人体组织细胞蛋白质提取和保存
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500~1500 rpm 的速度，匀浆 3~6 次，每次 5~10 秒。 ——手动玻璃匀浆器常用于脑组织的匀浆，匀浆 10~20 次。 ——刀片式和肉切式组织匀浆器以 1000~3000 rpm 的速度，匀浆 3 次，每次
20~30 秒。次间暂停几秒。
cn 匀浆的效果可用相差显微镜观察组织细胞状况评估或用定量单位湿重组织 . 释放的蛋白质含量监控。 rg 匀浆过程应注意维持低温。玻璃匀浆器可外置冰水浴，其他匀浆容器可预冷 o 或在冷室内进行匀浆。 e. 4.2.2 超声法 en 其机理是高频超声波作用于溶液时，气泡产生、长大和破碎的空化的现象有 g 关。在处理少量样品时操作简便，液量损失小，适于实验室应用。但是超声波产 .e生的化学自由基能使敏感的活性物质变性。 ww n 将处理的组织混悬在至少两倍体积的缓冲液内，将超声探头没入混悬液内进 w .c 行超声破碎。 g 超声波的频率和作用时间与需要处理的靶物质的体积有关。一般输出功率 or 100~200W，破碎时间 1~10 分钟，一般约 2 分钟。如果在细胞悬浮液中加石英砂 . 则可缩短时间。操作时应注意控制超声波的频率和时间，勿产生泡沫和高温，即 ne 刚好低于溶液产生泡沫的水平，否则将导致蛋白质变性。但强度过低也将降低破 ge 碎率。最好将强度控制在刚好低于溶液产生泡沫的水平。为了防止电器长时间运 e 转产生过多的热量，常采用间歇处理（将超声分为几个周期，周期间样品在冰浴 w. 中冷却）和降低温度（超声时将盛有样品的容器置于冰上）的方法进行。 ww4.2.3 液氮研磨
n 研究与开发，依据《人类遗传资源库建设规范》以及目前的工作经验和研究积累， .c 特制定《人体组织细胞蛋白质提取和保存规程》。 rg 本规程适用人体组织细胞蛋白质提取和保存的操作程序和技术要求。在科研 wwww.wewg.eengee.noe.org.cn 单位、医学院校应规范执行。
II
目次
1 范围 ............................................................1 2 引用文献 ........................................................1 3 术语和定义 ......................................................1 4 组织蛋白的提取...................................................2 4.1 脏器组织的选择及预处理.........................................2
匀浆是组织破碎常用的方法之一。其原理是通过机械剪切力破碎组织和细 胞，释放蛋白质至溶液。由于匀浆过程中蛋白质被蛋白酶降解的可能性较小，而 且不从其他的细胞区室释放蛋白酶。所以匀浆是简便、快速且对蛋白几乎没有危 险的组织破碎方法，是实验室首先考虑的方法之一。通常每体积湿重组织通常加
2
3-5 倍体积预冷的匀浆缓冲液至合适的匀浆容器内进行匀浆。常用的匀浆器有： ——电动玻璃匀浆器常用于匀浆肝、心、肌肉等软组织的匀浆，通常以
n 4.2 组织的破碎.....................................................2 .c 4.3 组织总蛋白的提取...............................................4 rg 5 体外培养的细胞蛋白的提取 ........................................5 o 5.1 体外培养的细胞的选择及预处理...................................5 . 5.2 细胞的破碎.....................................................5 ne 5.3 体外培养细胞总蛋白的提取.......................................7 e 5.4 体外培养细胞的细胞膜蛋白的提取................................10 eg 5.5 体外培养细胞的细胞核蛋白的提取................................10 .5.6 体外培养细胞的细胞质蛋白的提取................................13 www cn 6 提取方法以及影响提取的因素 .....................................13 . 6.1 常用的提取方法................................................14 rg 6.2 抽提有效成分的影响因子........................................14 o 7 保存 ...........................................................18 e. 7.1 干态贮藏......................................................19 n 7.2 液态贮藏......................................................20 ge 7.3 硫酸铵沉淀法..................................................20 e 7.4 液氮冻存法....................................................20 www. 参 考 文 献 .......................................................21
对于韧性很强的组织如皮肤、肌腱等以及比较坚硬的组织如骨骼和软骨，可 用液氮冻硬变脆，敲碎成小块后置预冷的研钵中，加液氮用研磨棒研碎。
通常每个 1.5 mL 冻存管内放入 50mg 组织，迅速放入液氮中冻存。用去离
3
子水充分刷洗研钵和杵，锡纸包裹后 180℃，8 小时干热烘烤灭菌。分别经-4℃， -20℃，-80℃预冷。在冷室内将组织从液氮中取出，立即放入事先用液氮预冷的 研钵中，敲碎成小块后迅速用力研磨至粉末。研磨过程中始终保持研钵内有适量 液氮。研磨的程度以肉眼见组织成微细均匀的粉末即可。用液氮预冷的 1.5 mL EP 管刮取研钵内组织粉末，加缓冲液溶解。注意处理不同的样本时，用不同的研钵， 以避免可能的交叉污染。
cn 4.2.4 其他方法 . 用低渗溶液，如水、稀盐水及含少量有机溶剂的水溶液等处理，由于存在渗 rg 透压差，溶剂分子大量进入细胞，引起细胞膜发生胀破。该方法常用于血液中红 o 细胞的裂解。 e. 除上述方法外，通过改变细胞膜透性，破坏蛋白质与脂类的结合，也可达到 en 破坏细胞有利于蛋白质、酶等物质的分离提取。这方面应用较多的有真空干燥和 g 用丙酮处理制成丙酮粉的方法。在酶的制备中，用丙酮干燥，不仅是使细胞膜破 .e碎的有效方法，而且可作成具有酶活力的干粉，长时间保存，作为一个很方便的 ww n 原料样品在需要分析测定时以水或缓冲液把酶提取出来。 w .c 4.3 组织总蛋白的提取 g （其他可选用的方法请参见附录 B） or 4.3.1 试剂 . 匀浆缓冲液 A ne 匀浆缓冲液 B ge 注意：本规程中所有试剂的配置请参见附录 A。 e 4.3.2 组织 w. 合适的组织的选择参见 4.1。 ww4.3.3 仪器
中国人类遗传资源
人体组织细胞蛋白质
提取和保存技术规程
cn Technical Specification for Extraction and g. Conservation of Tissue and Cell Protein
or of Chinese Genetic Resources wwww.wewg.eengee.ne.org.cn （讨论稿）
4 组织蛋白的提取
n 4.1 脏器组织的选择及预处理 .c 特定靶蛋白分布在不同的组织内。然而组织的最终选择要考虑该组织内靶蛋 g 白的含量、是否容易获得、组织的成本以及各种技术问题例如蛋白水解的活性最 or 低。某些动物组织（例如肝、脾、肾）含有丰富的溶酶体蛋白酶，尤其是组织蛋 . 白酶，应该避免选择，除非研究目的本身就是这些蛋白水解酶。 ne 新鲜获取的脏器组织用缓冲盐溶液洗去残留血液和污染物，迅速剥去脂肪和 ge 筋皮等结缔组织，冲洗干净。用组织剪或手术刀将组织分离成 1cm3左右的小块。 e最好选择新鲜的组织，但有些情况下，如果是以小块组织快速冰冻并且保存 w.时间不长的话，也可选用冰冻组织。建议冰冻组织保存在-50℃以下，因为由于 ww cn 冰晶形成导致的溶媒体蛋白酶的释放可能引起蛋白的降解。 g. 对于易分解的蛋白质，应选用新鲜材料制备。 r 4.2 组织的破碎 .o 通常人们所需的物质有些分泌于细胞外，用适当的溶剂可直接提取；多数存 e 在于细胞内，或游离在细胞质中，或与细胞器紧密结合。而欲提取存在于细胞内 en 的物质时，必须将细胞破碎。脏器的细胞膜较脆弱极易破损，往往在组织绞碎或 eg 提取时就破坏了。主要目标是用最小的破碎力量可得到最大程度的细胞破碎率， . 并能保证蛋白质的完整性。常用的方法如下： www 4.2.1 匀浆法
III
人体组织细胞蛋白质提取和保存技术规程
1 范围
本规程规定了人体组织细胞蛋白质提取和保存的工作程序和技术要求。 本规程适用于人体组织细胞蛋白质(如总蛋白、细胞膜蛋白、细胞核蛋白和 细胞质蛋白等)的提取和保存。
.cn 2 引用文献 rg 下列文件中的条款通过本规程的引用而成为本规程的条款。凡是注日期的引 o 用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本规程， e. 然而，鼓励根据本规程达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡 n 是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本规程。 ge 《人类遗传资源管理办法》 .eGB 19489-2004 《实验室生物安全通用要求》 ww n CNAL/AC30-2005 《实验室生物安全认可准则》 w .c ISO 15189 《医学实验室质量和能力的专用要求》 g ISO 9001:2000 《质量管理系统要求》 or GB/T 1.1-2000 《标准的结构和编写规则》 e. 3 术语和定义 en 下列术语和定义适用于本规程。 eg 3.1 人体组织细胞 human tissue and cell . 指人体的各种脏器组织以及体外培养的贴壁和悬浮细胞。 www 3.2 有效成分 effective component
低温冷冻离心机 纱布或玻璃纤维 组织剪或手术刀
4
匀浆器 4.3.4Leabharlann Baidu步骤
1．新鲜获取的脏器组织用匀浆缓冲液A洗去残留血液和污染物，迅速剥去脂 肪和筋皮等结缔组织，冲洗干净。用组织剪或手术刀将组织分离成 1cm3左右的 小块。
2．每体积湿重组织通常加 3~5 倍体积预冷的匀浆缓冲液 B 至匀浆容器内。
指欲纯化的某种单一的物质。而有效成分以外的其他物质则统称杂质。 3.3 破碎 rupture
指用物理、化学、等方法来破坏细胞膜从而将胞内物质释放至周围环境的过 程。在水缓冲液或悬浮液中生成含有细胞、亚细胞组分和其他细胞碎片的羹汤般
1
粘稠物质。 3.4 提取 extraction
指用适当的溶剂和方法，将经过处理或破碎的细胞中被提取的蛋白质充分释 放出来的过程。
中国人类遗传资源平台项目组 2007 年 4 月
前言
目前我国尚无关于人体组织细胞蛋白质提取和保存技术规程的国家标准。由 于蛋白质提取的操作影响蛋白质的产量、生物学活性以及特定靶蛋白结构的完整 性，为了确保人体组织细胞蛋白质能有序、准确而有效地提取和保存，能直接用 于功能性研究或者用作提纯蛋白质的基本原料，促进我国人类遗传资源的保护、
20~30 秒。次间暂停几秒。
cn 匀浆的效果可用相差显微镜观察组织细胞状况评估或用定量单位湿重组织 . 释放的蛋白质含量监控。 rg 匀浆过程应注意维持低温。玻璃匀浆器可外置冰水浴，其他匀浆容器可预冷 o 或在冷室内进行匀浆。 e. 4.2.2 超声法 en 其机理是高频超声波作用于溶液时，气泡产生、长大和破碎的空化的现象有 g 关。在处理少量样品时操作简便，液量损失小，适于实验室应用。但是超声波产 .e生的化学自由基能使敏感的活性物质变性。 ww n 将处理的组织混悬在至少两倍体积的缓冲液内，将超声探头没入混悬液内进 w .c 行超声破碎。 g 超声波的频率和作用时间与需要处理的靶物质的体积有关。一般输出功率 or 100~200W，破碎时间 1~10 分钟，一般约 2 分钟。如果在细胞悬浮液中加石英砂 . 则可缩短时间。操作时应注意控制超声波的频率和时间，勿产生泡沫和高温，即 ne 刚好低于溶液产生泡沫的水平，否则将导致蛋白质变性。但强度过低也将降低破 ge 碎率。最好将强度控制在刚好低于溶液产生泡沫的水平。为了防止电器长时间运 e 转产生过多的热量，常采用间歇处理（将超声分为几个周期，周期间样品在冰浴 w. 中冷却）和降低温度（超声时将盛有样品的容器置于冰上）的方法进行。 ww4.2.3 液氮研磨
n 研究与开发，依据《人类遗传资源库建设规范》以及目前的工作经验和研究积累， .c 特制定《人体组织细胞蛋白质提取和保存规程》。 rg 本规程适用人体组织细胞蛋白质提取和保存的操作程序和技术要求。在科研 wwww.wewg.eengee.noe.org.cn 单位、医学院校应规范执行。
II
目次
1 范围 ............................................................1 2 引用文献 ........................................................1 3 术语和定义 ......................................................1 4 组织蛋白的提取...................................................2 4.1 脏器组织的选择及预处理.........................................2
匀浆是组织破碎常用的方法之一。其原理是通过机械剪切力破碎组织和细 胞，释放蛋白质至溶液。由于匀浆过程中蛋白质被蛋白酶降解的可能性较小，而 且不从其他的细胞区室释放蛋白酶。所以匀浆是简便、快速且对蛋白几乎没有危 险的组织破碎方法，是实验室首先考虑的方法之一。通常每体积湿重组织通常加
2
3-5 倍体积预冷的匀浆缓冲液至合适的匀浆容器内进行匀浆。常用的匀浆器有： ——电动玻璃匀浆器常用于匀浆肝、心、肌肉等软组织的匀浆，通常以
n 4.2 组织的破碎.....................................................2 .c 4.3 组织总蛋白的提取...............................................4 rg 5 体外培养的细胞蛋白的提取 ........................................5 o 5.1 体外培养的细胞的选择及预处理...................................5 . 5.2 细胞的破碎.....................................................5 ne 5.3 体外培养细胞总蛋白的提取.......................................7 e 5.4 体外培养细胞的细胞膜蛋白的提取................................10 eg 5.5 体外培养细胞的细胞核蛋白的提取................................10 .5.6 体外培养细胞的细胞质蛋白的提取................................13 www cn 6 提取方法以及影响提取的因素 .....................................13 . 6.1 常用的提取方法................................................14 rg 6.2 抽提有效成分的影响因子........................................14 o 7 保存 ...........................................................18 e. 7.1 干态贮藏......................................................19 n 7.2 液态贮藏......................................................20 ge 7.3 硫酸铵沉淀法..................................................20 e 7.4 液氮冻存法....................................................20 www. 参 考 文 献 .......................................................21
对于韧性很强的组织如皮肤、肌腱等以及比较坚硬的组织如骨骼和软骨，可 用液氮冻硬变脆，敲碎成小块后置预冷的研钵中，加液氮用研磨棒研碎。
通常每个 1.5 mL 冻存管内放入 50mg 组织，迅速放入液氮中冻存。用去离
3
子水充分刷洗研钵和杵，锡纸包裹后 180℃，8 小时干热烘烤灭菌。分别经-4℃， -20℃，-80℃预冷。在冷室内将组织从液氮中取出，立即放入事先用液氮预冷的 研钵中，敲碎成小块后迅速用力研磨至粉末。研磨过程中始终保持研钵内有适量 液氮。研磨的程度以肉眼见组织成微细均匀的粉末即可。用液氮预冷的 1.5 mL EP 管刮取研钵内组织粉末，加缓冲液溶解。注意处理不同的样本时，用不同的研钵， 以避免可能的交叉污染。
cn 4.2.4 其他方法 . 用低渗溶液，如水、稀盐水及含少量有机溶剂的水溶液等处理，由于存在渗 rg 透压差，溶剂分子大量进入细胞，引起细胞膜发生胀破。该方法常用于血液中红 o 细胞的裂解。 e. 除上述方法外，通过改变细胞膜透性，破坏蛋白质与脂类的结合，也可达到 en 破坏细胞有利于蛋白质、酶等物质的分离提取。这方面应用较多的有真空干燥和 g 用丙酮处理制成丙酮粉的方法。在酶的制备中，用丙酮干燥，不仅是使细胞膜破 .e碎的有效方法，而且可作成具有酶活力的干粉，长时间保存，作为一个很方便的 ww n 原料样品在需要分析测定时以水或缓冲液把酶提取出来。 w .c 4.3 组织总蛋白的提取 g （其他可选用的方法请参见附录 B） or 4.3.1 试剂 . 匀浆缓冲液 A ne 匀浆缓冲液 B ge 注意：本规程中所有试剂的配置请参见附录 A。 e 4.3.2 组织 w. 合适的组织的选择参见 4.1。 ww4.3.3 仪器
中国人类遗传资源
人体组织细胞蛋白质
提取和保存技术规程
cn Technical Specification for Extraction and g. Conservation of Tissue and Cell Protein
or of Chinese Genetic Resources wwww.wewg.eengee.ne.org.cn （讨论稿）
4 组织蛋白的提取
n 4.1 脏器组织的选择及预处理 .c 特定靶蛋白分布在不同的组织内。然而组织的最终选择要考虑该组织内靶蛋 g 白的含量、是否容易获得、组织的成本以及各种技术问题例如蛋白水解的活性最 or 低。某些动物组织（例如肝、脾、肾）含有丰富的溶酶体蛋白酶，尤其是组织蛋 . 白酶，应该避免选择，除非研究目的本身就是这些蛋白水解酶。 ne 新鲜获取的脏器组织用缓冲盐溶液洗去残留血液和污染物，迅速剥去脂肪和 ge 筋皮等结缔组织，冲洗干净。用组织剪或手术刀将组织分离成 1cm3左右的小块。 e最好选择新鲜的组织，但有些情况下，如果是以小块组织快速冰冻并且保存 w.时间不长的话，也可选用冰冻组织。建议冰冻组织保存在-50℃以下，因为由于 ww cn 冰晶形成导致的溶媒体蛋白酶的释放可能引起蛋白的降解。 g. 对于易分解的蛋白质，应选用新鲜材料制备。 r 4.2 组织的破碎 .o 通常人们所需的物质有些分泌于细胞外，用适当的溶剂可直接提取；多数存 e 在于细胞内，或游离在细胞质中，或与细胞器紧密结合。而欲提取存在于细胞内 en 的物质时，必须将细胞破碎。脏器的细胞膜较脆弱极易破损，往往在组织绞碎或 eg 提取时就破坏了。主要目标是用最小的破碎力量可得到最大程度的细胞破碎率， . 并能保证蛋白质的完整性。常用的方法如下： www 4.2.1 匀浆法
III
人体组织细胞蛋白质提取和保存技术规程
1 范围
本规程规定了人体组织细胞蛋白质提取和保存的工作程序和技术要求。 本规程适用于人体组织细胞蛋白质(如总蛋白、细胞膜蛋白、细胞核蛋白和 细胞质蛋白等)的提取和保存。
.cn 2 引用文献 rg 下列文件中的条款通过本规程的引用而成为本规程的条款。凡是注日期的引 o 用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本规程， e. 然而，鼓励根据本规程达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡 n 是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本规程。 ge 《人类遗传资源管理办法》 .eGB 19489-2004 《实验室生物安全通用要求》 ww n CNAL/AC30-2005 《实验室生物安全认可准则》 w .c ISO 15189 《医学实验室质量和能力的专用要求》 g ISO 9001:2000 《质量管理系统要求》 or GB/T 1.1-2000 《标准的结构和编写规则》 e. 3 术语和定义 en 下列术语和定义适用于本规程。 eg 3.1 人体组织细胞 human tissue and cell . 指人体的各种脏器组织以及体外培养的贴壁和悬浮细胞。 www 3.2 有效成分 effective component
低温冷冻离心机 纱布或玻璃纤维 组织剪或手术刀
4
匀浆器 4.3.4Leabharlann Baidu步骤
1．新鲜获取的脏器组织用匀浆缓冲液A洗去残留血液和污染物，迅速剥去脂 肪和筋皮等结缔组织，冲洗干净。用组织剪或手术刀将组织分离成 1cm3左右的 小块。
2．每体积湿重组织通常加 3~5 倍体积预冷的匀浆缓冲液 B 至匀浆容器内。
指欲纯化的某种单一的物质。而有效成分以外的其他物质则统称杂质。 3.3 破碎 rupture
指用物理、化学、等方法来破坏细胞膜从而将胞内物质释放至周围环境的过 程。在水缓冲液或悬浮液中生成含有细胞、亚细胞组分和其他细胞碎片的羹汤般
1
粘稠物质。 3.4 提取 extraction
指用适当的溶剂和方法，将经过处理或破碎的细胞中被提取的蛋白质充分释 放出来的过程。
中国人类遗传资源平台项目组 2007 年 4 月
前言
目前我国尚无关于人体组织细胞蛋白质提取和保存技术规程的国家标准。由 于蛋白质提取的操作影响蛋白质的产量、生物学活性以及特定靶蛋白结构的完整 性，为了确保人体组织细胞蛋白质能有序、准确而有效地提取和保存，能直接用 于功能性研究或者用作提纯蛋白质的基本原料，促进我国人类遗传资源的保护、