酸奶中嗜热链球菌的分离及鉴定

酸奶中嗜热链球菌的分离及鉴定
生物工程2011
酸奶中嗜热链球菌的分离及鉴定
采样环境：超市伊利（辉山）酸奶
时间：地点：温度：
实验目的：1、从酸奶中分离培养嗜热链球菌
2、对嗜热链球菌进行鉴定
实验原理及意义
（1）意义：发酵乳中有多种发酵的菌种，其中嗜热链球菌做为制作酸奶的必须原料不仅可以进入小肠的上半部分帮助消化吸收，还可以产生能乳糖酶，帮助乳糖不耐受的人们消化乳糖。

同时抑制胆固醇合成酶的活性，降低血清中胆固醇含量，嗜热链球菌发酵产物可以调节控制血压，有临床实验表明含有嗜热链球菌的酸奶可以使血液中的低密度胆固醇降低，而使血纤维蛋白的浓度升高。

（2）原理：酸奶中的菌种众多，如：保加利亚乳杆菌，嗜酸乳杆菌，乳双歧杆菌，嗜热链球菌等，其中，菌落呈现黄色（或红色），显微镜观察为链球状可以确定为嗜热链球菌的疑似菌落，而对大肠杆菌和金色葡萄球菌有抑制作用的就可以确定疑似菌落为确定的嗜热链球菌。

嗜热链球菌可于45℃生长。

( 3) 利用BCG牛乳培养基为分离培养基，采用涂布稀释分离的方法，从酸奶中成功分离出嗜热乳酸链球菌。

因在BCG牛乳培养基中有溴甲酚紫( 一种酸碱指示剂) ，因而其在BCG牛乳培养基上的菌落颜色为黄色，很容易与不产酸的杂菌分开，提高了分离效率。

利用该方法分离嗜热链球菌，菌落较大、菌落容易观察，极大地提高了分离效率．若无溴甲酚紫可用甲基红或石蕊代替，甲基红的变色范围是pH4.4~6.2,红—黄，石蕊是一种常用的酸碱指示剂，变色范围是pH=5.0-8.0之间红—蓝。

( 4 ) 采用常规的革兰氏染色、形态观察和发酵产物纸层析实验相结合的方法对分离到的菌株进行简单鉴定，该方法操作简单、快速、实验结果可靠．
实验材料：酸牛奶、酒精灯、接种环、高压灭菌锅、培养皿（10个）、锥形瓶（3个）、显微镜、试管（8个）、量筒500ml、滴
管,镊子、接种铲
实验试剂：革兰氏染色试剂、无菌水、金色葡萄球菌（或大肠杆菌）、NaCI 5g、牛肉膏3g、蛋白胨19g
BCG牛乳培养基:（A）溶液脱脂奶粉20g、水100ml、1.6%溴甲酚
紫乙醇溶液0.2ml（或甲基红、石蕊）、80℃灭菌
20min(B)溶液琼脂4g、酵母膏2g、水100ml、121℃
灭菌20min
基础培养基：（大肠杆菌培养）用牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl5g，琼脂15~20g，水1000ml
实验方法：
（1）配制培养基以无菌操作趁热将（A）（B）溶液混合均匀后倒10个平板
（2）培养方式：一般培养法
取5ml酸奶样品加入45ml无菌水中制成浓度为10-1的溶液，再从中取出0.5ml溶液加入到4.5ml水中制成浓度为10-2的溶液，以此类推，制的浓度为10-2，10-3，10-4，10-5的溶液，用涂布平板法将这五种浓度的细菌悬浮液分别转移到5个BCG牛乳培养基上，45℃的恒温箱中倒置培养48h
48h之后在BCG培养基上出现很多菌落，其中菌落周围培养基变成透明状，即为嗜热链球菌的疑似菌落（菌落特征：黄色或红色，扁平，边缘不整齐的菌落）
（3）纯培养
挑选培养基上的菌落，划线纯化2~3次，最后选择单菌落，经过镜检确认为纯种，得到7个菌株，4℃斜面保存。

将菌落平板和细胞形态
在镜检下用相机照出
(4) 液体培养
将纯培养之后的单菌落无菌操作至液体BCG培养基，与45℃摇床上培养24h
（5）鉴定方法
1．显微镜观察：①直接观察：链球状通常有2球体连接、3、4球体连接、5、6球体连接的，8球体以上连接的和单球体的少见，2．耐热性实验：将带有菌种的培养皿放入45℃的恒温箱中恒温培养2~3天，并观察结果。

3．菌种的革兰氏染色和形态观察用无菌接种环取一环菌均匀涂布在滴有无菌水的载玻片上，自然风干。

固定后进行革兰氏染色。

染色后用显微镜油镜进行观察。

菌体革兰氏染色为蓝紫色，革兰氏阳性革兰氏阳性。

菌体球形或卵圆形，排列成对或形成长短不等的链状。

4.抑制性实验：
①大肠杆菌培养：熬制大肠杆菌培养基（金色葡萄球菌），倒入3培养皿中，冷却后备用
②将灭菌后的镊子将无菌滤纸浸入嗜热链球菌提取液中，并在容器壁沥去多余的溶液，再将滤纸条贴在大肠杆菌培养基如图所示的位置，并如图所示，将金色葡萄球菌和大肠杆菌画线，同时制作一个空白对照试验，37℃倒置培养24h
注：滤纸条形状要规则，滤纸条上含有的溶液量不要太多，而且在贴滤纸时不要在培养基上拖动滤纸条，避免提取液在培养基中扩散时分
布的不均匀，同时注意划线接种时要尽量靠近滤纸条，但不要接触，避免将滤纸条上的提取液与菌种混合
观察大肠杆菌和金色葡萄球菌菌落是否受到抑制，收到抑制菌落直径大约是原来直径的30%（金色葡萄球菌受抑制的直径大约是原来的20%）
菌株的形态特点
参考文献
1．彭磊，司红丽．酸奶中嗜热链球菌初步分离与鉴定．现代农业科技[J]：2011年第15期
2．佟潇．酸奶中嗜热链球菌的分离和鉴定[M]．齐齐哈尔大学：2004
3．百度百科．嗜热链球菌
4．叶淑红，何连芳，张或等．乳酸菌的发酵条件及其对发酵胡萝卜汁风味的影响．食品科学[J]：2005年第26期
5．陈燕飞．几种中草药对细菌生长抑制作用的测定[J]．中国农学通报：2008年第24卷第23期102~105。