紫外分光光度法详解

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紫外-可见分光光度法的基本原理(一)

紫外-可见分光光度法是一种常用的分析化学方法，它利用物质对紫外光和可见光的吸收来确定物质的浓度。

本文将介绍紫外-可见分光光度法的基本原理，包括仪器的构成、光谱的特点以及测定原理等方面。

1. 仪器的构成紫外-可见分光光度法的仪器主要由光源、进样系统、分光器、检测器和数据处理系统五个部分组成。

其中光源通常采用汞灯、钨灯或氘灯，进样系统包括进样池和进样装置，分光器可分为单道光栅和双道光栅，检测器可采用光电倍增管或光电二极管，数据处理系统包括计算机和相关的数据处理软件。

2. 光谱的特点紫外-可见分光光度法所使用的光源通常在紫外至可见光范围内，因此能够观测到物质在这一范围内的吸收光谱。

吸收光谱通常表现为在特定波长范围内的吸收峰或吸收带，其位置和强度可反映物质的化学性质和浓度。

通过测定样品和对照液的吸光度差值，可以确定样品中所含物质的浓度。

3. 测定原理在紫外-可见分光光度法中，测定原理主要包括比较法和标准曲线法两种。

比较法是通过测定待测溶液与对照液的吸光度差值来确定物质的浓度，而标准曲线法则是通过构建标准曲线，利用标准溶液的吸光度与浓度的关系来确定待测溶液的浓度。

两种方法均需要在特定波长下进行测定，并且要对光谱仪进行基准校准和零点校准。

4. 应用范围紫外-可见分光光度法在分析化学领域有着广泛的应用，可以用于测定各种有机和无机物质的浓度，如药物、生物分子、环境污染物等。

其灵敏度高、操作简便、准确性好，因此被广泛应用于医药、环保、化工等领域。

5. 结语紫外-可见分光光度法作为一种常用的分析化学方法，具有许多优点，但也存在一些局限性，如对样品的要求较高、需要标准曲线等。

因此在实际应用中需要根据具体情况选择合适的方法，并结合其他分析方法进行综合分析，以获得更准确的结果。

通过以上介绍，相信读者对紫外-可见分光光度法的基本原理有了一定的了解，希望能对相关领域的研究和应用提供一定的参考和帮助。

6. 光源的选择与影响在紫外-可见分光光度法中，光源的选择对测定结果有着重要的影响。

紫外可见分光光度法解析课件

即 T= It/I0
吸光度: 为透光度倒数的对数，用A表示，即 A=lg1/T=lgI0/It
二、朗伯-比尔定律当一束平行单色光通过含有吸光物质的
稀溶液时，溶液的吸光度与吸光物质浓度、液层厚度乘积成正比，即
A= E cl 式中比例常数E为吸光系数，与吸光物质的本性，入射光波长及温度等因素有关。c为吸光物质浓度，l为透光液层厚度。
2. 使用仪器自检结束后（7个自检项目均出现
OK字样），按[MAIN MENU]键（主菜单），屏幕显示如下5个功能项： 1. Phtometry（定量运算）；2. Wavelength Scan（波长扫描模式）；3. Time Scan （时间曲线扫描）；4. System（系统校正）；5. Data display（光度直接测量模式）。根据需要测量的实验项目按相
朗伯-比尔定律是紫外-可见分光光度法的理论基础。
A lg 1 lg I0 ECL TI
式中，A为吸光度，T为透光率，I0、I分别为入射光
和透过光的强度；E为吸光系数，当c用物质的量浓度表示，L用厘米表示，用ε代替E，称为摩尔吸光系数，单位为（L·mol-1·cm-1）；当c用百分浓度（g/100mL），L用厘米表示时，用E1cm1%表示E，称为比吸光系数。它们的关系如下：
4.4 如果仪器不能初始化，关机重启。
4.5 如果吸收值异常，依次检查：波长设置是否正确（重新调整波长，并重新调零）、测量时是否调零（如被误操作，重新调零）、比色皿是否用错（测定紫外波段时，要用石英比色皿）、样品准备是否有误（如有误，重新准备样品）。
2 标准对比法
即将待测溶液与某一标样溶液，在相同的条件下，测定各自的吸光度，建立朗伯比尔定律，解方程求出未知样浓度与含量。

紫外分光光度法

紫外-可见分光光度法百科名片紫外--可见分光光度法：是根据物质分子对波长为200-760nm这一范围的电磁波的吸收特性所建立起来的一种定性、定量和结构分析方法。

操作简单、准确度高、重现性好。

波长长(频率小)的光线能量小，波长短(频率大)的光线能量大。

分光光度测量是关于物质分子对不同波长和特定波长处的辐射吸收程度的测量。

描述物质分子对辐射吸收的程度随波长而变的函数关系曲线，称为吸收光谱或吸收曲线。

紫外-可见吸收光谱通常由一个或几个宽吸收谱带组成。

最大吸收波长（λmax）表示物质对辐射的特征吸收或选择吸收，它与分子中外层电子或价电子的结构（或成键、非键和反键电子）有关。

朗伯-比尔定律是分光光度法和比色法的基础。

这个定律表示：当一束具有I0强度的单色辐射照射到吸收层厚度为b，浓度为c的吸光物质时，辐射能的吸收依赖于该物质的浓度与吸收层的厚度。

其数学表达式为：式中的A叫做吸光度；I0为入射辐射强度；I为透过吸收层的辐射强度；（I／I0）称紫藤为透射率T；ε是一个常数，叫做摩尔吸光系数，ε值愈大，分光光度法测定的灵敏度愈高。

紫外-可见分光光度计由5个部件组成：①辐射源。

必须具有稳定的、有足够输出功率的、能提供仪器使用波段的连续光谱，如钨灯、卤钨灯（波长范围350～2500纳米），氘灯或氢灯（180～460纳米），或可调谐染料激光光源等。

②单色器[1]。

它由入射、出射狭缝、透镜系统和色散元件（棱镜或光栅）组成，是用以产生高纯度单色光束的装置，其功能包括将光源产生的复合光分解为单色光和分出所需的单色光束。

③试样容器，又称吸收池。

供盛放试液进行吸光度测量之用，分为石英池和玻璃池两种，前者适用于紫外到可见区，后者只适用于可见区。

容器的光程一般为0.5～10厘米。

④检测器，又称光电转换器。

常用的有光电管或光电倍增管，后者较前者更灵敏，特别适用于检测较弱的辐射。

近年来还使用光导摄像管或光电二极管矩阵作检测器，具有快速扫描的特点。

紫外分光光度法1详解

E 摩尔吸光系数
M 10
E1% 1cm
>104强吸收 <102弱吸收
C：g / 100 mL
E E11c%m百分吸光系数
比吸光系数
偏离比尔定律的因素
（一）化学因素浓度变化引起的离解、缔合、与溶剂间作用等。减免：控制溶液条件。（二）光学因素 1.非单色光的影响：E1与E2相差越大，引起的偏离越大。也与杂光的强度和检测器对之的响应灵敏度有关。减免：选用较纯的单色光。
选max的光作为入射光。
入射光选择示意图
A
结论：单组份分析时，一般选择 max的光作为入射光，测量灵敏度高，且对比尔定律的偏离小。
max
2.杂散光（stray light）减免：优化仪器设计，维护好仪器。 3.反射光和散射光：使A偏高
减免：真溶液用空白对比补偿。胶体溶液或浑浊溶液较难用空白补偿。 4.非平行光
紫外可见分光光度计的光学性能
狭缝或谱带宽：单色光纯度指标之一，低级仪器几纳米，中高级仪器0.1~0.5nm 分辨率：260nm处，中等仪器 <0.5nm，高级仪器 <0.1nm 杂散光:中等仪器 <0.5%,高级仪器<0.001%，影响仪器测定浓度上限。光度准确度：±1%~±0.1%
分光光度计的校正
•光电二极管阵列
阴极
真抽真空空光电管
光束
e
阳极丝（Ni）
直流放大
R
- 90V DC +
阴极表面可涂渍不同光敏物质：高灵敏(K,Cs,Sb其中二者)、红光敏 (Na/K/Cs/Sb, Ag/Cs,625～1000nm)、紫外光敏(200～625nm)、平坦响应 (Ga/As，响应受波长影响小)。产生的光电流约为硒光电池的1/10。

紫外可见分光光度法(鉴别、检查、含量测定)

紫外-可见分光光度法紫外分光光度：紫外光区特定波长内的吸收度，被测物质或杂质的定性和定量紫外-可见分光光度计的工作波长：190-900nm近紫外区（氘灯）200-400nm 可见光区（碘钨灯）400-850nm定量分析:①最大吸收波长处测出吸收度②对照品或百分吸收系数算出被测物或杂质的含量双光束光栅型紫外-可见分光光度计波长准确度误差±0.5nm一、样品测定：⑴吸收系数测定:①按食品药品监督管理局标准的该药品项下规定的方法配制供试液②在规定的波长测定其吸收度③计算吸收系数，应符合规定范围⑵鉴别与检查：按食品药品监督管理局标准的该药品项下规定测定供试品在有关波长处的最大或最小吸收，或最大吸收峰值或最大或最小吸收的比值，应符合规定⑶含量测定：①对照品比较法㈠按食品药品监督管理局标准的该药品项下规定的方法分别配制对照品和供试品溶液注：对照品中所测成分的量应在供试品中所测成分标示量的(100±100)%以内㈡用同一溶剂，在规定的波长处测定供试品和对照品的吸收度②吸收系数法㈠按食品药品监督管理局标准的该药品项下规定的方法配制供试品溶液㈡在规定波长（±1nm）处测定其吸收度㈢按食品药品监督管理局标准的该药品在规定的条件下给出的吸收系数计算含量具体过程对照品比较法①调节波长测吸光度（吸光度最大波长应在该品种项下规定的波长±2nm以内）②A样品的吸光度:A对照品的吸光度= C样品:C对照品(C为浓度，mg/ml)C样品=A样品的吸光度×C对照品/A对照品的吸光度C样品×A对照品的吸光度= A样品的吸光度×C对照品P﹪（所含物质占标示量的百分比）= C供试品-稀释后的对照品×A对照品的吸光度/ A 样品的吸光度×C对照品×供试品的标示含量例1奥硝唑含量（紫外分光光度计）：⑴对照品①取0.0113g奥硝唑溶于100ml的容量瓶中稀释至100ml②从容量瓶中取出5ml③再用蒸馏水稀释至50 ml在319nm处测得对照品A（吸光度）=0.465⑵供试品①取5ml供试品于100lml的容量瓶中稀释至100ml②从容量瓶中取出5ml③用蒸馏水稀释至25ml319nm处供试品A1=0.413 供试品A2=0.417⑶①P﹪（所含物质占标示量的百分比）=0.413供试品的吸光度ⅹ(0.0113g/100ml)对照品浓度ⅹ(5/50) / 0.465对照品的吸光度ⅹ(5ml/100ml) ⅹ(1/25ml)ⅹ0.5g﹪ml标示含量供试品浓度ⅹ 100﹪=100.36﹪注：0.5﹪（供试品的标示含量）表示100ml 0.5g②P﹪= P1﹪+ P2﹪ /2。

紫外分光光度法原理,使用范围,仪器的校正,测定方法和注意事项

紫外分光光度法原理，使用范围，仪器的校正，测定方法和注意事项紫外分光光度法一、原理可见光、紫外线照射某些物质，主要是由于物质分子中价电子能级跃迁对辐射的吸收，而产生化合物的可见紫外吸收光谱。

基于物质对光的选择性吸收的特性而建立分光光度法或称吸收光谱法的分析方法。

它是以朗伯──比耳定律为基础。

1朗伯—比耳定律 A = lg—- = ECLT式中 A为吸收度；T为透光率；E为吸收系数，采用的表示方法是（E１％１ｃｍ），其物理意义为当溶液浓度为1%（g/ml），液层厚度为1cm时的吸收度数值；C为100ml溶液中所含被测物质的重量（按干燥品或无水物计算），g；L为液层厚度，cm。

二、使用范围凡具有芳香环或共轭双键结构的有机化合物，根据在特定吸收波长处所测得的吸收度，可用于药品的鉴别、纯度检查及含量测定。

三、仪器可见-紫外分光光度计。

其应用波长范围为200～400nm的紫外光区、400～850nm的可见光区。

主要由辐射源（光源）、色散系统、检测系统、吸收池、数据处理机、自动记录器及显示器等部件组成。

本仪器是根据相对测量的原理工作的，即先选定某一溶剂（或空气、试样）作为标准（空白或称参比）溶液，并认为它的透光率为100％（或吸收度为0），而被测的试样透光率（或吸收度）是相对于标准溶液而言，实际上就是由出射狭缝射出的单色光，分别通过被测试样和标准溶液，这两个光能量之比值，就是在一定波长下对于被测试样的透光率（或吸收度）。

本仪器可精密测定具有芳香环或共轭双键结构的有机化合物、有色物质或在适当条件下能与某些试剂作用生成有色物的物质。

使用前应校正测定波长并按仪器说明书进行操作。

四、仪器的校正1.波长的准确度试验以仪器显示的波长数值与单色光的实际波长值之间误差表示，应在±1.0nm 范围内。

可用仪器中氘灯的486.02nm与656.10nm谱线进行校正。

2.吸收度的准确度试验3.杂散光的试验4.波长重现性试验5.分辨率试验五、测定方法1.对照品比较法（1）按各品种项下的方法，分别配制供试品溶液和对照品溶液，对照品溶液中所含被测成分的量应为供试品溶液中被测成分标示量的100±10%，所用溶剂也应完全一致，在规定的波长测定供试品溶液和对照品溶液的吸收度后，按下式计算含量，即得。

紫外分光光度法名词解释

紫外分光光度法名词解释
紫外分光光度法是一种化学分析方法，主要应用于测定有机化合物和无机化合物的含量。

它通过测量样品在紫外区域的吸收度来确定其含量。

在紫外分光光度法中，样品被加入到检测池中，检测池是一个装有样品的液体容器。

然后，仪器通过测量样品在紫外区域的吸收度来确定其含量。

吸收度是指样品在紫外区域的吸收强度。

紫外分光光度法的优点是可以快速、准确地测定样品的含量，而且不需要复杂的处理过程。

此外，它还可以应用于测定有机化合物和无机化合物的质量和纯度。

紫外分光光度法的缺点是需要使用高质量的紫外光源和高质量的检测器，否则会影响测量结果的准确性。

此外，样品的处理过程可能会影响到测量结果。

紫外-分光光度法原理知识讲解

紫外-分光光度法原理紫外分光光度计的使用原理和方法紫外-可见分光光度法(ultraviolet-visible spectrophotometry, UV-VIS)1定义：它是利用物质的分子或离子对某一波长范围的光的吸收作用，对物质进行定性分析、定量分析及结构分析, 所依据的光谱是分子或离子吸收入射光中特定波长的光而产生的吸收光谱。

2分类：按所吸收光的波长区域不同：分为紫外分光光度法和可见分光光度法，合称为紫外-可见分光光度法。

3、紫外-可见分光光度法的特点：（1) 其仪器设备和操作都比较简单，费用少，分析速度快;（与其它光谱分析方法相比）（2）灵敏度高;（3）选择性好;（4）精密度和准确度较高;（5）用途广泛。

§1. 紫外-可见吸收光谱1. 物质对光的选择性吸收物质对光的吸收是选择性的，利用被测物质对某波长的光的吸收来了解物质的特性，这就是光谱法的基础。

通过测定被测物质对不同波长的光的吸收强度（吸光度），以波长为横坐标，吸光度为纵坐标作图，得出该物质在测定波长范围的吸收曲线。

在吸收曲线中，通常选用最大吸收波长λmax进行物质含量的测定。

2.有机化合物的紫外-可见吸收光谱2.1 有机化合物的电子跃迁与紫外-可见吸收光谱有关的电子有三种，即形成单键的σ电子、形成双键的π电子以及未参与成键的n电子。

跃迁类型有：σ→σ*、n→σ* 、π→π *、 n→π * 四种。

饱合有机化合物的电子跃迁类型为σ→σ*，n→σ*跃迁，吸收峰一般出现在真空紫外区，吸收峰低于200nm，实际应用价值不大。

不饱合机化合物的电子跃迁类型为n→π*，π→π*跃迁，吸收峰一般大于200nm。

生色团：是指分子中可以吸收光子而产生电子跃迁的原子基团。

人们通常将能吸收紫外、可见光的原子团或结构系统定义为生色团。

助色团：是指带有非键电子对的基团，如-OH、-OR、-NHR、-SH、-Cl、-Br、-I等，它们本身不能吸收大于200nm的光，但是当它们与生色团相连时，会使生色团的吸收峰向长波方向移动，并且增加其吸收强度。

02 紫外可见分光光度法

紫外可见分光光度法
分光光度法基本原理：测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内对光的吸收度，对物质进行定性、定量分析。
分类：
紫外分光光度法
吸收光波长范围200～400nm，可用于物质的定性和定量分析
可见分光光度法
吸收光波长范围400～780nm，用于有色物质的定性和定量分析
红外分光光度法
吸收强度
max
/ nm
绿光被吸收
– KMnO4溶液的max=525nm
特点:
① 为带状光谱，具有最大吸收波长。 ②不同浓度的同一种物质，其吸收曲线形状相似，max不变。但是不同物质，其吸收曲线形状和 max不一样，所以可作为定性分析的依据。
③ 不同浓度的同一种物质，在max处吸光度随浓度变化的幅度最大，测定的灵敏度最高，所以通常选取在max处测量。
特点：
• 不随浓度和液层厚度的改变而改变，作为定性鉴别的参数； • 在max处的摩尔吸光系数，常用 max表示，。不同物质的 λmax 有时可能相同，但 max 不一定相同，作为定性的依据；

• max越大表明该物质的吸光能力越强，用光度法测定
该物质的灵敏度越高
例：Cd2+浓度为140 umol ·L-1 ，双硫腙法显色测定波长为520nm，液层厚度2cm，吸光度为0.22，求和透光率T。解： (1) A = b c
4．检测器
检测器的作用是接受从比色皿发出的透射光并转换成电信号进行测量。分为光电管和光电倍增管。
光电管：光电管依其对光敏感的波长范围不同分为红敏和紫敏
两种。红敏光电管是在阴极表面涂银和氧化铯，适用波长范围
为625—1000nm；紫敏光电管是阴极表面涂锑和铯，适用波长范围为200—625nm。

紫外分光光度法检验含量药典标准

紫外分光光度法检验含量药典标准在制药领域中，药品的质量是至关重要的。

为了确保药品的安全性、有效性和合规性，各国都颁布了严格的药典标准。

其中，紫外分光光度法就是一种常用的药典标准检验方法之一。

紫外分光光度法是一种用于测定有机物质和某些无机物质的含量和浓度的分析方法。

它利用物质在紫外光下特定波长的吸收特性，通过测定物质对紫外光的吸收程度来间接确定其含量。

这种方法准确、快速，且操作简单，因此被广泛应用于药品、食品、环境监测等领域。

在药物质量控制中，紫外分光光度法常常被用来检验药品中某种成分的含量。

对于一些具有紫外吸收特性的化合物，如植物提取物、维生素和某些药物原料药，紫外分光光度法可以准确测定其含量，并根据药典标准来评估其质量。

当使用紫外分光光度法来检验含量药典标准时，需要严格按照药典规定的方法和条件进行操作。

需要准备好标准曲线和样品溶液，确保在检验中能够得到准确的测定结果。

需要选择合适的波长进行检测，通常是在目标化合物的最大吸收波长处进行测定。

根据药典规定的计算公式，计算出样品中目标成分的含量，并与标准要求进行对比。

在实际操作中，需要特别注意的是样品的预处理和处理过程。

在测定植物提取物中某种成分的含量时，可能需要进行提取和过滤等前处理步骤，以确保样品中的目标成分得以完全释放和准确测定。

紫外分光光度法检验含量药典标准时，还需要考虑到干扰物质的影响。

一些样品可能同时含有多种吸收紫外光的成分，这就需要通过适当的方法来处理干扰物质，以确保测定结果的准确性和可靠性。

在药物质量控制领域，紫外分光光度法作为一种常用的分析方法，对于检验含量药典标准起着至关重要的作用。

严格按照规定的方法和条件进行操作，并特别注意样品的预处理和干扰物质的影响，可以确保测定结果的准确性和可靠性，从而保证药品的质量和安全性。

对于我个人而言，深入了解紫外分光光度法对药物质量控制的意义和应用，不仅可以加深对药品质量的认识，还有助于我在相关领域的学习和研究。

中国药典版紫外分光光度法讲义优秀

中国药典版紫外分光光度法讲义优秀
• 肩峰或吸收谷处的吸光度测定受波长变动影响也较小，有时也可用谷值、肩峰值与峰值同时作鉴别依据。（比如甲硝唑片的第三个鉴别就是分别在277 nm和241 nm的波长处分别测最大吸收和最小吸收。）
• 具有不同吸光基团的化合物可有相同的最大吸收波长，但它们的摩尔吸光系数常有明显的差别，所以摩尔吸光系数常用于分子结构分析中吸光基团的鉴别。对于分子中含有相同吸光基团的物质，他们的摩尔吸光系数常很接近，但可因相对分子质量不同，使百分吸光系数的值差别较大，可以用百分吸光系数作为鉴别的依据。（比如结构相似的甲基睾丸酮和丙酸睾丸素在无水乙醇中的最大吸收波长λmax都在 240nm，但在该波长处的E1%1cm数值，前者为540，而后者为460，因而有较大的鉴别意义）。
• 紫外光谱是物质在200～400 nm的近紫外光区和400～850 nm的可见光区的吸收光谱。通常使用的紫外－可见分光光度计的工作波长范围为190～900nm,本法在药品检验中主要用于药品的鉴别、检查和含量测定。适用于微量和痕量组分的分析，测定灵敏度可达到10-4～10-7g/ml或更低范围。
处的吸收度与浓度之间是线性关系。因此只要选择适宜的波长测定溶液的吸光度，就可以求出其浓度。通常应选择被测物质吸收光谱的吸收峰处，以提高灵敏度并减少测量误差，被测物质如有几个吸收峰，可选不易有其他物质干扰的较高吸收峰，一般不选光谱中末端吸收峰。
中国药典版紫外分光光度法讲义优秀
• 单组分物质的含量测定 • 就是物质有单一成份构成，常用的测定法
中国药典版紫外分光光度法讲义优秀
第二节原理
• 紫外分光光度法之所以能成为一种分析方法，主要依据两点：
• 一、就是我们常说的吸收度，2005年版药典已将它改为吸光度，这样说可能更准确些。就是物质对光的吸收程度。我们首先说一下电磁波，所有电磁波在性质上都完全相同的，他们之间的区别仅在于波长或频率的不同。

实例解析——紫外可见分光光度法(UV-VIS)

紫外可见分光光度法实例解析一、原理分析UV-VIS依据电子跃迁光谱，通常分子轨道基态外层电子处在，当分子外层吸收紫外或者可见辐射后，从基态向激发态跃迁。

其中紫外光谱：200~400nm，可见400~780nm。

其定性依据是不同物质对不同波长吸光度不同，定量依据是朗伯比尔定律A= εbc 吸光度分子二、适用范围一般适用于有机物，尤其是含有发色光能团、大共轭体系如含有苯环的有机物的测定三、特点：灵敏度高、选择性好、准确度好、通用性强、操作简单、价格低廉缺点：远不如红外光谱好，很多化合物在紫外没有吸收或者吸收很弱，而且紫外光谱特征性不强。

可以用来检验一些具有大的共轭体系或者发色官能团，并作为其他方法的补充。

四、仪器组成：光源——单色器——狭缝——样品池——检测器五、准备工作实验开始前查相关文献确定显色剂，显色剂：将待测组分形成有色化合物反应类型：络合反应氧化还原反应取代反应缩合反应显色剂选择条件：(1)灵敏度(2)选择性(3)生色物质稳定(4)组成恒定(5)显色剂在测定波长处无明显吸收，有色化合物与显色剂颜色对比大六、实验仪器前期设定：由待测物质查阅相关文献，确定使用可见区还是紫外区，确定光源钨丝或者氢、氘。

由待测物质确定样品池采用紫外区的石英池或者可见区的玻璃池检测器选用光电倍增管达到最佳检测效果七、配置标准检测液、显色剂溶液、参比溶液、标准溶液标准溶液：由分析纯的待测物质配置而成的溶液参比溶液：若仅待测组分和显色剂反应产物有吸收，其他试剂无吸收，用水做参比若显色剂和其他试剂略有吸收，试液本身无吸收，用“试剂空白”（不加试样溶液）参比若待测试液有吸收，而显色剂无吸收，则用“试样空白”（不加显色剂）做参比一般都选用试剂空白，即八、样品前处理，制成相应的溶液，如果其中有干扰离子，则加入掩蔽剂进行掩蔽或者采用化学方法分离出干扰离子九、实验条件确定：(1)最大吸收波长确定取1ml的标准溶液，1ml显色剂配制成溶液，稀释、定容、差文献确定谱线大致范围，多次测定，选择有最大吸收时的波长定为最大吸收波长，并且和标线对比，确定其误差是否在允许范围内，适当控制吸光度在最适范围(2)显色剂用量确定分别取1ml标准液，不同体积显色剂配成溶液，稀释、定容、多次测定得到吸光度-显色剂用量曲线，选择使得曲线平缓的最低用量再增加0.5ml为最佳显色剂用量（设为a ml）(3)显色温度确定取分别取1ml标准液、和a ml的显色显色液，稀释定容，测量在相同时间，不同温度下的吸光度显色时间曲线，得到最适温度T0(4)显色时间的确定分别取1ml标准液、和a ml的显色显色液，稀释定容，恒温T0测量，分在测量得到吸光度-显色时间曲线。