质粒DNA的小量制备
质粒DNA的提取与电泳鉴定_百替生物
质粒DNA的提取与电泳鉴定质粒DNA的提取是从事基因工程工作中的一项基本实验技术，但提取方法有很多种，以下介绍一种最常用的方法：碱裂解法：此方法适用于小量质粒DNA的提取，提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析。
方法如下：1、接1%含质粒的大肠杆菌细胞于2ml LB培养基。
2、37℃振荡培养过夜。
3、取1.5ml菌体于Ep管，以4000rpm离心3min，弃上清液。
4、加0.lml溶液I(1％葡萄糖，50mM/L EDTA pH8.0，25mM/L Tris-HCl pH8.0)充分混合。
5、加入0.2ml溶液II(0.2 mM/L NaOH，1％SDS)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。
6、加入0.15m1预冷溶液III(5 mol/L KAc，pH4.8)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。
7、以10，000rpm离心20min，取上清液于另一新Ep管8、加入等体积的异戊醇，混匀后于?0℃静置10min。
9、再以10，000rpm离心20min，弃上清。
10、用70％乙醇0．5ml洗涤一次，抽干所有液体。
11、待沉淀干燥后，溶于0．05mlTE缓冲液中煮沸法1、将1.5ml培养液倒入eppendorf管中,4℃下12000ｇ离心30秒。
2、弃上清，将管倒置于卫生纸上几分钟，使液体流尽。
3、将菌体沉淀悬浮于120ml STET溶液中, 涡旋混匀。
4、加入10ml新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml), 涡旋振荡3秒钟。
5、将eppendorf管放入沸水浴中,50秒后立即取出。
6、用微量离心机4℃下12000g离心10分钟。
7、用无菌牙签从eppendorf管中去除细菌碎片。
8、取20ml进行电泳检查。
质粒DNA的大量提取和纯化在制作酶谱、测定序列、制备探针等实验中需要高纯度、高浓度的质粒DNA,为此需要大量提取质粒DNA。
大量提取的质粒DNA一般需进一步纯化,常用柱层析法和氯化绝梯度离心法。
实验八质粒DNA的提取及琼脂糖凝胶电泳检测
当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复 pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两 条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准 确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此 已完全分开，复性就不会那么迅速而准确， 它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体 DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复 合物等一起沉淀下来而被除去。
2.简要叙述酚氯仿抽提ＤＮＡ体系后出现的现象及其成 因?
3.沉淀ＤＮＡ时为什么要用无水乙醇及在高盐、低温条 件下进行？
质粒3种构型
1.超螺旋的共价闭合环状质粒DNA(covalelltly closed circular DNA，简称cccDNA); 2.开环质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNA的一条链 断裂，(open circular DNA，简称ocDNA); 3.线形质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNA 两条链发 生断裂(linear DNA，简称LDNA)。
2. 琼脂糖凝胶电泳检测DNA
一、实验目的
通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测 DNA的方法和技术。
二、实验原理
DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子 筛效应。DNA分子在高于等电点的pH 溶液中带负 电荷，在电场中向正极移动。由于糖—磷酸骨架在 结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有 等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方 向移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速 度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构 型。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度 不一样，可进行分离。DNA分子的迁移速度与相对 分子质量的对数值成反比关系。
２．取1.4 ml培养液至Eppendorf管中，12000rpm离心30 秒，弃上清，取沉淀。
３．将细菌沉淀悬浮于100µl预冷溶液Ⅰ中，振荡混匀。 ４．加入200µl溶液Ⅱ，缓慢颠倒离心管，混匀（勿剧烈
质粒三种提取方法的比较(精)
（三）小量一步提取法
1.取0.5ml细菌过夜培养物，置1.5ml的Eppendolf管中 2.加入0.5ml的氯仿：异戊醇，用振荡器最大速度振荡1min， 充分混匀。 3.12000g，离心5min，取上清移至另一个Eppendolf管中， 加入500µl异丙醇混匀，立即12000g，离心5min。 4.弃上清，加入500µl70%乙醇漂洗沉淀，短暂离心。 5.弃上清，室温干燥沉淀2min，然后加入20μl无菌水溶解 DNA。
材料、设备及试剂
一ห้องสมุดไป่ตู้材料
含卡那酶素的E. coli DH5α，1.5ml塑料离心管(又称 eppendorf管), 离心管架。
二、设备
微量取液器(20μl,200μl,1000μl)， 台式高速离心机，恒 温振荡摇床， 高压蒸汽消毒器(灭菌锅)， 涡旋振荡器， 电 泳仪，琼脂糖平板电泳装置和 恒温水浴锅等。
[注意]
1. 提取过程应尽量保持低温。 2. 提取质粒DNA过程中除去蛋白很重要,采用酚/ 氯仿去除蛋白效果较单独用酚或氯仿好,要将蛋白尽量 除干净需多次抽提。 3. 沉淀DNA通常使用冰乙醇,在低温条件下放置时 间稍长可使DNA沉淀完全。沉淀DNA 可用异丙醇(一 般使用等体积), 无水乙醇（2-2.5倍体积），区别？。
DNA双链
变性 强碱 中性 复性 DNA单链
闭合环状的质粒DNA，在变性后不会 分离，复性快；
染色体线性DNA和或有缺口的质粒 DNA变性后双链分离，难以复性而形成 缠绕的结构，与蛋白质—SDS复合物结 合在一起，在离心的时候沉淀下去。
变性
煮沸法：
将细菌悬浮于含Triton X-100和能消化细胞壁 的溶菌酶缓冲液中，然后加热到100℃使其裂 解。加热除了破坏细胞壁外，还有助于解开 DNA链的碱基配对，并使蛋白质和染色体 DNA变性。但是，闭环质粒DNA彼此不会分 离，这是因为他们的磷酸二酯骨架具有互相 缠绕的拓扑结构，当温度下降后，闭环DNA 的碱基又各自就位，形成超螺旋分子，离心 除去变性的染色体核蛋白质，就可从上清中 回收质粒DNA
AxyPrep 质粒DNA 小量试剂盒
AxyPrep质粒DNA小量试剂盒本试剂盒采用改进的SDS碱裂解法，结合DNA制备膜选择性地吸附DNA的方法达到快速纯化质粒DNA的目的。
适合于从1-4 ml细菌培养物中提取多至20 μg高纯的质粒DNA，用于测序、体外转录与翻译、限制性内切酶消化、细菌转化等分子生物学实验。
一、试剂盒组成、贮存、稳定性说明书，耗材：DNA制备管，2 ml 离心管，1.5 ml 离心管。
RNase A：50 mg/ml，室温保存。
Buffer S1：细菌悬浮液。
加入RNase A后，4°C贮存。
Buffer S2：细菌裂解液，室温密闭贮存。
(若出现沉淀，应于37°C温浴溶解并冷却至室温后再使用。
）Buffer S3：中和液，室温密闭贮存。
Buffer W1：洗涤液，室温密闭贮存。
Buffer W2 concentrate：去盐液。
使用前，根据瓶上数量加入乙醇，混合均匀，室温密闭贮存。
可用100%乙醇或95%乙醇。
Eluent：2.5 mM Tris-HCl，pH 8.5，室温密闭贮存。
二、注意事项Buffer S2、Buffer S3和Buffer W1含刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套和眼镜，避免沾染皮肤、眼睛和衣服，谨防吸入口鼻。
若沾染皮肤、眼睛时，要立即用大量清水或生理盐水冲洗，必要时寻求医疗咨询。
三、实验准备1. 第一次使用前，RNase A全部加入Buffer S1 中，4°C贮存。
2. 准备无核酸和核酸酶污染的Tip头、离心管。
3. 第一次使用前，Buffer W2 concentrate中加入指定体积的无水乙醇。
四、操作步骤第一次使用时，将试剂盒携带的RNase A全部加入到Buffer S1 中，混合均匀，4°C保存。
1. 取1-4 ml 在LB培养基中培养过夜的菌液（若使用丰富培养基，菌液体积应减半或更少），12,000×g离心1 min，弃尽上清。
内蒙古大学基因工程大实验思考题
内蒙古大学基因工程大实验思考题本科生基因工程实验(记录及课后思考题)姓名:学号:专业:完成日期:2012年9月9日指导老师:一、质粒DNA的小量制备1.影响最终质粒产量的主要因素有哪些？①与菌的生长状况有关②和提取时的温度有关，需要低温③加溶液Ⅱ、Ⅲ时操作要温和④要用酚和氯仿的混合液多次抽提去除蛋白质⑤要用冰乙醇沉淀2.提取到的质粒纯度将直接影响到以后的酶切效果，如何操作才能尽可能的避免蛋白质的污染？加入酚：氯仿：异戊醇去除蛋白质，氯仿可使蛋白质变性并有助于液相与有机相的分离。
二、质粒DNA电泳鉴定1.泳道的质粒DNA有几条带？为什么？质粒可能会有超螺旋构型，环状构型和线性构型。
这三种构型中，迁移率最快的应该是超螺旋的，其次是线性和环状。
通常观察到的是超螺旋和环状质粒。
2.溴酚蓝的迁移率相当于多少bp的DNA？在0.7%、1%、1.4%、2%的琼脂糖凝胶电泳中，溴酚蓝的迁移率分别与1000bp、600bp、200bp、150bp的双链线性DNA片段大致相同3.影响本实验结果的因素有哪些？DNA的长度，结构，胶的浓度，电压等会对实验结果造成影响。
三、质粒DNA的酶切1.酶切反应混合物的体积是否对酶切效果有影响？为什么？有影响加入反应的酶体积不超过反应总体积的1/10，避免限制酶活性受到甘油的影响。
大多数限制酶贮存在50％甘油溶液中，以避免在-20℃条件下结冰。
2.如何估计DNA用量和酶的用量？DNA样品的浓度（μg / μl）:OD260×稀释倍数×50/10001U酶切割1ug的质粒，酶的量不要超过酶切体系的1/10。
3.在吸取内切酶的时候如何操作才能避免浪费？将枪头不要插入液体很深部位，刚过液面且可以吸取所需的体积的液体。
四、PCR扩增制备目的基因1.复性温度是根据什么确定的？可以根据公式：2（A + T）+ 4（C + G），再减5-10度,一般为55℃-60℃当50％的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度.Tm对于设定PCR 退火温度是必需的。
第九课 吸附柱法小量制备质粒DNA
二、试剂盒组成
1. RNase A 2. 溶液 P1 3. 溶液 P2 4. 溶液 P3 5. 溶液 P4 6. 去蛋白液 PE 7. 漂洗液 WB 8. 洗脱缓冲液 EB 9. 吸附柱 AC 10.收集管 （2ml）
三、实验步骤
取1.5ml菌液，12000rpm离心30秒。 尽可能去上清。 用250µl溶液P1重新彻底悬浮菌体。 加250µl溶液P2，温和地上下颠倒6次使溶液 混合，直到溶液变得清亮。室温反应时间不 超过5分钟。 5. 加400µl溶液P3，温和地上下颠倒6次使溶液 混合，室温放置5分钟。 6. 13000rpm离心10分钟。 1. 2. 3. 4.
三、实验步骤
15. 将吸附柱AC转移至一个干净的离心管中。 16. 打开AC管盖，室温放置3-5分钟，去除残留 乙醇。 17. 在吸附膜的中间部位加60µl洗脱缓冲液EB， 室温放置1分钟。 18. 13000rpm离心1分钟洗脱DNA。 19. 取5-10µl洗脱的DNA电泳，以检查质粒质量 及浓度。 20. -20℃保存。
dna一实验原理本试剂盒采用改进的sds碱裂解法裂解细胞离心吸附柱内的硅基质膜在高盐低ph值状态下选择性地结合质粒dna再通过去蛋白液和漂洗液将杂质去除最后用低盐高ph值的洗脱缓冲液将纯净的质粒dn 质粒DNA
一、实验原理
• 本试剂盒采用改进的SDS-碱裂解法裂解 细胞，离心吸附柱内的硅基质膜在高盐、 低PH值状态下选择性地结合质粒DNA， 再通过去蛋白液和漂洗液将杂质去除， 最后用低盐、高PH值的洗脱缓冲液将纯 净的质粒DNA从硅基质膜上洗脱下来。
四、注意事项
1. 所有步骤均在室温完成。 2. 第一次使用时，将试剂盒所带全部RNase A加 入溶液P1中，4℃保存。 3. 第一次使用前在漂洗液WB中按要求加入无水 乙醇，充分混匀。 4. 溶液使用后及时盖紧盖子，避免试剂长时间暴 露于空气中导致挥发、氧化、或PH值变化。 5. 溶液P3和去蛋白液PE中含刺激性化合物，操作 时要带手套，避免沾染。如沾染皮肤，要用大 量清水或生理盐水冲洗。 6. 洗脱液EB不含EDTA，不影响下游酶切、连接 等反应。也可以用水洗脱，但应确保PH大于 7.5。PH值过低影响洗脱效率。
质粒
1.3.3 凝胶的制备 以稀释的电极缓冲液为溶剂,用沸水浴或微波炉配制一定浓度的溶胶,灌入水 平胶框或垂直胶膜，插入梳子,自然冷却。
1.1.3 琼脂糖透明无紫外吸收,电泳过程和结果可直接用紫外光灯检 测及定量测定
1.1.4 电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定。制成干 膜可长期保存
.
1.2 DNA的琼脂糖凝胶电泳
核酸相对分子量质量及分子构型 凝胶的浓度
1.2.1 核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系
DNA分子的大小在凝胶中，DNA片段迁移距离（迁移率）与碱基对 的对数成反比，因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的 移动距离时行比较，便可测出未知片段的大小。但是当DNA分子大 小超过20kb时，普通琼脂糖凝胶就很难将它们分开。此时电泳的迁 移率不再依赖于分子大小，因此，就用琼脂糖凝胶电泳分离DNA时， 分子大小不宜超过此值。
载体(Vector)： 用于携带重组DNA，并且能够使外源DNA一起复制 与表达的质粒(运载工具)。
具备的条件： • 易于鉴定； • 在受体细胞中可以独立复制； • 易于筛选； • 易于导入受体细胞。
载体的结构：
1. 抗性基因（Antibiotic resistance gene,such as Ampicillin resistance gene, Kanamycine resistance gene)
1.4 结果分析
1.4 结果分析
1.DNA 相对分子量标准物（marker); 2.pUC19 质粒 DNA 经EcoRⅠ 完全酶切； 3.pUC19 质粒 DNA 经EcoRⅠ 部分酶切； 4.自提pUC19 质粒 DNA （此效果提得较好，为1带，以超螺旋质粒DNA 为主。有时是3条带，分别为超螺旋质粒，线状质粒和开环质粒。还有时 结果为2条带）
质粒小提步骤
质粒小提（AxyPrep质粒DNA小量试剂盒）本试剂盒采用改进的SDS碱裂解法，结合DNA制备膜选择性地吸附DNA的方法达到快速纯化质粒DNA的目的。
适合从1-4ml细菌培养物中提取多至20ug高纯度的质粒DNA，用于测序、体外转录与翻译、限制性内切酶消化、细菌转化等分子生物学实验。
一、试剂盒组成、贮存、稳定性Rnase A:50mg/ml,室温可贮存6个月，长期贮存于-20℃。
Buffer S1：细菌悬浮液。
加入Rnase A后，混合均匀，4℃贮存。
Buffer S2：细菌裂解液（含SDS/NaOH），室温密闭贮存。
Buffer S3：中和液，室温密闭贮存。
Buffer W1：洗涤液，室温密闭贮存。
Buffer W2 concentrate：去盐液。
使用前，按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇（可用100%乙醇或95%乙醇）。
混合均匀，室温密闭贮存。
Eluent：洗涤液，室温密闭贮存。
二、注意事项Buffer S2、Buffer S3和Buffer W1含刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套和眼镜，避免沾染皮肤、眼睛和衣服，谨防吸入口鼻。
若沾染皮肤、眼睛时，要立即用大量清水或生理盐水冲洗，必要时寻求医疗咨询。
三、实验准备1、第一次使用前，Rnase A全部加入Buffer S1中，4℃贮存。
2、准备无核酸和核酸酶污染的Tip头、离心管。
3、第一次使用前，Buffer W2 concentrate 中加入指定体积的无水乙醇。
4、使用前，检查Buffer S2是否出现沉淀，应于37℃温浴加热溶解并冷却至室温后再使用。
四、操作步骤1、取1-4ml在LB培养基中培养过夜的菌液（若使用丰富培养基，菌液体积应减半或更少），12000*g离心1min，弃尽上清。
2、加250ul Buffer S1悬浮细菌沉淀，悬浮需均匀，不应留有小的菌块。
*确认Buffer S1中已加入Rnase A3、加250ul Buffer S2，温和并充分的上下翻转4-6次混合均匀使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液。
质粒dna的提取方法
质粒dna的提取方法质粒DNA提取是分子生物学实验中非常常见的操作，用于从细菌中提取质粒DNA进行后续的实验分析。
下面我将介绍一种常用的质粒DNA提取方法——碱裂解法（alkaline lysis method），该方法简单、快速、成本低且适用于大规模提取。
实验原理：碱裂解法是利用碱性溶液来破坏细菌细胞壁和细胞膜，释放出其中的质粒DNA。
在碱性条件下，细菌细胞壁和细胞膜会被溶解，质粒DNA则在此过程中被保护在碱性溶液中。
接着，通过中和和沉淀步骤，可从碱性溶液中纯化出质粒DNA。
实验步骤：1. 首先，从含有目标质粒的细菌培养物中制备菌液。
将培养物转移到离心管中，以12000 rpm离心10分钟。
2. 弃去上清液，将菌体沉淀重悬于缓冲液中。
缓冲液的配制：用10 mM Tris-HCl缓冲溶液溶解10 mM EDTA（pH 8.0），并加入0.1 mg/mL的蛋白酶K。
3. 加入缓冲液至菌体重悬菌液中，混匀。
4. 加入等量的0.2 M NaOH-1% SDS（含SDS版本）或0.2 M NaOH-0.5% SDS （不含SDS版本），轻轻翻转混匀。
5. 在室温下孵育5-10分钟，将混合物中的碱裂解酶活化。
6. 加入等体积的3 M醋酸钠（pH 5.5）以中和混合物。
7. 在室温下孵育5-10分钟，使沉淀物凝结。
8. 离心上述混合物，12000 rpm，10分钟。
9. 弃去上清液，加入适量的75%乙醇洗涤沉淀。
10. 再次离心，弃去上清液。
11. 干燥质粒DNA沉淀，通常可以在室温下自然干燥，不要使用高温或吹风机等加热工具。
12. 使用适量的Tris-EDTA缓冲液（pH 8.0）溶解质粒DNA沉淀，以得到浓度适宜的质粒DNA溶液。
实验注意事项：1. 在实验操作过程中，尽量避免使用手部直接接触NaOH和SDS，以免引起刺激。
2. 防止质粒DNA受到外源DNA（例如基因组DNA）的污染，可在处理前使用DNase酶或RNase酶处理样品。
质粒DNA的小量提取及DNA琼脂糖凝胶电泳实验报告
质粒DNA的小量提取及DNA琼脂糖凝胶电泳一、前言质粒质粒是附加到细胞中的非细胞的染色体或核区DNA原有的能够自主复制的较小的DNA分子(即细胞附殖粒、又胞附殖粒)。
大部分的质粒虽然都是环状构型，它存在于许多细菌以及酵母菌等生物（多为原核生物）中，乃至于植物的线粒体等胞器中。
然而，1984年，在Streptomyces coelicoler(天蓝色链霉菌)等放线菌以及在Borrelia hermsii(赫氏蜱疏螺旋体)等原核生物中，又相继发现线形质粒。
天然质粒的DNA长度从数千碱基对至数十万碱基对都有。
质粒天然存在于这些生物里面，有时候一个细胞里面可以同时有一种乃至于数种的质粒同时存在。
质粒的套数在细胞里从单一到数千都有可能。
有时有些质粒含有某种抗药基因(如大肠杆菌中就有含有抗四环素基因的质粒)。
有一些质粒携带的基因则可以赋予细胞额外的生理代谢能力，乃至于在一些细菌中提高它的致病力。
一般来说，质粒的存在与否对宿主细胞生存没有决定性的作用。
它是基因工程最常见的运载体。
质粒在细胞内的复制一般有两种类型:紧密控制型和松弛控制型。
前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，当染色体不复制时，它也不能复制，通常每个细胞内只含有一个或几个质粒分子，如F因子。
后者的质粒在整个细胞周期中随时可以复制，在每个细胞中有许多拷贝，一般在20个以上，如Col E1质粒。
在使用蛋白质合成抑制剂-氯霉素时，细胞内蛋白质合成、染色体DNA复制和细胞分裂均受到抑制，紧密型质粒复制停止，而松弛型质粒继续复制，质粒拷贝数可由原来20多个扩增至1000-3000个，此时质粒DNA占总DNA的含量可由原来的2%增加至40-50%。
把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术，送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体。
细菌质粒是重组DNA 技术中常用的载体。
质粒分子本身是含有复制功能的遗传结构。
质粒还带有某些遗传信息，所以会赋予宿主细胞一些遗传性状。
实验一 质粒DNA的小量制备
实验一质粒DNA的小量制备（碱裂解法）实验步骤：1.取1.5ml培养物于EP管中，13000 rpm离心1min集菌，去上清；2.加入100μL预冷的溶液Ⅰ，振荡器剧烈振荡，使菌体悬浮；3.加入200uL现配制的溶液Ⅱ，盖紧管口，迅速柔和颠倒数次以保证混合液与整个管内壁充分接触，冰浴3-5min（整个过程不能超过5min）盖管口，迅速柔和颠倒数次以保证混合液与整个管内壁充分接触，冰浴3-5min（不能超过5min）；4.加入150uL的溶液Ⅲ，温和颠倒数次以混合均匀，冰浴 10min；5.13000rpm离心10min，取上清于另一离心管。
6.加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25:24:1），温和振荡；7.13000rpm离心15min，将上清移至另一离心管内；8.加入等体积的氯仿：异戊醇（24:1），温和振荡；9.13000rpm离心15min，将上清移至另一离心管内；10.加入两倍体积的无水乙醇（-20℃预冷），混合均匀后置于-20℃15-30min， 13000rpm离心15min去上清；11.用70%乙醇洗一次，13000rpm离心5min，弃上清，将离心管倒置，室温干燥5-10min。
12.用20－30uL TE缓冲液（含RNA酶20ug/ml）溶解。
-20℃保存.13.取少量溶液稀释后分别在紫外分光光计上测OD260及OD280吸光值，计算DNA浓度，并做琼脂糖凝胶电泳分析。
分装后-20℃保存备用。
主要试剂：溶液Ⅰ：50 mmol/L 葡萄糖25 mmol/L Tris-HCL(pH8.0)10 mmol/L EDTA((pH8.0)溶液Ⅱ：0.2mol/L NaOH1% SDS溶液Ⅲ： 3 mol/L 乙酸钾2 mol/L醋酸TE 缓冲液：10mmol/L Tris pH 8.01 mmol/L EDTA pH 8.0 高压灭菌结果1.图示质粒DNA电泳结果，并分析之。
2.计算制备的质粒DNA的含量。
质粒提取
质粒DNA小量制备1、实验准备：1）、仪器：台式微量高速离心机、水浴锅2）、试剂：天根离心柱型质粒小提试剂盒、菌液（过夜）3）、器材：1000ul、200ul移液枪及枪头（枪头高压处理）、1.5mlEP 管、双面板、计时器、记号笔2、试验流程1）、含质粒菌液制备第一天菌种复苏A、准备：甘油菌、LB（kana+）平板、酒精灯、打火机、接种环、标记笔B、操作：取-800C 保存的甘油菌种，用灭菌的接种环刮拭冻结的培养物表面，立即将粘附在接种环上的细菌划在LB 平板平面，将冻结的培养物放回-800C 保存，平板于370C 培养过夜（12~16h）第二天增菌A、准备：含有单克隆菌落的LB 平板、5ml LB 菌液、酒精灯、打火机、接种环、标记笔B、操作：a）、5ml LB 菌液+ 5ul kana(50mg/ml)；b）、挑取单克隆接种于LB 液中；c）、180rpm, 370C, 12~16h 振荡培养注意：细菌复苏非常重要，如果细菌生长不好，可再次将5ul 菌液接种于3-5ml 培养基中，震荡培养过夜。
第三天质粒提取（参考试剂盒说明书）1、柱平衡操作：向吸附柱CP3中（吸附柱置于收集管中），加入500ul 平衡液BL，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中。
2、取1~5ml过夜菌液，加入离心管中，12000rpm离心1min，到掉上清液。
（菌液较多时，可通过多次离心将菌体沉淀全部收集到一个离心管中）3、向留有菌体沉淀的离心管中加入250ul的溶液P1，（请检查是否已加入RNaseA），使用漩涡振荡器或移液枪彻底混匀细菌沉淀。
4、向离心管中加入250ul的溶液P2，温和地上下翻转6~8次，使菌体裂解。
5、向离心管中加入350ul的溶液P3，立即温和的上下翻转6~8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀，12000rpm离心10min，此时在离心管底部形成沉淀。
6、将上一步收集的上清液用移液枪转移至吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中），注意不要吸出沉淀，12000rpm离心30~60S（一般取45S），倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3重新放入收集管中。
质粒DNA的小量制备
质粒DNA的小量制备[摘要] 从大肠杆菌中抽提质粒dna的方法很多，可以在实验中根据不同的需要采用不同的方法，碱变性法因其抽提效果好，收得率高，因而被各实验室广泛采用。
[关键词] 质粒dna 碱裂解法快速提取（一）实验目的及原理从大肠杆菌中抽提质粒dna的方法很多，可以在实验中根据不同的需要采用不同的方法，碱变性法因其抽提效果好，收得率高，获得的dna可用于酶切、连接与转化，因而被各实验室广泛采用。
（二）试剂与器材1.器材：微量移液器、1.5ml离心管、各种移液器头、台式高速离心机、高压灭菌锅、冰块2.试剂：（1）溶液ⅰ：50mmol/l葡萄糖、10mmol/l edta，20mmol/l 25mmtris-hcl ph8.0。
（2）溶液ⅱ：0.4mol/l naoh（临用前用10mol/l naoh贮存液现用现稀解），2%sds sds（十二烷基硫酸纳）10％母液的配制。
（3）溶液ⅲ：60ml 5mol/l 醋酸钾，5ml冰醋酸，28.5ml h2o。
（4）te缓冲液：10mmol/l tris-hcl, 1mmol/l edta（ph8.0）。
（5）100%乙醇，70％乙醇。
（6）上样缓冲液(6×)：0.25% 溴酚兰，40％(w/v)蔗糖水溶液或30％的甘油。
（7）5×tris-硼酸（tbe）缓冲液。
（8）5×tris-乙酸（tae）缓冲液。
3.材料：（1）含puc系列质粒的大肠杆菌；（2）琼脂糖。
（三）实验步骤1.质粒dna的小量提取。
(1)取四支1.5ml离心管，编号为1、2、3、4。
用加样枪加各个溶液。
(2)分别吸取200μl培养液加入这四个离心管中，在离心机（12 000r/min）离心10min，弃上清液，收集菌体。
(3)在1、2、3号分别加入200μl溶液ⅰ，4号加入用等量蒸馏水代替，在快速混匀器上使菌体均匀悬浮。
(4)在1、2、4号加入200μl溶液ii，在3号加入（未加naoh，只加了sds）的溶液ii轻柔颠倒混匀。
质粒DNA的小量提取DNA琼脂糖凝胶电泳实验报告
质粒DNA的小量提取及DNA琼脂糖凝胶电泳一、前言质粒质粒是附加到细胞中的非细胞的或核区原有的能够自主复制的较小的DNA分子(即细胞附殖粒、又胞附殖粒)。
大部分的质粒虽然都是环状构型，它存在于许多细菌以及酵母菌等生物（多为）中，乃至于植物的等胞器中。
然而，1984年，在Streptomyces coelicoler()等以及在Borrelia hermsii(赫氏蜱疏螺旋体)等原核生物中，又相继发现线形质粒。
天然质粒的DNA长度从数千碱基对至数十万碱基对都有。
质粒天然存在于这些生物里面，有时候一个细胞里面可以同时有一种乃至于数种的质粒同时存在。
质粒的套数在细胞里从单一到数千都有可能。
有时有些质粒含有某种抗药基因(如大肠杆菌中就有含有抗基因的质粒)。
有一些质粒携带的基因则可以赋予细胞额外的生理代谢能力，乃至于在一些细菌中提高它的致病力。
一般来说，质粒的存在与否对宿主细胞生存没有决定性的作用。
它是基因工程最常见的运载体。
质粒在细胞内的复制一般有两种类型:紧密控制型和松弛控制型。
前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，当染色体不复制时，它也不能复制，通常每个细胞内只含有一个或几个质粒分子，如F因子。
后者的质粒在整个细胞周期中随时可以复制，在每个细胞中有许多拷贝，一般在20个以上，如Col E1质粒。
在使用蛋白质合成抑制剂-氯霉素时，细胞内蛋白质合成、染色体DNA复制和细胞分裂均受到抑制，紧密型质粒复制停止，而继续复制，可由原来20多个扩增至1000-3000个，此时质粒DNA占总DNA的含量可由原来的2%增加至40-50%。
把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术，送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体。
细菌质粒是重组DNA 技术中常用的载体。
质粒分子本身是含有复制功能的遗传结构。
质粒还带有某些遗传信息，所以会赋予宿主细胞一些遗传性状。
其自我复制能力及所携带的遗传信息在重组DNA操作，如扩增、筛选过程中都是极为有用的。
质粒DNA的提取与酶切鉴定 (2)
4、加入200L新配制的溶液II, 盖紧管口,快速颠倒离心管, 以混匀 内容物,冰上放置3－5min;
溶液II中的NaOH与SDS可裂解细胞，使DNA变性以及SDS使蛋白变 性并形成交联的网状结构
5、加入150l溶液III, 加盖后颠倒6-7次混匀，冰上放置2～3min； 溶液III为低pH的醋酸钾缓冲液，中和NaOH，以便使部分变性的闭环
质粒复性，而细菌染色体DNA不能正确复性
6、12000 g离心6 min，将上清移入另一干净的Ep管中； 7、加2倍上清体积(约1mL)的无水乙醇, 振荡混匀，室温放 置2min. 8、12000g离心10min，弃上清液，再用70％的乙醇洗涤 一次， 12000g离心1min，离心管倒置于吸水纸上扣干， 然后在中空浓缩系统上干燥质粒； 9、加入40L含50 g/mL RNase A的灭菌蒸馏水或TE 缓 冲液溶解提取物，室温放置直到质粒完全溶解(约8min)， 存于－20℃或直接用于酶切。
其基本特点如下：
(1)、专一性地识别并切割特定的核苷酸序列，如EcoR I识别与
切割序列为
5`····GAATTC····3`
3`····CTTAAG····5`
(2)、识别的核苷酸数目大多数为4～6个，少数识别8～13个；
(3)、识别序列大多数为二重对称（回文序列），大多数酶产生
的是具有凸出的粘性末端：
四、碱裂解法小量制备质粒DNA
1、挑取转化筛选的带有目的质粒的大肠杆菌接种到液体培养基 中，37℃震荡培养12～16小时；
2、将1.5mL菌液加入Ep离心管中，12000 g离心30 Sec，弃上清液， 在吸水纸上扣干； 离心时间不能太长，以免影响下一步的菌体悬浮
3、加入100L预冷的溶液I ，于涡旋振荡器上振荡悬浮细菌细胞， 尽量使细胞分散； 溶液I中的葡萄糖的作用是增大让一让的粘度，减少提取过程 中的机械剪切力，防止染色体DNA 的断裂；EDTA的作用是与 二价离子（Ca2＋）结合，降低DNase对DNA的降解
质粒DNA的小量制备
质粒DNA的小量制备1.收获1）将2ml含相应抗生素的LB（10ml5xLB+40mlH2O+50ul氨苄）加入到标记好的15ml并通气良好（不盖紧）的试管中，然后接入一单菌落，于37度恒温箱振荡培养过夜。
2）将培养好色泽浑浊的培养物倒入标记好的微量离心管中，用离心机在室温以13000g离心1min。
3）吸取培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。
（除去上清的最简便方法是用一次性的吸头接触液面轻缓吸取。
尽可能使吸头远离细菌沉淀）2.裂解1）在细菌沉淀上先加入250ul 冰箱保存的solution1，剧烈振荡（在微量离心管里加一根牙签，再在震荡机上使细菌沉淀迅速分散）（50mmol/L葡萄糖,25mmol/L Tris.Cl,10mmol/L EDTA）2）然后加入250ul新配制solution2 盖紧管口，温和颠倒离心管5次，以混合内容物。
（应确保离心管整个内表面均与溶液接触）（0.2mol/L NaOH,1%SDS）3）加入350ul solution3盖紧管口，温和倒置振荡10秒钟，使粘稠的细菌裂解物分散均匀（5mol/L乙酸钾60ml,冰乙酸11.5ml,水28.5ml）4）再用离心机20000g离心10min，将上清液转移到标记好的2ml收集管中。
5）把收集管离心过柱1min后，倒掉滤液，再加500ul HBC Buffer清洗，离心1min倒掉滤液6）再用700ul DNA Wash Buffer清洗过柱离心1min倒掉滤液，重复2次。
7）再空离心2min后，将收集管过到新标记好的微量离心管·中，打开挥干2min8）最后再加入30-50ul 预热好的Elution Buffer溶解1min后，再离心机13000g离心1min 后，去掉收集柱，保留溶解液。
细菌质粒提取原理及步骤
质粒提取原理及步骤一、导论已经提出过许多方法用于从细菌中提纯质粒DNA，这些方法都含有以下3个步骤：1. 细菌培养物的生长。
2. 细菌的收获和裂解3. 质粒DNA的纯化。
（一）细菌培养物的生长从琼脂平板上挑取一个单菌落，接种到培养物中(有含有行当抗生素的液体培养基中生长)，然后从中纯化质粒，质粒的提纯几乎总是如此。
现在使用的许多质粒载体（如pUC系列）都能复制到很高的拷贝数，惟致只要将培养物放在标准LB 培养基中生长到对数晚期，就可以大量提纯质粒。
此时，不必造反性地扩增质粒DNA。
然而，较长一代的载体(如pB R322)由于不能如此自由地复制，所以需要在得到部分生长的细菌培养物中加入氯霉素继续培养若干小时，以便对质粒进行性扩增。
氯霉素可抑制宿主的蛋白质合成，结果阻止了细菌染色体的复制，然而，松弛型质粒仍可继续复制，在若干小时内，其拷贝数持续递增。
这样，像pBR３２２－类的质粒，从经氯霉素处理和未经处理的培养物中提取质粒的产量迥然不同，前者大为增高。
多年来，加入足以完全抑制蛋白质合成的氯霉素μg/ml)已成为标准的操作、用该方法提取的质粒DNA量，对于分子克隆中几乎所有想象到的工作任务。
（二）细菌的收获和裂解细菌的收获可通过离心来进行，而细菌的裂解则可以采用多种方法中的任意一种，这些方法包括用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理等。
选择哪一种方法取决于３个因素：质粒的大小、小肠杆菌菌株及裂解后用于纯化质粒DNA的技术。
尽管针对质粒和宿主的每一种组合分别提出精确的裂解条件不切实际，但仍可据下述一般准则来选择适当方法，以取得满意的结果。
1)大质粒(大于15kb)容易受损，故应采用漫和裂解法从细胞中释放出来。
将细菌悬于蔗糖等渗溶液中，然后用溶菌酶和EDTA进生处理，破坏细胞壁和细胞外膜，再加入SDS一类去污剂溶解球形体。
这种方法最大限度地减小了从具有正压的细菌内部把质粒释放出来所需要的作用力。
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一 实验原理
什么是质粒？
质粒是细胞内的一种环状的小分子DNA，是 进行DNA重组的常用载体。作为一个具有自 身复制起点的复制单位独立于细胞的主染色 体之外，质粒DNA上携带了部分的基因信息， 经过基因表达后使其宿主细胞表现相应的性 状。在DNA重组中，质粒或经过改造后的质 粒载体可通过连接外源基因构成重组体。
三 实验准备
4 70%乙醇（-20C保存）， 5 TE buffer（10mmol/L Tris HCl pH8.0， 1mmol/L EDTA pH8.0）； 6 摇菌试管洗净并盖上棉花塞、1.5ml离 心管装入铝制饭盒、移液器吸头装入相 应的吸头盒，一起高压灭菌（121C 30min）。
四 操作步骤
10 离心管倒置于37C培养箱中（或室温）空 气干燥10分钟。。（管底的沉淀质粒DNA用 肉眼几乎看不见！）。 11 每管加入10LTE缓冲液混匀后收集到一 个管中，涡旋混合器上混匀，在离心机中瞬 时转一下，使溶液集中在管底。待电泳确认， 用记号笔标记后放入冰箱中备用。 12 在剩余的菌液中倒入少许84消毒液，待溶 液变清亮后随废液和剩余的冰块一起倒入下 水池。清理桌面，清洗仪器，撰写实验报告
四 操作步骤
4在沉淀中加入用冰预冷的100l 溶液I，盖上盖后立 即在涡旋混合器上混匀，室温下静置5min。（等待 的同时，取一个塑料盒，装上适量的冰块备用。） 须确使细菌沉淀在溶液Ｉ中完全分散，将两个微量 离心管的管底部互相接触震荡，可使沉淀迅速分散。
5加入200l 溶液II，盖紧管口，快速颠倒离心管５次， 以混合内容物。应确保离心管的整个内表面均与溶 液Ⅱ接触。不要振荡，插入冰中，放置5min。 6 加入用冰预冷的150l 溶液III，盖上盖后上下颠倒 几次混匀，插入冰中，放置5min。
一 实验原理
根据共价闭合环状质粒DNA与线性DNA在拓 扑学上的差异来分离。 在pH12.012.5这个狭窄的范围内，线性DNA 双螺旋结构解开而被变性。 当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液使pH恢复中 性时，共价闭合环状质粒DNA复性快，而线 性的染色体DNA复性缓慢，经过离心与蛋白 质和大分子RNA一起沉淀下去。
一 实验原理
分离质粒DNA有三个步骤： 培养细菌使质粒扩增， 收集和裂解细菌， 分离和纯化质粒DNA。
一 实验原理
在质粒提取过程中，由于机械力、酸碱度、试剂等 的原因，可能使质粒DNA链发生断裂。所以，多 数质粒粗提取物中含有三种构型的质粒： 共价闭合环状DNA（cccDNA）： 质粒的两条链没有 断裂； 超螺旋开环DNA（ocDNA）： 质粒的一条链断裂； 松弛的环状分子线形DNA（lDNA）： 质粒的两条链 均断裂；
五 思考题
影响本实验结果的因素有哪些？
四 操作步骤
1 在超净工作台中取5ml LB（Amp+），加入 灭菌的摇菌管中。 2 取出保存pGEX-6p载体的菌种, 在超净工作 台上用烧红的接种环刮一下，再把接种环于 5ml无菌LB培养液（含100ug/ml氨苄青霉素） 中搅拌一下，37C摇床中摇20h。 3取1.5ml的菌液于1.5ml离心管中，12000 rpm 离心1min，弃上清液（尽量弃干净），留沉 淀备用。
二 实验试剂
-6p质粒载体菌, LB培养基1000ml（含100ug/ml氨苄青霉素）， 葡萄糖/Tris/EDTA(GTE)溶液（溶液 I）， NaOH/SDS溶液(溶液 II)，KAc溶液（pH4.8） (溶液 III)， RNase A， 95%乙醇，70%乙醇， TE buffer（pH8.0）。
四 操作步骤
7 12000 rpm离心5min，小心吸取400l 上清液于另 一个干净的1.5ml离心管中，（不要将白色沉淀物带 入！），加入800l 95% 乙醇，盖上盖后立即在涡旋 混合器上混匀，室温下静置5min。 8 12000 rpm离心10 min，小心弃掉上清液，加入 500l 70% 乙醇，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀。 12000 rpm离心10 min，小心弃掉上清液，尽量倒置 弃干净, 9 再加入500l 70% 乙醇，盖上盖后立即在涡旋混合 器上混匀。12000 rpm离心10 min，小心弃掉上清液， 尽量倒置弃干净，可将离心管倒置于一张纸巾上， 以使所有液体流出。
三 实验准备
3溶液I（50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris HCl pH8.0，10mmol/L EDTA pH8.0）； 溶液Ｉ可成批配制，每瓶约100ml,在 10lbf/in2(6.895¡ 104Pa) 高压下蒸气灭菌15分钟， 贮存于4℃。 溶液II（0.2mol/L NaOH，1% SDS）； 溶液III（60mL 5mol/L Kac，加冰乙酸调pH4.8， 补dd water至100ml），
三 实验准备
1 氨苄青霉素储存液（无菌水配制 5mg/ml，分装后-20C保存），
2 配制LB培养基 （胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g加200mL dd water 搅拌完全溶解，用 约200L 5N NaOH调pH至7.0，加dd water至1L，121C 20min灭菌）；