，表面没有 性物质的失活和降解。 离子交换基团。 5.孔径约为5~100nm之 9.容易处理和充填。 间，以适应不同分子量 10.价格合理。 范围物质的分离只需。
凝胶过滤色谱的渗透极限： 凝胶过滤色谱的渗透极限： 指的是可用于分离的样品的最大分子量。 一般以具有不同分子量的葡聚糖，聚乙二 醇为样品绘制工作曲线后确定。需要注意 注意 的一点是，因为在溶液中蛋白质常呈球形， 而PEG和葡聚糖则是线性分子，依据此工 作曲线会带来很大的误差。故最好以蛋白 故最好以蛋白 质标准样品来标定凝胶过滤色谱的工作曲 线。
凝胶过滤色谱的应用
• 例2.蛇毒纤溶酶Fibrolase 的凝胶过 滤色谱复性
方法: 使用透析和凝胶色谱对Fibrolase 复性进行 研究, 比较2 种复性方法的相对复性率及蛋白质 回收率。结果: 2 种复性方法的复性率分别为 20%、25%, 蛋白质回收率分别为16%、5%。 结论:凝胶过滤色谱复性优于透析法复性, 凝胶过 滤色谱复性使蛋白质的复性与纯化同步进行, 简 化了操作程序, 提高了产品回收率。